Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1 Особенности биологии эхинококкозов сельскохозяйственных животных . 9
1.2 Распространение и особенности эпизоотологии эхинококкоза сельскохозяйственных животных . .14
1.3 Патогенез гидатидного эхинококкоза и изменения, вызываемые им в организме хозяин 20
1.4 Меры борьбы при гидатидном эхинококкозе сельскохозяйственных животных .24
1.5 Экономический ущерб, причиняемый гидатидным эхинококкозом сельскохозяйственных животных . 25
Выводы . 26
2. Материалы и методы исследований . 28
3. Результаты исследований 32
3.1 Распространение и особенности эпизоотологии гидатидного эхинококкоза на территории Краснодарского края 32
3.1.1 Мониторинг эпизоотической ситуации по основным гельминтозам, регистрируемым в регионе 32
3.1.2 Особенности эпизоотологии гидатидного эхинококкоза сельскохозяйственных животных в Краснодарском крае . 38
Выводы. ... 41
3.2 Источники, пути и факторы передачи эхинококкозной инвазии 41
Выводы. ... 49
3.3 Изменения качественного и количественного состава продуктов убоя крупного рогатого скота при гидатидном эхинококкозе . 50
3.3.1 Общий послеубойный осмотр туш и внутренних органов 50
3.3.2 Органолептические и физико-химические показатели продуктов убоя . 52
3.3.3 Динамика количества связанных и свободных аминокислот в органах и тканях крупного рогатого скота при гидатидном эхинококкозе . . 56
3.3.4 Динамика содержания летучих органических веществ в органах и тканях крупного рогатого скота при гидатидном эхинококкозе . 59
Выводы . 62
3.4 Токсикологическая и биологическая оценка продуктов убоя, полученных от животных, инвазированных ларвальной формой эхинококкоза 63
3.4.1 Изучение токсикологического и биологического воздействия продуктов убоя, полученных от животных, инвазированных ларвальной формой эхинококкоза, на организм простейших . 63
3.4.1.1 Оценка биологической активности гидатидной жидкости . 66
3.4.1.2 Оценка биологической активности экстракта печени, инвазированной Echinococcus granulosus . 68
а) Экспресс-оценка биологической активности . 68
б) Оценка биологической активности методом разрешающего воздействия 70
в) Оценка биологического воздействия на регенераторную способность клетки . 72
Выводы . 75
3.4.2 Изучение токсикологического и биологического воздействия продуктов убоя, полученных от животных, инвазированных ларвальной формой эхинококкоза, на организм лабораторных животных
Выводы. ...
Заключение .
Выводы
Предложения производству
Список литературы .
Приложения .
- Распространение и особенности эпизоотологии эхинококкоза сельскохозяйственных животных
- Мониторинг эпизоотической ситуации по основным гельминтозам, регистрируемым в регионе
- Динамика содержания летучих органических веществ в органах и тканях крупного рогатого скота при гидатидном эхинококкозе
- Оценка биологического воздействия на регенераторную способность клетки
Введение к работе
Актуальность работы. Эхинококкозы - хронически протекающие гельминтозы, характеризующиеся деструктивными поражениями печени, лёгких и других органов, аллергизацией организма и тяжёлыми осложнениями, нередко приводящими к инвалидности и смертности. Существуют затруднения в ранней диагностике, оперативные вмешательства осуществляются в запущенных стадиях, имеются определённые трудности в проведении комплексных профилактических мероприятий, которые связаны с серьёзными экономическими проблемами. ВОЗ и Международное Эпизоотическое Бюро включили эхинококкоз в список болезней, подлежащих радикальному искоренению (J. Eckert et al., 2001; Алиев М.А., 1999). В ряде стран (Новая Зеландия, Аргентина, Греция, Турция, Испания, Италия и др.), для которых гидатидозный эхинококкоз является краевой патологией, его ликвидация возведена в ранг государственной задачи, разрабатываются специальные национальные программы по контролю и предотвращению заболевания. Благодаря таким программам в ряде ранее неблагополучных по эхинококкозу стран (Исландия, Норвегия, Австралия, Тасмания) болезнь практически искоренена (P. R. Torgerson, С. М. Budke, 2003). Эхинококкоз не только вредит здоровью животных и человека, но и наносит экономический ущерб, и поэтому продолжает оставаться важной государственной проблемой (Андреянов О.Н., Горохов В.В., Сафиуллин Р.Т., 2009; Архипов И.А., Зубов А.В., Борзунов Е.Н., Михин А.Г., 2009; Багаева У.В., Бочарова М.М., Коцлов Т.Г., 2010; Бессонов А. С, 2001; Биттиров A.M., Шихалиева М.А., 2003; Вибе П.П., 1959; Сапунов А.Я., 1978;Сенченко Б.С, 2001; Aminjanov М., Rasulov Sh., Aminjanov Sh., 2003; Mandell G.L., Douglas R.G., Bennett J.E., 2000; Rhoads M.L., Murrell K.D., Dilling G.W., Wong W.M., Z., Baker N.F., 1985; Rickard M.D., 1978, 1989; Zhu X.Q., Dou L.Q., Shi X.H., Sun X.Q., Wang X.H., Niu B.H., 1991).
Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы состояла в оценке качества и безопасности продуктов убоя при эхинококкозе сельскохозяйственных животных.
Для достижения указанной цели, к решению были поставлены следующие основные задачи:
Изучить эпизоотическую ситуацию по гидатидному эхинококкозу в условиях Краснодарского края.
Определить изменения качественного и количественного состава органов и тканей сельскохозяйственных животных при гидатидном эхинококкозе.
Провести токсикологическую и биологическую оценку продуктов убоя, полученных от животных больных ларвальной формой эхинококкоза, на лабораторных животных и простейших.
Исследования выполнены в соответствии с государственной темой 08.05.02, с номером государственной регистрации
15070.7703052541.06.8.002.3.
Научная новизна. Изучена эпизоотическая ситуация по гельминтозооантропонозным заболеваниям, регистрируемым на территории Краснодарского края. Определены качественные и количественные изменения в органах и тканях сельскохозяйственных животных, происходящие в условиях инвазии гидатидным эхинококком. С помощью экспериментальной модели изучено и описано влияние продуктов метаболизма личинок эхинококка на клетку и организм животных.
Практическая значимость работы. Проведены научные исследования по выяснению эпизоотологии гидатидного эхинококкоза сельскохозяйственных животных, выяснены основные факторы передачи и распространения инвазии. Предложены способы улучшения качества производимой сельскохозяйственной продукции.
Это позволило осуществить и утвердить в установленном порядке следующие разработки: - Ветеринарно-санитарный контроль качества и безопасности продовольственного сырья в Северо-Западном регионе Кавказа («Методические рекомендации», 2010) - Эхинококкоз сельскохозяйственных и домашних плотоядных животных в Северо-Западном регионе Кавказа («Рекомендации», 2011).
Материалы экспериментальных исследований нашей диссертационной работы используются при проведении лекционных и практических занятий на курсах повышения квалификации Краснодарского института агробизнеса, а также при проведении тематических семинаров-совещаний с целью повышения уровня квалификации ветспециалистов учреждений госветсети, акционерных сельскохозяйственных предприятий, занимающихся ветеринарным обслуживанием продуктивных сельхозживотных.
Апробация результатов исследования. Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на: заседаниях учёного совета Краснодарского НИВИ по итогам НИР за 2008-2011 гг.; научных конференциях: «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями», ВИГИС 2008-2011 гг.; международной научно-практической конференции, посвященной 35-летию образования факультета ветеринарной медицины, Краснодар, 2009;
IV Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных, КубГАУ. - 2010; международной научно-практической конференции, посвященной 65-летию ветеринарной науки Кубани, КНИВИ РАСХН. - 2011.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 работ, в том числе 3 в изданиях, рекомендованных ВАК; 2 рекомендации, рассмотренные и одобренные на заседании секции «Инвазионные болезни животных» отделения ветеринарной медицины РАСХН.
Основные положения, выносимые на защиту:
Эпизоотическая ситуация по гидатидному эхинококкозу в условиях Краснодарского края.
Качественные и количественные изменения в органах и тканях сельскохозяйственных животных при ги дати дном эхинококкозе.
