Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные методы лечения раневых дефектов. Использование дермотрансплантатов в клинической практике (обзор литературы).
1.1. Структурно - функциональная характеристика нормальной кожи . 16
1.2. Регенерация кожи. Характеристика межклеточных клеточно матриксных взаимодействий в процессе нормального заживления кожных ран. 25
1.3. Особенности патогенеза трофических язв и длительно незаживающих ран. 34
1.4. Принципы лечения трофических язв и длительно незаживающих ран. 44
1.5. Использование кожных трансплантатов в клинической практике и методы их хранения. 50
1.6. Живой эквивалент кожи. Реконструкция эпителиальных тканей с использованием клеточных технологий. 68
Глава 2: Материалы и методы исследования .
2.1. Источники получения кожи и методика хранения жизнеспособных дермотрансплантатов . 80
2.2. Описание препарата «живой эквивалент кожи». Информация о методе. 91
2.3. Характеристика клинических групп больных. 96
2.4. Клинические и лабораторные методы исследования.
2.4.1. Клинические методы исследования. 104
2.4.2.Динамическое измерение площади раневой поверхности. 107
2.4.3. Бактериологические исследования. 108
2.4.4. Цитологические, морфологические и иммуногистохимические исследования. 108
2.4.5. рН-метрия ран. 111
2.5. Статистическая обработка результатов исследования. 112
Глава 3. Межклеточные и клеточно-матриксные взаимодействия при репарации раневых дефектов кожных покровов .
3.1. Особенности репаративных процессов в длительно незаживающих ранах и трофических язвах . 113
3.2. Межклеточные и клеточно-матриксные взаимодействия в раневых дефектах кожных покровов при использовании криоконсервированных жизнеспособных аллодермотрансплантатов. 126
Глава 4. Результаты использования криоконсервированных жизнеспособных аллодермотрансплантатов .
4.1. Результаты применения криоконсервированных жизнеспособных аллодермотрансплантатов в местном лечении длительно незаживающих ран . 140
4.2 Результаты применения криоконсервированных жизнеспособных аллодермотрансплантатов в местном лечении трофических язв. 160
Глава 5. Результаты использования криоконсервированных жизнеспособных аутодермотрансплантатов .
5.1. Результаты применения «утильных» криоконсервированных жизнеспособных аутодермотрансплантатов при травматических отрывах конечностей. 182
5.2. Результаты применения криоконсервированных жизнеспособных аутодермотрансплантатов при лечении скальпированных и рвано - ушибленных ран. 196
5.3. Использование криоконсервированных жизнеспособных ауто-дермотрансплантатов при этапном закрытии раневых дефектов. 205
Глава 6. Живой эквивалент кожи в местном лечении раневых дефектов .
6.1. Результаты применения живого эквивалента кожи в лечении раневых дефектов. 227
Заключение. 240
Выводы. 272
Практические рекомендации. 274
Список литературы. 279
- Структурно - функциональная характеристика нормальной кожи
- Источники получения кожи и методика хранения жизнеспособных дермотрансплантатов
- Особенности репаративных процессов в длительно незаживающих ранах и трофических язвах
- Результаты применения криоконсервированных жизнеспособных аллодермотрансплантатов в местном лечении длительно незаживающих ран
Введение к работе
Актуальность исследования: На протяжении всей истории медицины перед практикующими врачами стоит проблема лечения раневых дефектов, причем, как непосредственно после повреждения кожных покровов, так и через различные интервалы времени. Эта проблема остается чрезвычайно актуальной на фоне все возрастающего бытового травматизма, распространения локальных вооруженных конфликтов, природных и техногенных катастроф. Также необходимо учитывать ухудшение экологической обстановки, старение населения, «болезни цивилизации» (сердечно-сосудистые нарушения, метаболические расстройства, аллергизация и сенсибилизация населения, способствующие изменению иммунореактивных и неспецифических факторов защиты макроорганизма, появление все большего числа антибиотико-устойчивых микроорганизмов).
Рост числа ожогов и ран является общемировой тенденцией. Так, в» США ежегодно ожоги получает более 1,25 миллиона, человек, и не менее 6,5 млн. страдают хроническими ранами и язвами; которые являются следствием метаболических расстройств, сосудистой недостаточности. Лечение таких больных дорого, трудоемко и малоэффективно. На лечение одного больного в США тратится 10,0 тыс. - 15,0 тыс. долларов, используется около 5% коечного фонда американских госпиталей, а рынок лечения в 2000 году оценивался более 932 млн. долларов. Наша страна не является исключением. Еще в 1982 году Лунич В.Л. и Соскин Л.С. писали про трофические язвы и длительно незаживающие раны: «...Эта патология встречается у 2-5% взрослого населения, характеризуется длительностью и упорством течения, склонностью к рецидивам и приводит к полной или частичной потере трудоспособности в большей степени, чем туберкулез, сахарный диабет, ревматизм и травмы вместе взятые».
Применяемые в настоящее время традиционные методы лечения дают положительный эффект приблизительно в.75% — 80% случаев. При этом длительность лечения составляет, в среднем, 1,5-2 месяца, и не всегда происхо-
дит полная реэпителизация раневого дефекта. Достаточно часто развиваются рецидивы. Так, например, трофические язвы, возникшие на фоне варикозной болезни нижних конечностей, при оперативном методе лечения дают рецидивы в 4,8% - 31,6% случаев, при консервативном - в 15% - 80% и приводят к ухудшению качества жизни пациентов вплоть до получения инвалидности в 10-30% наблюдений (Charles Н., 2004; Welch H.J., 2004).
