Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Современные взгляды на патогенитические механихмы, течение, прогноз и методы лечения трофичеких язв нижних конечностей венозной этиологии (обзор литературы) 11
1.1. Лечение ТЯ нижних конечностей - актуальная проблема клинической хирургии 11
1.2.История вопроса 13
1.3. Анатомические и патофизиологические предпосылки возникновения трофических язв 16
1.4. Классификация хронической венозной недостаточности и трофических язв нижних конечностей 28
1.5. Диагностика хронической венозной недостаточности и трофических язв 35
1.6. Лечение трофических язв 38
1.7. Применение клеточных продуктов в клинической практике 48
Глава И. Материалы и методы исследования 62
2.1. Общая характеристика пациентов 62
2.2. Исследование состояния сосудистого русла и определение стадии хронической венозной недостаточности 62
2.3. Макроморфологическая оценка язвенного дефекта и оценка микробробного пейзажа трофической язвы 64
2.4. Оценка результатов бактериологического анализа отделяемого из трофической язвы 67
2.5. Оценка воспалительных изменений и репаративных процессов в зоне трофической язвы 67
2.6. Способ получения и методика пересадки на трофические язвы клеточных продуктов
2.7 Методы математического анализа 79
Глава III. Результаты первичного обследования пациентов с трофическими язвами венозного генза 84
Глава IV. Результаты первичного курса лечения пациентов с трофическими язвами как этап подготовки к пересадке клеточного материала 93
Глава V. Результаты лечения пациентов с трофическими язвами с применением клеточных продуктов 100
Глава VI. Анализ результатов проведенного исследования по
Заключение 137
Выводы 145
Практические рекомендации 146
Список литературы 148
- Анатомические и патофизиологические предпосылки возникновения трофических язв
- Применение клеточных продуктов в клинической практике
- Исследование состояния сосудистого русла и определение стадии хронической венозной недостаточности
- Способ получения и методика пересадки на трофические язвы клеточных продуктов
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Трофические язвы (ТЯ) нижних конечностей - проблемное и наиболее часто встречаемое осложнение варикозной болезни (ВБ) и хронической венозной недостаточности (ХВН). (Саркисов Д.С., Алексеев А.А.с соавт., 1996; Савельев B.C. с соавт., 2000; Rucley C.V., 1997; Burton C.S., 2001).
Существующие на сегодняшний день методы консервативного лечения ТЯ, сочетающие системную фармакотерапию и местное воздействие на язвенный дефект не позволяют в 76% случаях достичь позитивного результата — эпителизации трофической язвы. (Кириенко А.И. 2000). Несмотря на внедрение в клиническую практику современных фармакологических препаратов, раневых покрытий, различного функционального назначения, частота выявления трофических язв остается постоянной, и в последнее десятилетие прослеживается явная тенденция к омоложению данного контингента больных (Савельев B.C. 2001, Ruckky С. V., 1997). Эффективным способом устранения регионарных гемодинамических и трофических нарушений в конечности вызванных ХВН является хирургическое вмешательство (Хохлов A.M. 2002, Бырихин Н.И., Чермакова А.А., 2005), однако, наличие активной трофической язвы, по мнению большинства специалистов, является противопоказанием к операции, в связи с высоким риском развития гнойно-септических осложнений (Хохлов A.M., 1993; Яблоков Е.Г. и соавт., 1999; Седов В.М.,2006). Кроме того, в ряде случаев, проведение оперативного лечения может быть сопряжено с повышенным риском или даже невозможно, в связи с наличием у пациентов тяжелой сопутствующей системной патологии. (Котлукова Т.В., 2000; Магомедов М.М., 2001; Priollet P., Franceschi С, et al., 1994; Raffm В., Bellamy V., et al., 1998).Поэтому до настоящего времени актуальна проблема поиска более эффективных способов заживления ТЯ.