Токсико-биологическая оценка продуктов убоя, полученных от сельскохозяйственных животных, инвазированных ларвальной формой эхинококкоза.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, собственные исследования, заключение, выводы, предложения производству, список литературы, приложения.
Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 11 рисунками. Список литературы представлен 266 источниками, в том числе 68 зарубежными.
Распространение и особенности эпизоотологии эхинококкоза сельскохозяйственных животных
Становление структуры очагов гельминтозов и их эволюция происходят либо независимо в соответствии с закономерностями развития природных биоценозов, либо в той или иной связи с деятельностью человека. Среди гельминтозов многие виды способны длительно существовать в природном биоценозе, одним из таких антропозоонозов является эхинококкоз. Влияние деятельности человека на распространение и циркуляцию эхинококка может быть прямым и косвенным. При прямом влиянии человека домашние собаки и сельскохозяйственные животные (к.р.с, овцы и др.) непосредственно участвуют в циркуляции гельминта на горных и предгорных пастбищах, скотоперегонных путях, на прогулочных площадках при фермах, в личных хозяйствах, образуя очаги инвазии. В другом случае, деятельность человека оказывает косвенное влияние на очаги, сохраняющие в своей основе природный характер (Андреянов О.Н., Сафиуллин Р.Т., Горохов В.В. и др., 2009; Архипов И.А., Зубов А.В., Борзунов Е.Н. и др., 2009; Гаджиев И.Г. 2009; Бондаренко В.С, 1991; Бочарова М.М., Багаева У.В., 2009; Карсаков Н.Т., Атаев A.M., 2009.)
Возбудитель альвеолярного эхинококкоза циркулирует между хищными млекопитающими (дефинитивные хозяева) и их жертвами -мелкими насекомоядными и грызунами, особенно мышевидными (промежуточные хозяева). Человек заражается при контакте с заражёнными хищниками или их шкурами (при выделке меха). Факторами передачи возбудителя могут быть вода, почва, ягоды и предметы обихода, контаминированные яйцами E.multilocularis. (Ястреб В.Б., Абалихин Б.Г., 2003).
На территории России и стран СНГ насчитывают 9 видов дефинитивных хозяев эхинококка, из них основные: лисица обыкновенная, песец белый, корсак, волк, шакал, собака домашняя, собака енотовидная, кошка пятнистая, кошка домашняя, и 30 видов промежуточных хозяев: полёвки: красная, рыжая, тёмная, водяная, красно-серая, обыкновенная, узкочерепная, экономка; мыши: лесная, полевая, домовая; суслики: краснощёкий, жёлтый; бурозубки: арктическая, обыкновенная; лемминги: сибирский, копытный; сурки: степной, серый; песчанки: большая, краснохвостая, полуденная; степная пеструшка, ондатра, тушканчик малый, бурундук, хомяк обыкновенный, заяц-беляк, цокор, человек (Садыков В.М., 1978; Артеменко ЮГ., 1987; Геллер И.Ю., 1989; Черепанов А.А., 2002; Ястреб В.Б., Абалихин Б.Г., 2003).
Болезнь широко распространена в хозяйствах с низким уровнем ветеринарно-санитарного состояния, где собакам скармливают трупы павших и субпродукты убитых животных. Поэтому чаще заражены эхинококками прифермские собаки и собаки, содержащиеся около боен, мясокомбинатов. Заражение собак происходит, в основном, в период массового убоя скота и падежа животных. Подворный убой животных и отсутствие ветеринарно-санитарной экспертизы туш и органов способствуют распространению инвазии. В кишечнике одной собаки может паразитировать до 10 тыс. экз. эхинококков (Архипов И.А. и др., 2005).
Эхинококкозы распространены более чем на 30 из 88 административных территорий страны (Шамхалов В.М., 1988; Бессонов А.С., 1988, 2000; Атаев A.M., 1997; Успенский А.В., 1997; Петров Ю.Ф., 2002; Забашта С.Н., 2003; Колесников В.И., 2003; Ястреб В.Б., Абалихин Б.Г., 2003). Наиболее интенсивные очаги отмечают в Республике Саха, Чукотском национальном округе, Оренбургской и Пермской областях, Ставропольском крае (Онищенко Г.Г., 2007, Христиановский П.И., Мамыкин Г.В., 2007; Киселев B.C., Белозеров Е.С., Змушко Е.И., 2008).