Такой разброс в данных не случаен, так как, не смотря на давность существования проблемы и многочисленные исследования, по настоящее время не определен четко даже временной фактор, по окончании которого длительно незаживающая рана считается трофической язвой. Некоторые исследователи называют срок 1,5 месяца, другие - 4-6 месяцев (Григорян А.В. и соавт., Васютков В.Я., Проценко Н.В., Лаврова О.Д., Цахаев А.Н.). Также нигде не уточняется, по истечении, какого времени рана становится длительно незаживающей. Все это приводит к сложностям не только в статистических исследованиях, но и в лечении пациентов.
Достигнутые в последние десятилетия успехи в области изучения молекулярных основ патологических процессов делают возможным не только понимание причин развития, но и позволяют активно влиять на течение и исход многих заболеваний. Определенные успехи имеются в исследовании и лечении ран. Создание новых, современных методов лечения основывается на активном вмешательстве в ход раневого процесса при помощи биологически активных веществ и активизации нормальных репаративных процессов.
Наиболее перспективным подходом к проблеме лечения ран и ожогов является биотехнологический, позволяющий значительно расширить арсенал методов лечения и улучшить результаты. Существующий спектр современных биотехнологических подходов и приемов достаточно широк. Однако, разработка и широкое клиническое внедрение отечественного, доступного для реального использования метода продолжает оставаться актуальным, так как существующие методы и средства местного лечения раневых дефектов, особенно у пациентов в тяжелом состоянии или в пожилом возрасте на фоне
тяжелой сопутствующей патологии, не дают стойкого положительного эффекта и достаточно дороги. Одними из наиболее перспективных оказались биологические и биосинтетические средства, основанные на использовании аллогенных клеток и тканей. Несмотря на широкий выбор современных лекарственных средств и перевязочных материалов, в клинической практике нет искусственного покрытия, которое по своим физиологическим свойствам приближалось бы к коже человека (Бурмистров В.Н., 1986, Киселев И.В., 2000).
Во всех развитых странах мира сегодня успешно функционируют Банки тканей. В США в 1950 году для целей реконструктивной и пластической хирургии был организован Военно-морской банк органов и тканей. В настоящее время в США действует Ассоциация тканевых Банков, объединяющая региональные Банки различных тканей (на сегодняшний день по стране их насчитывается более тысячи) единой компьютерной сетью. Система Банков выполняет важные мобилизационные функции. Такие запасы позволяют, в частности, временно замещать пораженные кожные покровы (например при ожогах) на этапах эвакуации пострадавших или позволяют закрывать раневой дефект в период лечения. В настоящее время в США производится более 100000 трансплантаций аллогенной кожи, 500000 - аллогенной кости, 50000 - аллогенной роговицы ежегодно. В ходе оказания помощи пострадав-шим от террористического акта в г.Нью-Иорке (11.09.2001г.) было использовано около 14 м2 донорской кожи и 200 м2 выделено в качестве неприкосновенного запаса на случай чрезвычайных ситуаций. Самый крупный Банк тканей создан в 304 армейском госпитале в Пекине (Китай). В нем хранится бо-лее 200 м аллодермотрансплантатов. В голландском городе Beverwijk находится Европейский банк кожи, который обеспечивает практически все крупные ожоговые центры Старого Света (Васильев А.В., 2004).
В зарубежных банках кожи используется технология хранения кожи в глицерине, что не обеспечивает сохранения ее жизнеспособности при длительном хранении (Kearney J.N, 1998). Преимущества использования жизне-
способных дермотрансплантатов становятся более очевидны при лечении больных пожилого и старческого возраста, раненых и пострадавших в тяжелом состоянии, пациентов с тяжелой сопутствующей патологией, для которых любое оперативное пособие может привести к значительному ухудшению состояния и необратимым последствиям.
В нашей стране аллогенные ткани для лечения ран практически не применяются. Также отсутствуют структуры (Банки кожи), предназначенные для хранения тестированных запасов аллогенных тканей, отсутствуют доступные технологии заготовки, хранения и использования аллогенной кожи, хотя спрос на данные материалы есть. Годовые потребности только Московского ожогового центра НИИ скорой помощи им. Н.В.Склифосовского превышают 30 м ежегодно, а таких центров и специализированных отделений в нашей стране насчитывается не менее семидесяти (Васильев А.В., 2004).
Рост числа травм и ожогов, увеличение количества больных с трофическими язвами* и длительно незаживающими ранами, старение населения обуславливают необходимость поиска новых малотравматичных и относительно недорогих методов для местного лечения ран, что определяет актуальность данной проблемы. В связи с этим коллектив кафедры военно-полевой (военно-морской) хирургии Государственного института усовершенствования врачей МО РФ совместно с сотрудниками лаборатории проблем клеточной пролиферации Института биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН на протяжении последних лет проводит научные исследования в сфере разработки и создания биологических и биосинтетических покрытий. Цель работы: Улучшить результаты лечения обширных раневых дефектов (в том числе, у пациентов с травматическими отрывами конечностей и открытыми переломами костей), длительно незаживающих ран и трофических язв путем разработки, обоснования и внедрения в клиническую практику современной технологии заготовки, хранения и использования криоконсерви-рованных жизнеспособных дермотрансплантатов и живого эквивалента кожи.