Вышеизложенное заставило флебологов обратиться к методам
заместительной клеточной терапии. Помимо применения клеточных продуктов для восстановления кожного покрова обожженных, описано их применение в лечении пролежней, длительно незаживающих ран, трофические язвы диабетической, нейротрофической и венозной этиологии. В лечении венозных трофических язв использовали выращенные in vitro фибробласты (ФБ), многослойный пласт кератиноцитов (МПКТ), аналог кожи (АК). (Воусе S., et al., 2001; Phillips Т. et al., 2002; Seidman C.E et al., 2003; Hjerppe A., 2004). Пропагандируется использование для заживления ТЯ живого эквивалента кожи - аналога кожи. Данный метод считают современной альтернативой аутодермотопластики, и его применение признано весьма перспективным. (Trent J., et al., 1998; Eaglstein W., et al., 1998; Ballard K., et al., 2000; Brem H. et al., 2000; Veves A. et al., 2001; Vowden K. et al., 2002).
He подвергая сомнению результаты научных изысканий, в доступной нам отечественной и зарубежной литературе мы не нашли аргументированной информации, отражающей преимущества и недостатки заместительной клеточной терапии в сравнении с традиционными подходами. Отсутствуют сведения о методологии и технике пересадки того или иного вида культивированных клеток и их композиций пациентам с трофическими язвами в зависимости от исходной клинико-морфологической ситуации. Не определено место клеточных технологий в общей многокомпонентной структуре лечебного процесса и экономическая целесообразность данного метода. Выше изложенные моменты определили цель и задачи нашего исследования.
Цель исследования
Улучшение результатов и сокращение сроков лечения пациентов с трофическими язвами венозного генеза путем применения различных композиций клеток кожи человека культивированных in vitro.
7 Задачи исследования
Оценить состояние сосудистого русла, микробного пейзажа, характер воспалительных и репаративных изменений в зоне трофической язвы в различные фазы раневого процесса (экссудация, пролиферация)
Определить клинические критерии и сроки готовности язвенного дефекта к пересадке клеточных продуктов.
Разработать методику и технику пересадки различных композиций культивированных клеток кожи человека на трофические язвы, обеспечивающих в кратчайшие сроки оптимальный лечебный эффект и рациональное использование клеточного материала.
Оценить клиническую эффективность, преимущества и недостатки предлагаемого способа лечения в сравнении с традиционными подходами.
Определить показания, противопоказания и сформулировать рекомендации по применению различных композиций культивированных клеток кожи человека в лечении пациентов с трофическими язвами венозного генеза.
Научная новизна
Впервые в клинической практике комплексно и дифференцированно применены многослойный пласт кератиноцитов, фибробласты человека и их комбинации, культивированные in vitro у пациентов с трофическими язвами нижних конечностей вследствие варикозной болезни в сочетании с посттромботической болезнью и хронической венозной недостаточностью.
Впервые разработана методика и техника лечения трофических язв, с применением различных клеточных композиций.
Доказано существенное преимущество предлагаемого способа в сравнении с традиционными подходами в лечении трофических язв венозного генеза. Определены показания к применению того или иного вида клеточного материала в лечебном процессе.
8 Предложена бальная оценка прогноза результатов лечения.
Практическая значимость и внедрение результатов исследования.
Предлагаемый способ лечения позволяет значительно ускорить процесс заживления трофических язв, сократить стоимость и сроки пребывания пациентов в стационаре и в период амбулаторного лечения, а так же позволяет эффективно, в кротчайшие сроки, подготовить больных к хирургическому вмешательству.
Способ лечения трофических язв нижних конечностей с применением клеточных продуктов внедрен в работу хирургических клиник СПбГМА им. И.И.Мечникова, и хирургического отделения ГУЗ МСЧ № 18 Санкт-Петербурга. На базе ГУЗ МСЧ №18 совместно с отделом клеточных культур, института цитологии РАН Санкт-Петербурга создан научно-практический центр для оказания консультативной и лечебной помощи пациентам с трофическими язвами нижних конечностей венозного генеза. Результаты научных исследований используются в лекционном курсе и практических занятиях на кафедре хирургических болезней с курсом детской хирургии СПбГМА им.И.И.Мечникова и курсе подготовки врачей-интернов хирургов Российской ВМедА им СМ. Кирова.