В России стабильно неблагополучной по эхинококкозу является Рязанская область (Меркушев А.В., 1954; Ивашкин В.М., Контримавичус В.А., Назарова Н.С., 1971; Андреянов О.Н., Бессонов А.С, 2003; Андреянов О.Н., Горохов В.В., Сафиуллин Р.Т., 2009).
В Астраханской области поражённость промежуточных хозяев возбудителем эхинококкоза постоянно колеблется, за последние годы она составила: среди крупного рогатого скота - 7,3%, мелкого рогатого скота - 6,7%, свиней - 1,5%, лошадей - 6,1%о. Поражённость животных в животноводческих хозяйствах области составила: к.р.с. - 1%, м.р.с. - 1,1%, лошадей - 0,7%), свиней - 0,7% ; по мясоперерабатывающим предприятиям: к.р.с. - 16,7%), м.р.с. - 13,5%, лошадей - 15,5%, свиней - 3,2%; мясной продукции, поступающей на рынки: к.р.с. - 4,2%, м.р.с. - 5,4%, лошадей -6,1% (Постнова В.Ф., Шендо Г.Л., Базельцева Л.И. и др., 2010).
В природных экосистемах Воронежской области в качестве дефинитивных хозяев эхинококков отмечены волк и лисица, промежуточными - дик ие к опытные: олень, лось и кабан (Ромашов Б.В., 1990, 2010), а также несколько видов мышевидных грызунов (Ромашова Н.Б., 2010). Уровни заражённости Е. granulosus (larva) диких копытных невысоки и составляют: у оленя - 4,2%, лося - 1,5%, кабана - 2,9% (Ромашова Н.Б., ЩавелеваО.Н.,2010).
По данным А.В. Усенкова, А.А. Алиева и др. (2005), в Волгоградской области экстенсинвазированность крупного рогатого скота достигала 42,1%, свиней - 32,5%), овец - 60,0% .
В г. Москва за 2007-2008 гг. на объектах, подконтрольных государственной ветеринарной службе, был зарегистрирован эхинококкоз у к.р.с. в 473 и 460 случаях в 2007 и 2008 гг. соответственно; у свиней -в 1438 и 759 случаях; у м.р.с. - 1150 и 1105 (Викулин Д.В., 2009). В Московской области (Можайский район) за 2007 г. при проведении ветеринарно-санитарных экспертиз туш крупного рогатого скота выявлено 24 случая эхинококкоза (0,45% ); мелкого рогатого скота - 2 случая эхинококкоза (Мельникова Л.Е., 2009).
Первые сообщения о нахождении эхинококков на Южном Урале относятся к началу XX века. Ветеринарные врачи А.Д. Пиотрович (1902) и Г.Н. Гурин (1906) обнаружили эхинококковые пузыри в органах убойного скота. В настоящее время эхинококкоз в структуре инвазионных болезней животных занимает значительный удельный вес, он выявлен в 50 (из 54) районах республики, количество неблагополучных пунктов доходит до 744, среди людей эта болезнь зарегистрирована в 41 районе ив 17 городах. Средняя поражённость крупного рогатого скота эхинококкозом колеблется от 5,2 до 10,5%). В печени и лёгких крупного рогатого скота количество эхинококковых пузырей доходит от 10 до 350 экз.; мясокомбинаты республики бракуют ежегодно в среднем до 500 т субпродуктов крупного рогатого скота, до 130 т от овец, до 300 т от свиней (Гафурова З.М. и др., 1996; Бессонов А.С, 2001; Хазиев Г.З., Сагитова А.С., И.Р. Гайнуллина., Шангареева Р.Х., 2002). В.И. Околелов, Г.С. Сивков, СВ. Блохина (2009) указывают на то, что на территории Среднего Прииртышья больше всего отмечено поражений эхинококкозом у крупного рогатого скота, овец и коз, за 2007-2008 гг. средняя заражённость эхинококкозом крупного рогатого скота по районам области составила 0,75%).