Задачи исследования:
Провести морфологическое и иммуногистохимическое исследование клеточного и стромального компонентов длительно незаживающих ран и трофических язв различного генеза для выявления характерных особенностей и общих закономерностей их развития в зависимости от давности существования.
Изучить динамику репаративных процессов, а также механизмы, регулирующие межклеточные и клеточно-матриксные взаимодействия в процессе репарации в длительно незаживающих ранах и трофических язвах, при использовании криоконсервированных жизнеспособных аллодермотрансплан-татов.
Оценить клинические результаты при использовании криоконсервированных жизнеспособных аллогенных дермотрансплантатов для лечения длительно-существующих ран и трофических язв, обосновать показания и противопоказания к применению разработанного метода.
Обосновать показания, оценить результаты применения криоконсервированных жизнеспособных аутологичных дермотрансплантатов при лечении пострадавших с травматическими отрывами конечностей (с дефицитом кожных покровов на пострадавшем сегменте) путем забора жизнеспособной кожи с ампутированного сегмента (в случае невозможности реимплантации), выявить противопоказания и осложнения, наметить методы профилактики.
Обосновать показания, оценить результаты применения криоконсервированных жизнеспособных аутологичных дермотрансплантатов при этапном закрытии обширных раневых дефектов, в том числе при открытых переломах костей, выявить противопоказания и осложнения, наметить методы профилактики.
Изучить динамику раневого процесса при использовании живого эквивалента кожи, обосновать показания, оценить результаты клинического применения, выявить противопоказания и осложнения.
7. Внедрить разработанный метод лечения обширных раневых дефектов, длительно незаживающих ран и трофических язв в клиническую практику.
Научная новизна
Установлено, что длительно незаживающие раны и трофические язвы, вне зависимости от факторов, обусловивших их развитие, характеризуются стереотипными изменениями со стороны состава воспалительного инфильтрата и внеклеточного матрикса: преобладанием клеток моноцитарно-макрофагального ряда в воспалительном инфильтрате в сочетании с недостаточным количеством Т-хелперов/Т-супрессоров; снижением содержания коллагена Ш типа, накоплением тенасцина и плазменной формы фибронек-тина, изменением типичной локализации ламинина, минимальным количеством миофибробластов в области раневого дефекта. Выявлены изменения со стороны медиаторных систем, регулирующих ход воспалительно-репаративной реакции: обнаружены повышенное накопление провоспалительных цитокинов (EL-ip, MIP-loc/MIP-lp) и нарушение их нормального соотношения, отсутствие фиброгенных факторов роста (TGF-Р'ь bFGF) в сочетании с повышенной активностью матриксной металлопротеиназы - 9 в области раны.
Установлено, что данные изменения становятся выраженными в раневых дефектах, существующих более 3 месяцев. Данный интервал времени предлагается использовать для разделения определений «длительно незаживающая рана» и «трофическая язва».
Установлено, что после трансплантации криоконсервированных жизнеспособных дермотрансплантатов в ране происходит нормализация экспрессии провоспалительных цитокинов, активизация продукции факторов роста, снижение активности матриксной металлопротеиназы - 9. Это способствует формированию нормального внеклеточного матрикса, провизиональ-ногобазальной мембраны и заживлению ран. Выявлены особенности репара-тивных процессов после трансплантации криоконсервированных жизнеспособных дермотрансплантатов - сохранение в течение всего процесса зажив-
ления раны инфильтрации моноцитами/макрофагами и минимального количества миофибробластов, поэтому заживление раны происходит без контракции и формирования рубца.
Разработана современная отечественная технология заготовки, хранения и клинического применения криоконсервированных жизнеспособных дермотрансплантатов (как аллогенных, так и аутологичных) с использованием оригинального консерванта «Криодерм». Данная технология позволяет максимально поддерживать жизнеспособность и морфо-функциональные свойства дермотрансплантатов и подразумевает использование нескольких температурных режимов хранения дермотрансплантатов.
Доказана высокая клиническая эффективность модифицированного отечественного живого-эквивалента кожи, разработанного в Институте биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН. С учетом накопленного опыта в гель, содержащий фибробласты, была заключена биологически нетоксичная сетка, которая придает всей конструкции прочность, предотвращает, горизонтальную контракцию геля и облегчает процесс трансплантации.
Практическая значимость:
Результаты исследований могут служить основой для разработки принципов и подходов широкого применения жизнеспособных криоконсервированных алло(ауто)дермотрансплантатов в клинической практике и военной медицине в целом. Данная технология и консервант «Криодерм» могут быть использованы при развертывании в нашей стране Банков кожных и клеточных трансплантатов. Применение новых биотехнологических методов воостановления кожного покрова позволяет выйти на более высокий уровень лечения, снизить летальность и инвалидизацию больных, сократить сроки лечения в стационарах и амбулаторных условиях, в целом поменять взгляды клиницистов на давно устоявшиеся принципы лечения длительно незаживающих ран, трофических язв и; обширных раневых дефектов. Особенно в тех случаях, когда тяжесть состояния1 больного или наличие сопутствующей патологии не позволяют проводить активную хирургическую тактику.