По результатам диссертационного исследования разработаны методические рекомендации для врачей-хирургов, утвержденные на научно-координационном совете СПбГМА им.И.И.Мечникова
Основные положения, выносимые на защиту
1. Пересадка клеточных продуктов не оказывает прямого воздействия на звенья патогенеза хронической венозной недостаточности, однако абсолютная клеточная совместимость культивированного in vitro материала, отсутствие местной воспалительной реакции тканей на пересадку и реакции отторжения после пересадки, а также активная стимуляция репаративных процессов в зоне трофической язвы позволяет
9 считать применение фибробластов, многослойного пласта кератиноцитов и их комбинаций рациональным способом закрытия трофических язв нижних конечностей венозного генеза.
Применение клеточных продуктов существенно сокращает сроки заживления трофических язв в сравнении с традиционными методами лечения и позволяет в оптимальные сроки подготовить пациентов к хирургическому вмешательству.
В случае отказа от операции стойкий положительный эффект лечения и отсутствие рецидива язвы может быть достигнут при проведении комплексной терапии, включающей системную фармакотерапию, физиопроцедуры, эластическую компрессию в сочетании с местным воздействием на трофическую язву в виде пересадки фибробластов, многослойного пласта кератиноцитов человека и их композиций.
Личный вклад автора
Самостоятельно проведен анализ литературы по исследуемой проблеме, собран и проанализирован клинический материал.
Автор лично принимал участие в разработке и осуществлении методики пересадки клеточных продуктов и дальнейшем лечении пациентов. Автор выполнил анализ и статистическую обработку полученных данных.
Апробация работы
Основные положения диссертационного исследования доложены:
на городской научно-практической конференции "Лечение ран и трофических язв с использованием дермального эквивалента и пластов кератиноцитов". (Россия. СПб, 2003).
на международной научно-практической конференции "Проблемы клеточной и тканевой трансплантологии". (Украина. Ивано-Франковск, 2003).
на X хирургическом съезде " Международный хирургический конгресс.
10 Новые технологии в хирургии". (Россия. Ростов-на-Дону, 2005).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 177 страницах машинописного текста и состоит из введения, шести глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, который содержит 283 работ: 169 отечественных и 114 зарубежных авторов. Материалы диссертации содержат 26 таблиц и 42 рисунка.
Анатомические и патофизиологические предпосылки возникновения трофических язв
Для того чтобы полноценно представлять механизм развития трофических расстройств, необходимо понимать анатомо-физиологические особенности строения венозной системы. Работа наших вен - довольно сложный процесс. Чтобы разобраться в этом, необходимы знания о строении вен. Венозная стенка состоит из трех слоев. Внутренний - эндотелий, представлен слоем клеток на соединительнотканной мембране. Средний слой - мышечный, в основном состоит из циркулярно-расположенных гладкомышечных клеток, которые находятся как бы в каркасе из коллагеновых волокон. Поверхностные вены содержат более толстый мышечный слой, чем глубокие. Наружная оболочка вен, так называемая адвентиция, представляет собой плотную ткань из коллагеновых волокон. Если сравнивать строение вен и артерий, то следует сказать, что отношение просвета сосуда к толщине его стенки у вен значительно больше, чем у артерий. В венах гораздо меньше эластических волокон, чем в артериях. Основным свойством вен, так влияющим на показатели кровотока, является большая растяжимость её стенки. В частности, при повышении давления в сосуде вены расширяются и стремятся приобрести круглую форму из щелевидной. Степень растяжимости венозной стенки довольно эфемерная величина и зависит от многих причин. Именно этот фактор не позволяет использовать строгие математические формулы для расчетов движения крови по ним. Толщина венозной стенки в сосудах ног гораздо больше, чем, например на шее. Венозные клапаны происходят из её стенки. Состоят в норме их двух створок, которые ориентированы в сторону сердца. В области прикрепления клапана к стенке, диаметр вены несколько больше. В норме при смыкании створок клапана кровь из вышележащего отдела не может проникнуть в нижележащий. Если это происходит, то такое состояние называется рефлюксом. Понятие рефлюкса тоже неоднозначно. Он может быть относительным, (некоторые его называют физиологическим) и абсолютным. Основное отличие в длительности рефлюкса при проведении функциональных проб. Существует также мнение, что при нормальном клапане никакого рефлюкса быть не должно (Бауэрзакс Ж. и др. 1998). (рисунок 1).