В Западной Сибири РФ (Омская область) многокамерным эхинококком заражено 3,2% лисиц и 2,4%) корсаков (Черепанов А.А., Околелов В.И., Жидков А.Е. и др., 2002)
В Ульяновской области возбудитель эхинококкоза циркулирует в системе «домашняя собака - домашние копытные животные». Проводимые обследования показали, что поражённость туш крупного рогатого скота составляет 8,7% ; у мелкого рогатого скота ларвальный эхинококкоз варьирует в пределах 10,5% . Несколько меньше заражалось этой инвазией свинопоголовье.
Мониторинг эпизоотической ситуации по основным гельминтозам, регистрируемым в регионе
Провели подсчёт клеток в 1 мл культуры (определили плотность инокулята). Для этого в пробирку с 1 мл культуры внесли 20 мкл 5% спиртового раствора йода. Содержимое тщательно перемешали, заправили им камеру Фукса-Розенталя и подсчитали количество клеток в 10 квадратах (вычисляли путём деления на 10 среднее число клеток в 1 квадрате (объем - 0,0001 мл) и умножением на 10000, полученная цифра - количество клеток в 1 мл среды - плотность инокулята - ПИ).
Далее в 10 пробирок поместили по 9 мл культуры инфузорий в экспоненциальной фазе роста. В первую пробирку добавили 1 мл дистиллированной воды, перемешали. Во вторую пробирку добавили 1 мл экстракта печени, полученной от здоровых животных, перемешали, таким образом, получили его разведение 1:10. Перенося по 1 мл жидкости из второй пробирки в третью, из третьей в четвертую и т.д. получили разведения заданного объекта 1:100; 1:1000; 1:10000; 1:100000.
Подобным образом получили разведения центрифугата инвазированной эхинококком печени, для исследования отобрали пробирки с концентрацией 1:1000, 1:10000, 1:100000.
Штатив с пробирками поместили в термостат при 25,5 С на 3 сут. Проводили аэрацию путём встряхивания 2-3 раза в день. Через 3 сут. вышеописанным способом в каждой пробирке определили плотность инокулята. Результаты исследований отражены в таблице 11.
Величина индекса интенсивности размножения клеток (ИИР) в сочетании с концентрацией заданного объекта в среде характеризуют степень его влияния на механизм размножения клеток. Из полученных данных мы можем сделать следующие выводы: добавление центрифугата печени в достаточно высокой концентрации (разведение 1:10) стимулирует размножение клеток (ИИР - 1,12), однако, со снижением количества добавленного экстракта выявить биологическую активность (воздействие на размножение клеток) не удалось: в пробирке с разведением 1:100 индекс интенсивности размножения клеток снизился уже до 1,07, плотность инокулята в разведениях 1:1000, 1:10000 и 1:100000 находилась на уровне контрольных образцов.
Добавление экстракта печени, инвазированной эхинококками, в культуру инфузорий оказало угнетающее воздействие на процесс размножения клеток: в разведении 1:1000 индекс интенсивности размножения клеток составил 0,68, в разведении 1:10000 - 0,88, что существенно ниже контрольных образцов; однако уже в разведении 1:100000 угнетающее воздействие практически не выражено (ИИР - 0,96).
Подобные результаты исследований могут свидетельствовать о благоприятном воздействии на восстановительные процессы в живом организме экстракта печени, полученной от здоровых животных, и наоборот, - о повреждающем в случае печени, инвазированной эхинококками.
Выводы. Биотестирование на инфузориях позволило нам зафиксировать изменение подвижности, гибель и скорость размножения клеток, свидетельствовавшие об изменениях, вызванных продуктами метаболизма гидатидного эхинококка.
В ходе опытов отмечена высокая повреждающая способность гидатидной жидкости на клетку (в разведении 1:10 отмечается быстрое повреждение жизненных механизмов, в разведении 1:100-1:10000 -постепенное повреждение, и в разведении 1:1000000 - медленное повреждение жизненных механизмов клетки). Центрифугат печени, полученнной от клинически здоровых животных, оказывал стимулирующее воздействие на клетки инфузорий.
Экстракт пораженной Echinococcus granulosus печени оказывает слабое повреждающее действие на жизненные механизмы клетки, причём проявляется это только при длительном контакте с повреждающим объектом.