Результаты данной работы могут быть использованы в отделениях гнойной хирургии и травматологии как в больницах, так и в поликлиниках. Основные положения, выносимые на защиту:
Длительно незаживающие раны и трофические язвы характеризуются похожими патологическими особенностями состава воспалительного инфильтрата и нарушениями в соотношении компонентов внеклеточного мат-рикса (соотношение провоспалительных цитокинов, дефицит фиброгенных факторов роста, дисбаланс в системе матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов). Это препятствует репарации, создавая самоподдерживающуюся систему, функционирующую по принципу «порочного круга». Учитывая, что данные патологические изменения наиболее выражены для ран, существующих более 3 месяцев, целесообразно данный интервал времени использовать для разделения определений «длительно незаживающая рана» и «трофическая язва».
Закрытие длительно существующего раневого дефекта жизнеспособными криоконсервированными аллодермотрансплантатами* приводит к восстановлению систем, регулирующих межклеточные и клеточно-матриксные взаимодействия в длительно существующих раневых дефектах. Происходит активизация репаративных процессов, которые приводят к восстановлению эпителиального покрова.
Результаты лечения пострадавших с дефицитом кожных покровов при травматических отрывах конечностей (в случае невозможности реимпланта-ции) могут быть улучшены путем использования криоконсервированных жизнеспособных аутодермотрансплантатов, заготовленных по разработанной методике с ампутированного сегмента.
Учитывая, что у пациентов с обширными раневыми дефектами крайне сложно добиться одновременной готовности раны к кожной пластике на всей площади.дефекта, целесообразно производить во время плановой операции аутодермопластики забор аутодермотрансплантатов «с запасом» и хранить излишки аутологичной кожи по разработанной методике. Это позволяет, по
мере необходимости, производить повторную пластику жизнеспособной ау-тологичной кожи не занимая операционную и не травмируя дополнительно больного.
5. Использование разработанного живого эквивалента кожи позволяет улучшить результаты местного лечения раневых дефектов, особенно в тех случаях, когда тяжесть состояния больного или наличие сопутствующей патологии не позволяют проводить активную хирургическую тактику.
Работа выполнена на кафедре военно-полевой хирургии Государственного института усовершенствования врачей МО РФ, в лаборатории проблем клеточной пролиферации Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (руководители - д.б.н. Терских В.В., д.б.н. Васильев А.В.). Морфологические исследования проведены и консультированы в лаборатории клеточной и молекулярной патологии Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова (заведующий - д.м.н. Иванов А.А.).
Апробация диссертационного материала: Материалы диссертации доложены и обсуждены на:
69 заседании секции военно-полевой хирургии Хирургического общества г.Москвы и Московской области.- М., 2000;
Всеармейской научно-практической конференции «Особенности оказания медицинской помощи, лечения раненых и больных с боевой хирургической и терапевтической травмой в локальных войнах и вооруженных конфликтах». - СПб, 2000;
Научно-практической конференции «Актуальные вопросы оказания медицинской помощи в городской многопрофильной клинической больнице», посвященной 125-летию городской клинической больницы №29 «Утоли моя печали».- М., 2000;
Международном российско-германском симпозиуме «Хирургия повреждений мирного и военного времени».- М., 2001;
П Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» .- М., 2001;
18-м Европейском Конгрессе патологов.- Берлин, Германия, 2001;
Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы современной тяжелой травмы», поев. 70- летию кафедры ВПХ ВМА. - СПб., 2001;
Северо - кавказкой научно- практической конференции, посвященной 20-летию кафедры военно-полевой хирургии Ростовского государственного медицинского университета «Достижения и проблемы современной военно-полевой и клинической хирургии».- г.Ростов - на - Дону, 2002;
Международном хирургическом конгрессе «Актуальные проблемы современной хирургии».- М., 2003;
Международной конференции «Хирургические инфекции: профилактика и лечение».- М., 2003;
Всероссийской конференции хирургов «Совершенствование специализированной медицинской помощи в многопрофильном стационаре» поев. 80-летнему юбилею профессора Петрова В.П.- М., 2003;
14 - международной конференции российского общества ангиологов и сосудистых хирургов. «Новые тенденции в сосудистой хирургии и флебологии». -г.Ростов-на Дону, 2003;
4 международном конгрессе по пластической реконструктивной и эстетической хирургии (IVICPRAS). - Ярославль, 2003;
Международной конференции «Хирургические инфекции: профилактика и лечение». - М., 2003;
Конференции посвященной 300-летию ГВКГ им. Н.Н. Бурденко «Ведущий многопрофильный госпиталь страны: основные функции, достижения и направления развития».- М., 2006;
3-м международном конгрессе «Современные технологии в травматологии и ортопедии».- М., РУДН.- 2006;
6 всеармейской международной конференции «Инфекции в хирургии мирного и военного времени».- М., 2006;
Ш Международном салоне вооружения и военной техники «МВСВ-2008» «Оказание медицинской помощи подразделениями военно-полевой медицины в условиях полевого госпиталя». - М., 2008.
Внедрение результатов исследования.
Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедры военно-полевой (военно-морской) хирургии Государственного института усовершенствования врачей МО РФ, в лечебную работу отделения гнойной хирургии, травматологических отделений ГКБ №29 им. Н.Э.Баумана г.Москва, ГКБ г.Мытищи (Московская область).
По теме диссертации опубликовано 42 работы в центральной печати и региональных сборниках, в том числе опубликовано два учебно-методических пособия и две монографии:
Хрупкий В.И., Ханевич М.Д., Щелоков А.Л., Ивашкин А.Н. Осложненные формы хронической венозной недостаточности нижних конечностей: М. «МедЭкспертПресс»; Петрозаводск: из-во «ИнтелТек».2003.-176 с.