Клапаны по венам распределены неодинаково. Их больше там, где наиболее выражена работа мышечного насоса - то есть на голени. Как же осуществляется движение крови по венам нижних конечностей, какие факторы в этом участвуют? Если рассматривать всю сосудистую систему как U - образный сосуд, то логично предположить, что сокращения мышц сердца должно хватить, чтобы кровь возвратилась к правым его отделам. Однако существование капиллярного русла, в котором осуществляются обменные процессы, не позволяет так думать. Суммарная емкость артериального сосудистого русла в два раза меньше ёмкости вен. Давление в капиллярах понижается во много раз, по сравнению с таковым в левых отделах сердца, и кровь из капилляров должна каким-то образом двигаться против силы гравитации по направлению к правым отделам сердца. Решение этого вопроса у прямоходящего человека интересное и сложное, можно сказать, что оно до конца не изучено. Существует несколько механизмов, благодаря которым кровь оттекает от нижних конечностей. Значительную часть своего времени человек проводит лежа. В этом случае сила тяжести в продвижении крови не мешает. Течение крови осуществляется благодаря дыхательным движениям, существованию постоянного тонуса мышц венозной стенки, постоянному подпору крови из артериального конца капиллярного русла, присасывающему действию правых отделов сердца. В частности при вдохе повышается давление в брюшной полости, закрываются клапаны бедренных вен, нижняя полая вена сдавливается на уровне диафрагмы и повышается давление в самих венах, что ведет к кратковременному застою крови в них. Во время выдоха происходит обратный процесс, и кровь устремляется в вены грудной полости. Гораздо сложнее механизм возврата венозной крови в вертикальном положении. Конечно, те же факторы возврата действуют и здесь, но их влияние очень небольшое. Основное значение приобретает деятельность мышечных образований нижних конечностей. Все люди подвержены неприятным ощущениям застоя крови при длительном неподвижном нахождении в вертикальном положении. Эти ощущения заставляют нас переминаться с ноги на ногу, заставляя работать мышцы ног.
Применение клеточных продуктов в клинической практике
Первое место в использовании клеточных продуктов занимают пациенты с ожоговыми поражениями. Одной из главных проблем лечения больных с обширной ожоговой травмой является закрытие раневых поверхностей. Однако при обширных глубоких ожогах более 30-40 % поверхности тела закрыть все ожоговые раны при помощи лишь одних перфорированных аутодермотрансплантатов невозможно из-за дефицита донорских ресурсов (Киселев СИ. 1971; Матчин Е.Н 1996; МасМШап B.J.1982). Первые данные о хранении человеческой кожи в среде были опубликованы в 1898 году, когда кожные фрагменты были сохранены долгое время в асцитической жидкости и затем пересажены обратно донору. Принципиальная возможность использования для заживления ран аутоклеток кожи, выращенных in vitro была показана еще в сороковых годах в работах профессора зоологии Лондонского университета P.R.Medawar. Однако длительное время исследователям не удавалось получить многослойные пласты аутоклеток, достаточные по площади, способные реально заменить аутодермотрансплантат. Лишь в середине семидесятых Rheinwald J.C.H Green Н. (1975, 1977) удалось разработать метод культивирования клеток эпидермиса - КЦ, позволяющий в течение примерно 3-х недель получить из биоптата кожи в 3-4 см МПКТ в 1000 или даже 10000 раз превышающий первоначальный размер биоптата. В 1980 году Banks-Shlegel и Green Н. опубликовали результаты трансплантации культивированных кератиноцитов человека бестимусным мышам, продемонстрировавшие перспективность выбранного направления. О первом клиническом применении аутокератиноцитов, культивированных по методу J.Rheinwald и H.Green у людей сообщил N.E.O Connor с соавторами в 1981 году в журнале "Lancet". (N.E.O Connor, J.B.Mulletkin et al. 1981). В статье сообщалось об успешном лечении двух больных с ожогами 80 % и 40 % поверхности тела. Метод лечения заключался в хирургической некрэктомии, временном закрытии образовавшихся ран трупной кожей и трансплантации на раневую поверхность через три недели культивированных аутокератиноцитов. В дальнейшем метод стал внедрятся в клиническую практику ведущих ожоговых центров развитых стран мира. (Madden M.R., et al. 1986. Eldad A et al., 1987; Gallico G.G.1990; Compton C, et al. 1993 ;. Fedorov V.D., 1994; Малахов с соавт С.