Проводя аналогию с макроорганизмом и учитывая компенсаторные механизмы последнего, можно предположить, что однократное потребление пораженной печени заметного влияния на организм не окажет, однако постоянное - может привести к неблагоприятным последствиям.
Опыты по определению биологической активности центрифугата печени, пораженной эхинококкозом, методом разрешающего воздействия могут свидетельствовать о способности исследуемого объекта снижать жизнеспособность клеток в средней степени концентрации практически на 12%, с уменьшением же концентрации (высокое разведение) биологическая активность ослабевает. Это исследование позволяет сделать вывод о том, что экстракт печени, полученной от здоровых животных, оказывает благоприятное влияние на живую клетку и, предположительно, организм в целом; а употребление печени, инвазированной эхинококками, может оказывать негативное влияние на макроорганизм.
Центрифугат печени, полученной от клинически здоровых животных, достаточно высокой концентрации (разведение 1:10) стимулирует размножение клеток (ИИР - 1,12), однако, со снижением количества добавленного экстракта выявить биологическую активность (воздействие на размножение клеток) не удалось. Добавление экстракта печени, инвазированной эхинококками, в культуру инфузорий оказало угнетающее воздействие на процесс размножения клеток.
Необходимость такого количества исследуемых параметров объясняется тем, что наблюдать за изменением подвижности клетки недостаточно для оценки токсичности. Поскольку на движение у простейших расходуется всего 1% энергии общего обмена, то подвижность только незначительно отражает те изменения, которые происходят при отравлении токсичными агентами. Гибель отдельных клеток — достаточно надежный показатель, но с его помощью невозможно выявить низкие концентрации токсикантов. Оценка скорости размножения — биотест с большей чувствительностью, по нему можно определять и небольшие концентрации вредных веществ. Если сочетать все тесты, то результат можно считать достоверным.
Динамика содержания летучих органических веществ в органах и тканях крупного рогатого скота при гидатидном эхинококкозе
Данная работа выполнялась в соответствии с государственной тематикой Российской академии сельскохозяйственных наук, раздел 08.05.02, с номером гос. регистрации 15070.7703052541.06.8.002.3 в период с 2008 по 2011 г. в лаборатории паразитологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Краснодарского научно-исследовательского ветеринарного института.
В ходе работы для выяснения эпизоотологической обстановки на территории Краснодарского края осуществили обобщение и анализ данных государственной ветеринарно-статистическои отчётности; данных лабораторно-диагностических исследований ветеринарных районных, зональных и краевой лаборатории; использовали отчёты НИР государственных научно-технических и региональных программ Краснодарского НИВИ, в выполнении которых автор принимал непосредственное участие.
Лабораторные исследования выполнялись в лаборатории паразитологии и ВСЭ. Объектами исследований явились цистные формы Echinococcus granulosus, продукты их жизнедеятельности, органы и ткани, заражённые эхинококком продуктивных животных, и их влияние на живой организм (одноклеточные и лабораторные животные).
Для определения качественных и количественных изменений в органах и тканях сельскохозяйственных животных, инвазированных эхинококками, мы использовали методы, принятые в ветеринарно-санитарной практике. Органолептически оценивали внешний вид, цвет, запах, состояние жира, сухожилий, проводили пробу варкой (ГОСТ 7269-79). Лабораторные исследования включали в себя: реакцию с сернокислой медью, реакцию с формалином, реакцию на пероксидазу, определение рН, аммиака с реактивом Несслера, определение степени обескровленности туши; микроскопический анализ мяса (определение количества бактерий и степени распада мышечной ткани) (ГОСТ 23392-78), определение аминокислотного состава: свободных и связанных аминокислот (при помощи электрофореза «Капель 103-Р»), определение концентрации летучих органических веществ (методом газожидкостной хроматографии с помощью прибора «Кристалл 2000-М»).
Для определения воздействия на одноклеточный организм гидатидной жидкости и продуктов убоя инвазированных эхинококками сельскохозяйственных животных модифицировали методы экспресс-биотестирования («Экспресс-биотест. Биологический мониторинг экологических систем», Воронеж, 1997; Виноходов Д.О. «Токсикологические исследования кормов с использованием инфузорий», СПб, 1995). В ходе опытов провели: экспресс-оценку биологической активности, её оценку методом разрешающего воздействия, оценку биологической активности по интенсивности размножения парамеций, определение питательной ценности.