Хрупкий В.И., Ивашкин А.Н., Зубрицкий В.Ф., Артемьев А.А., Фоминых Е.М. Дерматопластика раневых дефектов: М.: Гэотар-Медиа,2009.-193 с.
Материалы диссертации использовались при организации первой в Российской Федерации и в странах СНГ «Медицинской лаборатории тканевых трансплантатов (банка кожных и тканевых трансплантатов)» на базе СПК Главного военного клинического госпиталя им. Н.Н. Бурденко МО РФ в соответствии с «Решением межведомственного совещания...» от 24.07.2004 г., утвержденного начальником ГВМУ МО РФ и директором Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.
Объём и структура работы: Диссертационная работа изложена на 312 страницах машинописного текста и состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы (145 отечественных и 204 зарубежных источника). Работа иллюстрирована 27 таблицами и 81 рисунком.
Структурно - функциональная характеристика нормальной кожи
Кожа - орган, выполняющий большое количество жизненно важных функций, включая защиту от воздействия факторов окружающей среды, регуляцию температурного и водно-солевого режима, иммунологическую и сенсорную функции. Благодаря структурным особенностям, обеспечивающим одновременно прочность и эластичность, кожные покровы достаточно устойчивы к механическим, физическим и химическим воздействиям. Для понимания процессов, происходящих при заживлении кожных ран, а также патологических изменений, приводящих к нарушению репаративных процессов, необходимо рассмотреть структурную организацию нормальной кожи. Также следует представлять основные механизмы регуляции межклеточных и клеточно-матриксных взаимодействий, ведь заживление ран -сложный процесс, протекающий на различных уровнях (молекулярном, субклеточном, клеточном, тканевом и органном), конечной целью которого является ликвидация повреждения с максимальным восстановлением анатомической структуры при условии минимальных функциональных потерь. Репа-ративные процессы в ране неразрывно связаны с воспалением и формируют с ним единую реакцию на повреждение (80, 98). Однако, воспаление не всегда заканчивается репарацией, и в этом случае его течение становится хроническим, приобретая характер самостоятельного заболевания, требующего специального лечения. Анатомически кожа разделена на два слоя. Состоящий из клеток эпидермис образует внешний слой (надкожу), а собственно кожа - внутренний. Разделяющая слои структура - базальная мембрана. Ткань, лежащая под дер- мой и содержащая жировую клетчатку, носит название гиподерма. Схема строения кожи и ее придатков представлена на рисунке 1.1. Кожный покров развивается из двух эмбриональных зачатков: эпителий формируется из кожной эктодермы, а подлежащие соединительнотканные слои - из дерматомов (производных сомитов). В итоге образуется два различных слоя. Наружный - эпидермис, представленный многослойным плоским ороговевающим эпителием, и дерма - соединительно-тканная основа, формируемая сложным комплексом компонентов внеклеточного матрикса и клеточных элементов, популяции которых включают в себя резидентные клетки - фибробласты, макрофаги, плазмоциты, тканевые базофилы; транзи-торные клетки - гранулоциты и лимфоциты, имеющие гематогенное происхождение и проникающие в дерму из крови (140). Основной особенностью дермы, отличающей ее от других тканей организма, является значительное преобладание внеклеточного матрикса над клеточными элементами. С рождения и до полового созревания человека происходит приблизительно семикратное увеличение массы и площади кожи. У взрослого человека ее масса составляет 4-6% от общей массы тела, а вместе с подкожной жи- ровой клетчаткой - 16-18%. Площадь кожи - от 16 000 до 20 000 см2, ее толщина - от 0,5 мм (на слуховой перепонке) до 6 мм (на ладонях и подошвах). В одном квадратном сантиметре кожи содержится около 6 млн. клеток. Сосуды кожи способны вмещать до трети объема циркулирующей крови. Свежая кожа взрослого человека примерно на 60 - 70% состоит из воды. Эпидермис - внешний бессосудистый слой кожи - представлен многослойным плоским ороговевающим эпителием. Его толщина различна и составляет от 34 - 50 мкм на внутренней стороне предплечья, животе и бедре до 900 - 1300 мкм - на подошвах. Он состоит из нескольких десятков слоев клеток, которые объединены в 5 основных (базальный, шиповатый, зернистый, блестящий, роговой). Кроме собственно кератиноцитов в базальном и шиповатом слоях обнаруживаются меланоциты - пигментные клетки, клетки Лангерганса и клетки Гринстейна, а также клетки Меркеля. В иммунной системе кожи на одном «полюсе» взаимодействуют клетки Лангерганса и Т-хелперы, а на другом - клетки Гринстейна и Т- супрессо-ры. Клетки Лангерганса обладают способностью к фагоцитозу и синтезу ряда билогически активных соединений (гамма - интерферон, интерлейкин-1), они оказывают влияние на рост и дифференцировку кератиноцитов. выделяют также мет-энкефалин - эндогенный модулятор боли и стимулятор иммунной системы. Клетки Меркеля обеспечивают нейросенсорную функцию кожи. Эпидермис пронизывают выводные протоки сальных и потовых желез и устья волосяных фолликулов (165, 231, 241).
Источники получения кожи и методика хранения жизнеспособных дермотрансплантатов
Необходимым условием для сохранения физиологических свойств и хорошего приживления дермотрансплантата является его жизнеспособность, которая во многом определяется технологией забора; зависит от выбранного консерванта и метода хранения дермотрансплантата.