Ф., 1993). Оказалось, что предложенный метод, имеет ряд существенных недостатков - длительность подготовки подложек с аутокератиноцитами непредсказуемое, приживление культивированных клеток эпидермиса в среднем от 20-80 %, а в некоторых публикациях от 0 до 85 % (Herzog S.R.et. al. 1988). Легкая повреждаемость приживших культивированных кератиноцитов, дискератоз, отслоение эпидермиса в виде пузырей, особенно после трансплантации на раны, полностью лишенных дермы. Препятствием для его широкого распространения стала высокая стоимость, так цены на подложки с культивированными аутокератиноцитами кампании Biosurface Technology (США) для одного больного колеблется примерно от 10 до 160 тысяч долларов в зависимости от площади ран. (Кузин М.И. с соавторами 1985; Compton C.C.et al., 1993;.Rue L.W, Cioffi W.G.et al., 1993; Rives J.M., Sellam Ph., Karcenty В., et al. 1994). Имеющиеся недостатки явились причиной дальнейшего научного поиска и исследований. Перспективным направлением оказалось использование аллогенных кератиноцитов. Работы J.M.Hefton с соавторами (Hefton J.M., Amberson J.V.et al. 1981) и V.B.Morhenn с соавторами (Morhenn V.B,.Benike C.V et al. 1982) показали, что кератиноциты, подвергшиеся культивированию, не активизируют главный комплекс гистосовместимости, который, как известно, вызывает наиболее выраженную реакцию отторжения аллоклеток. Основываясь на полученных данных J.M.Hefton с соавторами (Hefton J.M., Finkelstein J., Madden M.R., Shires G.T., 1983) провели первую успешную трансплантацию культивированных аллогенных кератиноцитов трем пациентам с дермальными ожогами.
Метод позволял закрывать раны не дожидаясь трехнедельного срока, необходимого для получения подложек с культивированными аутокератиноцитами, а также создавать банки аллогенных клеток. В дальнейшем, трансплантация аллогенных кератиноцитов вошла в клиническую практику некоторых ожоговых центров в развитых странах мира (Малахов С.Ф.с соавт., 1997; Смирнов С.В.с соавт., 1998; Fratianne R., Рарау F. et al. 1993; Brychta P.P. et al., 1995; Dedovic Z.et al., 1998; Siedler S., Schuller-Petrovic S.2000;). Накопленный клинический опыт показал, что оптимальные результаты получаются при трансплантации аллокератиноцитов на дермальные ожоги и донорские раны с частично сохранившимся эпителием, существенно укорачивая сроки их заживления. Трансплантации на полнослойные раны были менее удачны и, по-видимому, не являются методом выбора при их лечении. Результаты проведенных исследований, направленных на изучение дальнейшей судьбы аллогенных кератиноцитов. (Хотинян В.Ф.,Рудаков Б.Я 1984; Gielen V., Faure М., et al., 1987; Hansbrough J.F. Boyce S.T. et al 1989), в частности при помощи фингерпринтинга ДНК (Vaan A.E.der Merwe et al. 1990) показали, что со временем они элиминируются и постепенно замещаются аутоклетками. На конференции Европейского сообщества по эквивалентам кожи в Лионе в 1989 году была принята общая концепция, согласно которой аллокератиноциты рассматривают как временную биологическую повязку, производящую экстрацеллюлярный матрикс и стимулирующую пролиферацию собственного эпителия больного. Отсутствие дермы при глубоких ожогах обусловило разработку методов ее восстановления, поскольку трансплантация культивированных аутологичных и аллогенных кератиноцитов не решает этой задачи. Для ее решения в настоящее время наметилось два основных направления - использование аллогенной дермы и создания аналога дермы в условиях in vitro.