В качестве тест-функций использовали следующие показатели жизнедеятельности простейших: выживаемость инфузорий, подвижность и характер движения, генеративную (ростовую) и хемотаксическую (поведенческую) реакции, морфологические и биохимические показатели. Для работы использовали культуру, содержащую в экспоненциальной фазе не менее 2500-3000 особей в 1 мл среды, а в стационарной не менее 6500-7500. Для выяснения биологической активности повреждающего агента (гидатидной жидкости и экстрактов, полученных из внутренних органов сельскохозяйственных животных, инвазированнных ларвальной формой эхинококкоза) на клетку мы изучали влияние исследуемых агентов в культуральной жидкости в разведениях 1:10; 1:100; 1:1000; 1:10000; 1:100000; 1:1000000. Оценку полученных результатов осуществляли по следующим параметрам: ИН - объект биологически не активен. БА - объект биологически: 1:1000 - слабоактивен; 1:10 000 - средне активен; 1:100 000 - активен; 1:1 000 000 - высокоактивен; ЬЕюо - токсическое действие: 1:1000 - слабое; 1:10 000 - среднее; 1:100 000 - сильное; 1:1 000 000 - очень сильное Б А: 24 ч - биологическая активность очень стабильная; 3 - 6 ч -биологическая активность стабильная; 0,5 - 1,0 ч - биологическая активность слабо стабильная ЬЕюо - 0,5 - 1 ч - быстрое повреждение жизненных механизмов ЬЕюо - 3 - 6 ч - постепенное повреждение жизненных механизмов ЬЕюо - 24 ч - медленное повреждение жизненных механизмов Оценку биологической активности повреждающего агента методом разрешающего воздействия проводили, используя формулу: ИБА = ТО / ТК, где: ИБА - индекс биологической активности заданного объекта; ТО - продолжительность жизни (минут) под действием разрешающего фактора клеток, проживших 24 ч в среде с испытуемой концентрацией заданного объекта; ТК - продолжительность жизни (минут) под действием разрешающего фактора клеток, проживших 24 ч в контрольной среде. Полученные результаты трактовали следующим образом: ИБА + 1,000 + 0,100 - объект биологически не активен; ИБА 1,000 + 0,1000 - объект повышает жизнеспособность клеток; ИБА 1,000 + 0,1000 - объект снижает жизнеспособность клеток. Для определения влияния исследуемых повреждающих агентов на регенераторную способность клеток мы использовали такой показатель, как интенсивность размножения парамеций.
Оценка биологического воздействия на регенераторную способность клетки
Водные экстракты, полученные из мяса от клинически здоровых животных и животных инвазированных, фильтровались примерно с одинаковой скоростью, однако фильтрат, полученный от клинически здоровых животных, был прозрачнее, чем полученный от больных.
Мясо, полученное от клинически здоровых животных, имело рН в среднем 5,93±0,06; рН мяса, полученного от инвазированных животных, находилось в пределах 6,21-6,48 (в среднем - 6,35±0,08), что свидетельствует о необходимости проведения бактериологического исследования.
Микроскопический анализ мазков-отпечатков проводили с целью определения количества бактерий и степени распада мышечной ткани. В мазках-отпечатках мяса, полученного от клинически здоровых животных, микроорганизмов и признаков распада мышечной ткани не выявили, однако в мазках-отпечатках мяса, полученного от животных, инвазированных эхинококками, обнаружили грамположительные и грамотрицательные условно патогенные бактерии (идентифицированные в ходе проведения бактериологических исследований как Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Escherichia coli 026, E.coli 0117; E.coli 0137 E.coli K88, E.coli A20) и слабую исчерченность мышечных волокон.