Основным источником; для; создания запасов жизнеспособных дермотрансплантатов ишолучения аллогенных кератиноцитов является кадавер-ная кожа. С целью определения возможных сроков ее забора была оценена жизнеспособность кожи в различные сроки после смерти донора. Сотрудниками лаборатории проблем клеточной пролиферации Института биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН был проведен ряд исследований, направленных на определение сроков забора кадаверной жизнеспособной кожи после смерти донора (53). О жизнеспособности кожи судили по жизнеспособности основного типа клеток эпидермиса - кератиноцитов. Для определения их жизнеспособности был использован комплекс методов: культивирование выделенных кератиноцитов in vitro, тест на исключение кератиноцитами красителя- - трипанового синего и оценка синтеза белка по включению меченого лейцина; Кроме этого, для оценки,структуры кожи было применено гистологическое исследование.
Исследования по выращиванию эпидермальных кератиноцитов, выделенных из кожи после различных способов хранения, из кожи от живых доноров и кадаверной кожи, взятой в различные сроки после смерти, позволили выделить четыре основных варианта их культивирования.
Первый вариант характерен для клеток, полученных из кожи живых доноров и является обычным в практике выращивания эпителиальных пластов с целью их последующей трансплантации. Он может быть принят как показатель жизнеспособности кожи. При нормальном росте и развитии культуры наблюдается следующая последовательность формирования многослойного пласта кератиноцитов. На первые сутки после посадки начинается прикрепление клеток к субстрату. Прикрепление посеянных кератиноцитов полностью заканчивается примерно через 48 часов. К этому же сроку формируются мелкие колонии кератиноцитов. На 4-б-е сутки происходит некоторое уменьшение площади уже образовавшихся колоний и открепление части клеток. На 6-7-е сутки роста культура переживает кризис, в течение которого некоторые колонии могут исчезнуть. К 8-10-м суткам начинается, активное увеличение колоний в размерах. К этому времени формируются обширные колонии с активным ростом клеток по периферии. Колонии сливаются? и к 16-20-м суткам образуют многослойный пласт кератиноцитов.
Второй вариант. Формирование культуры происходит не до конца и останавливается на стадии образования колоний. Количество прикрепившихся клеток ко вторым суткам культивирования меньше, как и количество мигрирующих из кусочков клеток. К тому же, часть прикрепившихся кусочков в последующем открепляется. В дальнейшем из оставшихся кусочков формируются немногочисленные колонии - на площади менее 50% поверхности культурального флакона. При последующем культивировании в центре таких колоний образуются зоны некроза, постепенно наступает гибель культуры в течение 7-10 суток.
Такой тип формирования культуры обусловлен низким процентом клеток, способных дать начало образованию колоний. В связи с преобладанием гибели клеток над ростом культуры формирование эпителиального пласта не происходит. Однако при внесении клеток в большей концентрации в результате культивирования может быть получен многослойный эпителиальный пласт.
Третий вариант культивирования характеризуется постепенной гибелью культуры после прикрепления кусочков и миграции из них клеток. После посадки к подложке прикрепляются единичные кусочки. Кератиноциты не способны к пролиферации, стволовых клеток, которые могут делиться и способны дать начало роста культуры, в такой коже очень мало. Уровень жизнеспособности такой кожи крайне низкий.
В четвертом варианте культура кератиноцитов представлена в основном единичными клетками и конгломератами роговых чешуек, не прикреплявшихся к подложке. Такая кожа является нежизнеспособной.
Для того, чтобы дать не только качественную, но и количественную характеристику выживаемости кожи после хранения, необходимо использовать дополнительную оценку жизнеспособности кожи. Для этого применялись.два метода: тест на исключение клетками, красителей (трипановый синий) и определение уровня синтеза белка эпидермальными кератиноцитами.
Для начала определены результаты этих методов для заведомо жизнеспособной кожи, взятой от здорового живого донора. При культивировании получен многослойный пласт кератиноцитов. Количество клеток, не включающих краситель, составило в среднем 87%. Радиоактивность включившегося лейцина на 100 тыс. клеток (имп./ мин) - 2086±212.
Сравнение результатов культивирования эпидермальных кератиноцитов с результатами, полученными при окрашивании клеток трипановым синим, показало наличие корреляции между процентом живых клеток в коже и эффективностью их культивирования (табл.2.1.). Другим методом оценки жизнеспособности кожи было определение уровня синтеза белка эпидермальными кератиноцитами. Однако прогноз выживаемости клеток по уровню синтеза белка может быть менее определенным, чем при оценке жизнеспособности по исключению клетками трипанового синего. В случае, когда при культивировании удавалось получить колонии на площади менее 50% поерхности флакона, уровень синтеза белка кератиноцитами был почти в 4 раза ниже, чем в случае, когда был получен многослойный эпителиальный пласт. Данный метод не может использоваться в качестве основного при оценке жизнеспособности кожи, однако возможно его привлечение как вспомогательного.
Особенности репаративных процессов в длительно незаживающих ранах и трофических язвах
Как уже отмечалось, при анализе отечественных литературных данных возникли определенные сложности в .определении понятий «длительно незаживающая рана» и «трофическая язва».