Исследование состояния сосудистого русла и определение стадии хронической венозной недостаточности
За период с 2002-2006 год под наблюдением в хирургическом отделении ГУЗ МСЧ№18 г.СПб являющегося базой кафедры хирургических болезней СПбГМА им. И.И.Мечникова, завкафедрой д.м.н. проф. Э.Г.Топузов, находились ПО пациентов с ТЯ нижних конечностей венозной этиологии. Пациенты поступали в отделение в плановом порядке из поликлиник и стационаров города.
Распределение больных по возрасту и полу представлены в таблице 1
64 (58,2%) пациентов из числа обследованных имели профессию и место работы,
38 (36,4%) пациентов являлись инвалидами I-II группы.
У всех пациентов наряду с ВБ и ХВН имелись различные сопутствующие системные заболевания (таблица 2).
Длительность заболевания ВБ в сочетании с ХВН у пациентов была различной и в среднем составила 12,9+ 0,6 (от 3 до 32 лет). У пациентов, имеющих ХВН, развившуюся на почве 1ПФС длительность заболевания составила 17+1,0 (от 8 до 32 лет).
Исследование состояния сосудистого русла и определение стадии ХВН Для оценки состояния сосудистого русла использовались методики общего осмотра, а также инструментального, прежде всего данные ультразвукового обследования, а при необходимости пациентам выполнялись контрастные методы диагностики (флебография). При поражении обеих нижних конечностей оценка состояния подвздошных вен была затруднена. В этих случаях прибегали к дуплексному сканированию или к флебографии. По итогам обследования оценивали состояние клапанного аппарата и наличие ретроградного кровотока. В системе большой подкожной вены и глубоких вен конечностей. При дуплексном сканировании визуализировались пристеночные тромбы, утолщение стенок сосудов и их ригидность. У всех пациентов также оценивали состояние клапанного аппарата перфорантных вен в зоне трофической язвы.
Для определения стадии ХВН использовали классификацию СЕАР. Эта классификация предполагает учет клинических (Clinical), этиологических (Etiological), анатомических (Anatomical) и патофизиологических (Patophysiological) факторов, принятую ,щя применения в клинической практике экспертами международной согласительной группы на международном конгрессе флебологов в 1994 году в Лондоне (см.стр.29).
Характеризуя состояние и особенности язвенного дефекта, учитывали: -длительность существования язвы; - площадь дефекта при первичном обращении пациента и на этапах лечения. Определение площади язвы, имеет большое значение для выработки хирургической тактики при лечении ТЯ, т.к. позволяет оценить динамику заживления и эффективность лечения. Мы в своей работе использовали методику, разработанную в институте им Вишневского (Хотинян В.Ф., 1984), заключающуюся в измерении периметра раны с вычислением площади по формуле:
(для ран близких к квадрату - 1,013; для ран с неправильными контурами -0,62); С - константа (для ран близких по форме к квадрату - 1,29, для язв с неправильным контуром - 84,34).
анализировали способы лечебного воздействия, включая хирургический, применённый пациентам на догоспитальном этапе.
Мы не регистрировали язвы одиночные и множественные при наличии двух и более язв или циркулярной язвы, считали общую площадь язвенного поражения.
При поступлении всем пациентам проводилось бактериологическое исследование язвенных дефектов с определением вида микрофлоры, степени бактериальной обсемененности раневой поверхности.
Забор материала осуществлялся при соблюдении правил асептики. При взятии материала кожу вокруг раны предварительно обрабатывали 70% спиртом или другим антисептиком, некротические массы, детрит и гной удаляли стерильной салфеткой. Забор материала стерильным тампоном производят круговым вращательным движением от центра к периферии поверхности язвы. Материал брали двумя тампонами, один из которых помещали в пробирку (№1) с 3 мл изотонического раствора хлорида натрия и использовали в дальнейшем для микроскопии и посева на аэробную и факультативно-анаэробную флору, а другой - в пробирку (№2) с транспортной средой для анаэробов или в пробирку, заполненную азотом; С02 или трехкомпонентной газовой смесью. (Колкер И.И., Кузин М.И., Костючек Б.М 1980).