Помимо этого с целью бактериологического исследования стерильно была взята жидкость их эхинококковых пузырей. Посев произведён путём последовательной инкубации на МПА, МПБ и среду ЭНДО с последующей инкубацией при температуре 37 С в течение 3 сут. с просмотром через каждые 18-24 ч. По характерному росту колоний и биохимическим свойствам бактерии предварительно были отнесены к роду Salmonella. Дальнейшую идентификацию выделенного возбудителя проводили с помощью пластинчатой РА с сальмонеллёзными монорецепторными О-агглютинирующими и Н-агглютинирующими сыворотками, устанавливая при этом серотиповую принадлежность. В результате проведённых исследований выделенный возбудитель был типирован как патогенный серотип - Salmonella choleraesuis 07 Clc.
Таким образом, ларвоцисты эхинококков, как в целом сами инвазированные эхинококками животные, могут являться резервентами возбудителей сальмонеллёзов, а мясо и мясопродукты, полученные от этих животных, могут представлять опасность для людей как возможные источники пищевых отравлений (токсикоинфекций).
При постановке качественной реакции на пероксидазу вытяжка, полученная из мяса клинически здоровых животных, приобретала сине-зелёный цвет, который спустя несколько минут постепенно переходил в буро-коричневый (положительная реакция на пероксидазу). Проба, полученная из мяса больных животных, окрашивалась в коричневый цвет (отрицательная реакция на пероксидазу).
Проводили также реакцию с сернокислой медью. Пробы, полученные из мяса клинически здоровых животных, оставались прозрачными, а бульон, полученный от инвазированных животных, приобретал слабозаметное помутнение.
Так как в процессе разложения в мясе накапливается аммиак, то по количеству последнего можно судить о степени свежести продукта, для этого в лабораторной практике используется реактив Несслера. В пробирке, содержащей экстракт мяса клинически здоровых животных, после добавления 10 капель реактива раствор оставался прозрачным, приобретая бледно-жёлтую окраску. В пробирке с экстрактом мяса, полученного от инвазированных эхинококками животных, в ходе реакции, после добавления 10 капель реактива, раствор становился ярко-жёлтого цвета, наблюдалось незначительное помутнение, это свидетельствует о повышенном содержании аммиака - такое мясо выпускается для немедленного употребления.
Для определения количества летучих жирных кислот (ЛЖК) проводили анализ на приборе для перегонки водяным паром. В результате исследований в мясе, полученном от клинически здоровых животных, было определено 3,72 мг летучих органических кислот, что соответствует нормам для свежего мяса. В пробах мяса, полученного от животных, инвазированных эхинококкозом, количество летучих жирных кислот составляло 4,53 мг, что говорит о сомнительной свежести мяса. В ходе исследований ни в одной пробе сероводород обнаружен не был.
Массовая доля влаги (%) у инвазированных эхинококками животных составила 75,2 %, а у незараженных - 72,8%; белка - 17,5% и 18,8%; жира -6,6% и 8,3% и, наконец, фенилаланина - 784 и 793 мг% соответственно (рисунок 5).
Выявление концентрации связанных и свободных аминокислот в вытяжке мышечной ткани и органах имеет огромное значение, так как высокая концентрация свободных аминокислот в органах и тканях животных свидетельствует о процессах распада белков, а значит, о деструктивных процессах. Для определения количества (массовой концентрации) свободных и связанных аминокислот (аргинин, лизин, фенилаланин, тирозин, лейцин, гистидин, валин, пролин, метионин, серии, треонин, триптофан, гилицин и а-аланин) в органах и тканях мы пользовались методом капиллярного электрофореза. Этот метод основан на разделении анионных форм N-фенилтиокарбамилпроизводных аминокислот под действием электрического поля вследствие их различной электрофоретической подвижности. Пробоподготовка к проведению анализов с целью выявления связанных аминокислот заключалась в предварительном гидролизе исследуемых органов и тканей (длиннейшая мышца спины, сердечная мышца, печень, лёгкие, селезёнка и почки) 20%-ной соляной кислотой. Полученные в ходе проведения опытов результаты (таблица 5) свидетельствуют о том, что суммарное количество связанных аминокислот в органах животных, инвазированных эхинококками, снижалось: в печени -на 29,05%, в длиннейшей мышце спины -3 1,44%, в легких -2 0,46%, в селезёнке - 3,96%, в почках - 9,00% и в сердечной мышце - на 11,78% (рисунок 6).