Большинство зарубежных исследователей в своей практике пользуются исключительно понятием «длительно незаживающая рана». В англоязычной литературе: chronic skin wounds, nonhealing chronic wounds, poorly healing wounds. Это относится к следующим патологическим процессам: трофические язвы нижних конечностей, диабетические язвы, пролежни, незаживающие раны, раны развившиеся на месте травмы или оперативного вмешательства, а также в результате обморожения, термического, химического поражения кожного покрова. Российские морфологи тоже давно объединили понятия «трофическая язва» и «длительно незаживающая рана», так как эти патологии в аспекте клинических проявлений и процессов, происходящих на клеточном и субклеточном уровнях характеризуются наличием хронического воспаления.
Однако исторически сложилось, что для российских клиницистов «трофическая язва» и «длительно незаживающая рана» это разные понятия и основным критерием их деления является временной фактор, по окончании которого длительно незаживающая рана считается трофической язвой. Но здесь нет единого мнения. Некоторые исследователи называют срок 1,5 месяца, другие - 4-6 месяцев. При этом прослеживается тенденция - при употреблении термина «трофическая язва» подразумеваются трофические язвы нижних конечностей на фоне варикозной болезни, а в остальных случаях чаще используется термин «длительно незаживающая рана». Хотя иногда встречается и термин «длительно незаживающая венозная трофическая язва». Можно констатировать, что по настоящее время не определен временной фактор (как наиболее удобный в практике), по окончании которого длительно незаживающая рана считается трофической язвой.
Поэтому, с целью изучения особенностей репаративных процессов у больных с различной длительностью существования раневых дефектов (длительно незаживающими ранами и трофическими язвами) и нормально заживающими кожными ранами был проведен ряд морфологических и иммуноги-стохимических исследований.
Биопсийный материал получали из различных участков раневой поверхности. Исследования проводили до начала лечения, а также на 5-е, 10-е, 15-е сутки после трансплантации криоконсервированных жизнеспособных аллодермотрансплантатов. Количество биопсийного материала, а также глу-бина взятия» биоптата рассчитывались с учетом необходимости получения максимально информативного образца, включающего в себя все слои раны и прилежащие ткани.
Всего было исследовано 112 биоптатов от 29 пациентов, разделенных на основную и контрольную группы, в том числе 89 биоптатов от 23 пациентов с ДНР и ТЯ, составляющих основную группу, и 23 биоптата от 6 пациентов с нормальным заживлением ран, входящих в контрольную группу.
В основной группе по нозологическим формам материал распределялся следующим образом: ТЯ, развившиеся на фоне варикозно-расширенных вен нижних конечностей - 14 наблюдений, ДНР развившиеся после некрэктомии, выполненной по поводу отморожения дистальных отделов нижних конечностей Ш — IV степени — 6, длительно незаживающие послеоперационные раны — 2, ДНР развившаяся на фоне рожистого воспаления - 3.
Следует отметить, что у 44% больных развитие ДНР и ТЯ происходило при наличии тяжелых фоновых и сопутствующих заболеваний - сахарный-диабет, гормонозависимая бронхиальная астма, облитерирующий эндартери-ит сосудов нижних конечностей, ревматический полиартрит, алиментарное общее истощение. Возраст больных был от 18 до 87 лет; женщины в основной группе-составляли - 56% (14 больных), мужчины - 44% (11 больных). Длительность существования раневых дефеїстов у больных основной группы колебалась в пределах от 1 месяца до 15 лет (в большинстве случаев - 1,5 — 2 года).
В качестве контроля использовались биоптаты нормально заживающих послеоперационных кожных ран. Биопсии получали в соответствующие сроки: острая операционнаярана, а также на 5-е, 10-е и 15-е сутки. Размеры био-птатов и глубина взятия материала обеспечивали получение информативных образцов, содержащих все слои-раны и прилежащие ткани. Возраст больных контрольной группы был от 30 до 55 лет, мужчины и женщины были представлены в равном соотношении (50% : 50%).
Для исследования биоптаты доставляли в стерильном, охлажденном - (+4G) физиологическом растворе через 2-3 часа с момента взятия. Часть полученного-материала-использовали для-изготовления полутонких срезов; которые окрашивали метиленовым синим - азуром П и основным фуксином. Из другой части приготовлялись криостатные срезы. Иммуногистохимиче-ские реакции проводили по стандартному стрептавидин — биотин - перокси-дазному методу с использованием моно- и поликлональных первичных антител.