Не более чем через один час после взятия весь материал доставляли в микробиологическую лабораторию для немедленного посева, (бактериологическая лаборатория НУЗ «Дорожная клиническая больница» ОАО « Российские железные дороги») Микроскопия исследуемого материала. а) для приготовления мазка материал на тампоне в пробирке №1 суспензировали в течение 5 минут, а затем наносили оставшийся на тампоне материал на стерильное предметное стекло, окрашивали по Грамму и микроскопировали под иммерсией. При микроскопии мазков отмечали морфологию, количество микроорганизмов, окраску по Грамму. б) производили посев полученной взвеси из пробирки №1 пипеткой по 0.1 мл на твердые питательные среды: 5% кровяной агар, среду Эндо, среду Сабуро, растирая по поверхности шпателем, и среду обогащения — сахарный бульон. При отсутствии видимого роста высев с сахарного бульона производили после 18-20 часов инкубации. Из пробирки №2 производили посев на питательные среды, обеспечивающие рост облигатных анаэробов: спорообразующих - в 2 пробирки со средой Китт-Тароцци и 1- со средой Вильсон -Блера II, аспорогенных - в тиогликолевую среду с налидиксоновой кислотой и тиогликолевую среду с канамицином и желчью. При посеве пипетку с исследуемым материалом опускали на дно пробирки, не допуская попадания пузырьков воздуха в среду. Для выделения спорообразующих вегетативных форм аэробов и анаэробных микроорганизмов одну из пробирок со средой Китт-Тароцци прогревали на водяной бане 20 минут при 80 С. Все посевы инкубировали при 37С. в) через 18-20 часов производили просмотр посевов на чашках с кровяным агаром, средой Эндо (культивируемых в аэробных условиях). Проводили изучение морфологических свойств выросших на чашках бактерий, а также подсчитывали их количества (отдельно каждого морфологического типа). Производили расчет количества клоннообразующих единиц на тампон. Для этого число колоний каждого типа умножается на 30.
Способ получения и методика пересадки на трофические язвы клеточных продуктов
Полученные в процессе исследования данные обрабатывались на ЭВМ типа IBM-PC с помощью программной системы STATISTICA for Windows (версия 5.11). Данная система является интегрированной средой статистического анализа и обработки данных. Она осуществляет все расчеты по стандартным формулам математической статистики, используя только существующие, измеренные данные (все пропуски исключаются из расчетов и неучитываются при формировании выводов). STATISTICA (Боровиков В.П, Боровиков И.П. 1997. Боровиков В. П., 2001., Реброва О.В. 2002) позволяет выполнить все классические виды анализа по предельно широкому набору конкретных алгоритмов и методов, адекватных задачам исследования и специфике полученных сведений.
NB! Массив исходных данных по нашей работе, характеризующих состояние пациентов с варикозными язвами, которые были пролечены как традиционным способом, так и по предлагаемой нами технологии, состоял из показателей, полученных на различных этапах слежения за ходом лечения. Он был подготовлен так, что можно было сопоставлять весь имеющийся набор сведений в группах, формируемых по любым качественным и количественным показателям, в том числе и полученным в процессе анализа.
В соответствии с целями и задачами исследования, а также с учетом специфики анализируемых переменных (Боровиков В.П., Боровиков И.П. 1997. Сергиенко В.И., Бондарева И.Б. 2000) нами выполнялись: - построение и визуальный анализ графиков и диаграмм разброса данных;
- определение типов распределений данных, прежде всего на соответствие требованиям нормальности;
- построение гистограмм разброса данных;
- расчет частотных таблиц как одномерных, так и многоуровневых;
- расчет элементарных статистик (средние значения, ошибки средних, среднеквадратические отклонения, размах разброса данных);
- построение и визуальный анализ корреляционных полей связи между анализируемыми параметрами;
- расчет корреляционных матриц на основе линейной корреляции и непараметрических методов;
- сравнение частот характеристик (пол, наличие инфаркта, сопутствующей патологии и т.п.) проводилось с помощью непараметрических методов % , X с поправкой Иетса, критерия Фишера;
- сравнение количественных показателей (временные параметры заболевания, площадь язвенного дефекта, бакобсемененность и др.) в исследуемых группах, формируемых по необходимым для решения конкретных задач критериям, выполнялось с использованием критериев Манна-Уитни, медианного хи-квадрат и модуля ANOVA.
- сравнение количественных показателей в исследуемых группах на разных этапах исследования выполнялось с использованием критериев Вилкоксона и знаков.
С целью обоснования комплекса показателей, необходимых для оценки риска неблагополучного исхода лечения, мы использовали метод построения классификационных деревьев. Этот способ позволяет решать задачи "добычи данных" (Дюк В.А., 2001), т.е. отыскивать новые сведения об исследуемой проблеме. Деревья классификации способствуют определению принадлежности наблюдений или объектов к тому или иному классу категориальной результирующей переменной в зависимости от соответствующих значений одной или нескольких предикторских переменных, т.е. показателей, которые можно считать причинами исследуемого явления. В нашей работе мы выявляли показатели и их пороговые значения для формирования комплекса критериев, согласующихся с конечным результатом лечения — эпителизацией язвы.
Цель построения деревьев классификации заключается в предсказании (или объяснении) значений категориальной зависимой переменной. Построенное дерево классификации дает основания для формулирования решающих правил, на основе которых можно эффективно рассортировать как имеющиеся, так и будущие наблюдения. Другая отличительная черта метода деревьев классификации - это присущая ему гибкость. Классификационные деревья позволяют последовательно изучать эффект влияния отдельных переменных. Есть еще целый ряд причин, делающих деревья классификации более гибким средством, чем традиционные методы анализа. Способность деревьев классификации выполнять одномерное ветвление для анализа вклада отдельных переменных дает возможность работать с предикторными переменными различных типов. Методы анализа с помощью деревьев классификации можно охарактеризовать как набор иерархических, чрезвычайно гибких средств предсказания принадлежности наблюдений (объектов) к определенному классу значений категориальной зависимой переменной по значениям одной или нескольких предикторных переменных. В процессе построения иерархической системы решающих правил определяется также важность (приоритетность) параметров, участвующих в алгоритме.
Деревья классификации идеально приспособлены для графического представления, поэтому сделанные на их основе выводы гораздо легче интерпретировать, чем, если бы они были представлены только в числовой форме. Наиболее важными отличительными свойствами деревьев классификации является их иерархичность и широкая применимость, т.к. на способ измерения предикторской переменной накладываются гораздо более слабые ограничения, чем, например, в дискриминантном анализе. В качестве потенциальных признаков классов использовались все имеющиеся показатели, описывавшие состояние пациентов, как до начала лечения, так и в стадии пролиферации. Для выявления факторов, позволяющих оценивать риск процесса эпителизации в нашем исследовании нами получены результаты при использовании алгоритма CART (полный перебор всех возможных вариантов одномерного ветвления) для задания типа ветвления, меры хи-квадрат Бартлетта для измерения критерия согласия и алгоритма FACT для выбора момента прекращения дальнейшего ветвления (Боровиков В.П, 2001). При других вариантах типов ветвления, критериев согласия и выбора момента прекращения ветвления результаты отличались настолько незначительно, что это не влияло на диагностические характеристики получаемых в итоге алгоритмов. Данное обстоятельство позволяет говорить о высокой устойчивости полученных результатов. При этих же вариантах построения классификационных деревьев мы получили решающие правила для оценки риска.
Для визуализации структуры исходных данных и полученных результатов их анализа, мы использовали как графические возможности системы Statstica for Windows, так и модуль построения диаграмм системы Microsoft Office. Для представления частотных характеристик признаков были построены столбиковые диаграммы. Количественные показатели в различных исследуемых подгруппах для полноты описания и удобства восприятия и сравнения мы представили в форме «Box & Whisker Plot», когда на одном поле при различных группировках на основе качественных критериев отражены среднее значение, ошибка среднего и стандартное отклонение для указанного параметра.