В исследовании использовались первичные антитела, характеризующие: -компоненты внеклеточного матрикса - интерстициальные коллагены I и Ш типов; фибронектин (клеточно-ассоциированная и плазменная формы); тенасцин (компонент незрелого ВКМ); мерозин (Ламинин-2);
Результаты применения криоконсервированных жизнеспособных аллодермотрансплантатов в местном лечении длительно незаживающих ран
К длительно незаживающим ранам (ДНР) относили те раны, которые образовались в результате внешнего воздействия (механические, термические, химические повреждения) или оперативного вмешательства, с низкой тенденцией к самостоятельному заживлению, существующие в сроки до 3 месяцев. С использованием криоконсервированных жизнеспособных аллодермотрансплантатов проведено лечение 57 больных, в возрасте от 20 до 79 лет. Из них мужчин было 30 человек, женщин - 27 (I основная группа, I-O). Причинами возникновения ДНР чаще всего были: рожистое воспаление (некротические формы) 19 пациентов- - 33,3%, отморожения конечностей -22,8%. Оставшиеся 43,9% составили пациенты с длительно незаживающими ранами вследствие скальпированных ран, ожогов, некрэктомий. Основная локализация раневых дефектов была в средней и нижней трети голени - 77,8%, это связано с анатомо-физиологическими особенностями данной области и представленной патологией. Контрольную группу составили 50 пациентов, сопоставимые по этиологии, длительности заболевания и площади раневого дефекта (1-К). Первоначальная площадь ДНР составила в основной группе 33,0+3,5 см , в контрольной - 35,5+3,6 см". При распределении по возрасту большинство больных было в возрасте от 40 до 59 лет. Как правило, у больных имелись сопутствующие заболевания. Чаще всего это были сахарный диабет, сердечно-лёгочная недостаточность, гипотрофия, лимфовенозный стаз в зоне раны, анемия. Всем больным проводили комплексную консервативную терапию в соответствии с основным заболеванием и общесоматической патологией: Микробная обсемененность ран у больных до начала лечения находи- с о лась в пределах от 10J до 10 в 1 г ткани, в 87,5 % наблюдений микрофлора была представлена в виде монокультуры. Все микроорганизмы отличались высокой антибиотикорезистентностью, распределение, в зависимости от чувствительности к антибиотикам, представлено в табл. 2.7., качественный состав микрофлоры - в табл.4.1. (совместно для пациентов с ДНР и ТЯ). Края ран у большинства больных были неправильных очертаний, с отечными краями. Дно выполнено бледными, вялыми грануляциями и час тично гнойно-некротическими массами. Отделяемое серозно-гнойное, обильное. В области ДНР наблюдались явления алколоза. В начале лечения рН ран составлял в среднем 7,8 + 0,4. Кожа вокруг ДНР гиперемирована, отёчна, на ощупь несколько теплее окружающих тканей. Она малоподвижна или фиксирована глубжележащими тканями, местами мацерирована. Отме- чался выраженный болевой синдром в области раны. При гистологическом исследовании ДНР представлена незрелой грануляционной-тканью и воспалительным инфильтратом, содержащим, в основном, лимфогистиоцитарные элементы (рис 4.1- А.) Показанием к использованию аллогенной кожи являлась низкая тенденция к заживлению ДНР на фоне проводимого лечения. После очищения ДНР от основного массива некротизированных тканей производили пластику криоконсервированных жизнеспособных аллодермотрансплантатов по разработанной методике. Большинство пациентов, 83,4% основной группы уже через 3-4 часа после пластики отмечало значительное снижение болевого синдрома, поэтому назначение анальгетиков производили только 25% больных. Из-за выраженного болевого синдрома назначение анальгетиков производилось у 88% больных контрольной группы. У пациентов I основной группы при перевязке уже на первые сутки после пластики криоконсервированных жизнеспособных аллодермотрансплантатов отмечалось значительное уменьшение отека, гиперемии, раневого отделяемого, достоверный сдвиг рН В Щелочную сторону, до 6,7+0,3, снижение болевого синдрома и улучшение общего самочувствия. У больных основной группы-на 2-3 сутки после пластики грануляции становились более яркими, края раны становились менее отечными, появлялась краевая эпителизация. Необходимо отметить, что на 3-4 сутки после трансплантации у части аллодермотрансплантатов (50%) наблюдалась частичная отслойка эпидермиса, который снимался в виде тонкой серовато-белой пленочки. Отделяемое скудное, серозное. У больных I контрольной группы в эти сроки сохранялся отек конечности, выраженный болевой синдром, гиперемия окружающих тканей. Количество и рН раневого отделяемого были без динамики, грануляции вялые, бледные. У 19 пациентов (21,1%) I основной группы на 4-5 сутки происходил частичный лизис аллодермотрансплантатов, в основном находившихся на учасках некрозов. Этим больным на следующие сутки производилась повторная пластика криоконсервированных жизнеспособных аллодермотрансплантатов на эти участки. Но на месте лизировавшихся участков аллодермотрансплантатов имелась выраженная положительная динамика - очищение раны, развитие нормальных грануляций и появление признаков краевой эпителизации. У 47 больных I основной группы 82,4%, на 5-7 сутки после пластикиаллодермотрансплантата происходило уменьшение ран за счет краевой эпителизации, существенного уменьшения отека конечности. Болевой синдром отсутствовал или был незначительным. Отделяемое скудное, серозное. Грануляции более яркие, мелкозернистые. При гистологическом исследовании определяется созревающая грануляционная ткань - большое количество полнокровных сосудов со скоплением клеток воспалительного инфильтрата вокруг. Образование внеклеточного матрикса преимущественно впериваскулярнойзоне (рис4.1-Б.). Цитологическое исследование выявило, что в основной группе через 5 суток лечения в мазках отпечатках на фоне полиморфоядерных лейкоцитов-возникают клеточные элементы грануляционной ткани: гистиоциты, макрофаги, фибробласты. Для больных первой основной группы смена- дегенеративно-воспалительного типа цитограммы воспалительно-регенеративным происходила, в среднем, через 5 суток, что вдвое быстрее, чем в контрольной группе. У больных I контрольной группы в сопоставимые сроки сохранялся выраженный отек конечности, болевой синдром выраженный, сохраняется гиперемия окружающих тканей. Отделяемое обильное, серозно-гнойное. Объем и рН раневого отделяемого без динамики. В течение первых 10-12 суток после пластики криоконсервированных жизнеспособных аллодермотрансплантатов, в I основной группе еще у 12,4% больных, происходил частичный лизис аллодермотрансплантатов, но значительного изменения рН при этом не происходило.
