Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. «Окно имплантации» эндометрия нормального менструального цикла 12
1.2. Бесплодие. Вспомогательные репродуктивные технологии 24
1.3. Эндометрий при бесплодии 28
Глава 2. Материал и методы исследования 40
2.1. Клиническая характеристика материала 40
2.2. Гистологическое исследование 42
2.3. Иммуногистохимическое исследование 43
2.4. Электронномикроскопическое исследование 44'
2.5. Количественная обработка материала 45
Глава 3. Результаты собственных исследований 47
3.1. Клиническая характеристика пациенток с бесплодием 47
3.2. Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика «окна имплантации» эндометрия в группе сравнения 57
3.2.1 Гистологическая характеристика «окна имплантации» эндометрия в группе сравнения 57
3.2.2 Иммуногистохимическая характеристика «окна имплантации» эндометрия в группе сравнения 59
3.2.3 Ультраструктурная характеристика поверхности нормального эндометрия в период «окна имплантации» 65
3.3. Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика эндометрия в период ожидаемого «окна имплантации» при бесплодии 68
3.3.1. Гистологические особенности «окна имплантации» эндометрия при бесплодии 68
3.3.2. Рецепторы к стероидным гормонам при бесплодии в период ожидаемого «окна имплантации» 74
3.3.3 Фактор пролиферации - белок КІ67 в эндометрии при бесплодии в период ожидаемого «окна имплантации» 92
3.3.4 Белки, регулирующие клеточный цикл — Р27 и циклин Е в эндометрии при бесплодии в период ожидаемого «окна имплантации» 99
3.3.5. Ультраструктурные особенности эндометрия при бесплодии в период ожидаемого «окна имплантации» 109
Глава 4. Обсуждение результатов и заключение 112
В ыводы 132
Практические рекомендации 135
Список литературы
- Бесплодие. Вспомогательные репродуктивные технологии
- Иммуногистохимическое исследование
- Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика «окна имплантации» эндометрия в группе сравнения
- Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика эндометрия в период ожидаемого «окна имплантации» при бесплодии
Введение к работе
Бесплодие представляет собой важную медико-социальную проблему. По данным ВОЗ бесплодными являются почти 15% супружеских пар (В.И. Кулаков, Т.В. Лопатина, 2006), что является критическим уровнем воспроизводства населения, причем ведущую роль в структуре бесплодия играет женский фактор (И.В. Корнеева, Т.В. Лопатина, 2006). К сожалению, эти показатели не имеют тенденции к снижению. Многим бездетным супружеским парам показано применение вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), в том числе — программ экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) (Б.В. Леонов, В.И. Кулаков, 2004). Однако эффективность методов искусственного оплодотворения до сих пор составляет лишь 10 — 15% на одну попытку (А.П. Лазарев, 2006). Таким образом, поиск причин и разработка методов повышения эффективности ВРТ является одной из актуальных задач современного российского здравоохранения, что отражено в национальном проекте «Здоровье» (Протокол №2 от 21 декабря 2005 г. Президиума Совета при Президенте РФ; Приказ Минздрава РФ № 220 от 29 марта 2006 г.). Решение этой проблемы имеет большое медицинское, социальное и демографическое значение.
Роль патологии эндометрия в патогенезе бесплодия несомненна. Ведь именно адекватное морфофункциональное состояние эндометрия является одним из основных факторов, обеспечивающих успешную имплантацию оплодотворенной яйцеклетки и развитие эмбриона. По данным ряда исследователей более чем у половины пациенток, включенных в программы ЭКО, наблюдаются заболевания эндометрия (Oliveira F.G. et al., 2003; Hinckley M.D., Milki A.A., 2004), а, согласно B.C. Корсак и соавт. (2005), патология эндометрия обнаруживается у 73,7% пациенток с трубно-перитонеальной формой бесплодия.
По действующему регламентирующему документу (приказ Минздрава РФ № 67 от 26 февраля 2003 г.), проведение гистероскопии и биопсии эндометрия не входит в обязательное обследование всех пациенток с бесплодием. По мнению А. В. Кузьмина и соавт. (2004) исследование биоптатов эндометрия необходимо только в случае неудачи первой попытки ЭКО. Но существуют не менее авторитетные данные о том, что проведение гистологического исследования представляется целесообразным у всех пациенток с бесплодием, так как выявление и лечение патологии эндометрия является непреложным условием для повышения эффективности ВРТ (И.Е. Корнеева, Т.В. Лопатина, 2006).
Поскольку для успешного наступления беременности решающее значение имеет состояние эндометрия в 7-10 постовуляторные дни (ПОД), соответствующие 21-24 дням «классического» 28-дневного менструального цикла, особое внимание уделяют морфологической оценке эндометрия именно в этот период, часто называемый «окном имплантации» (Mazur М.Т., Kurman R.J., 2005; Cram С.Р:, Hornstein M.D., 2006 и др.). Для этого, кроме; рутинного гистологического исследования соскобов и биоптатов, в последние годы с разным успехом применялись многочисленные (иммуногистохимические) ИГХ маркеры, в том числе: КІ67, PCNA, MUK1, LIF, MAG, Р27, циклин Е и другие (Pickartz Н. et al., 1990; Li S., Nakayama К. et al, 1993; Hey N.A., Li T.C. et al., 1995; Kliman H.J. et al., 1995; Cullinan E.B. et al., 1996; Lessey B.A., Castelbaum A.J. et al., 2000; Ordi J., Creus M. et al., 2002; Dubowy R.L. et al., 2003 и др.). Особое место в этом ряду занимают показатели рецепции к стероидным гормонам. Но даже в «окне имплантации» естественного цикла данные о показателях стероидной рецепции отличаются у разных исследователей, что во многом связано с использованием различных систем количественной оценки (И.И. Евдоченко, 2004; СЮ. Ншанян, 2004; Acosta А.А. et al., 2000 и др.). Это в еще большей степени относится к сведениям о стероидной рецепции при различных типах и факторах бесплодия. Стероидная рецептивность эндометрия в нормальном цикле находится в тесной связи с гормональным фоном. В течение менструального цикла эстрадиол усиливает синтез всех стероидных рецепторов, тогда как прогестерон подавляет и синтез собственных рецепторов, и синтез рецепторов к эстрогенам (ЭР) (Б.В. Розен, А.Н. Смирнов и соавт., 1981; И.И. Евдоченко, 2004; В.Н. Ковязин, 2005; Fleming Н., Gurpide Е. et al., 1980; Develioglu О.Н. et al., 1999). Состояние рецепторного аппарата эндометрия в условиях гормональной терапии и применения схем стимуляции суперовуляции у женщин, участвующих в циклах ЭКО, является отражением сложных и многофакторных процессов. С одной стороны, гормональные препараты оказывают существенное влияние на систему рецепторов. С другой — нарушения в рецепторном аппарате могут привести к недостаточной восприимчивости эндометрия к экзогенному гормональному воздействию (Acosta А.А. et al., 2000; Crum СР., Hornstein M.D., 2006). В то же время, сведения о соотношениях между концентрациями гормонов в крови и показателями экспрессии рецепторов к эстрогенам (ЭР) и прогестерону (ПР) при бесплодии противоречивы и фрагментарны (Tuckerman Е. et al., 2004).
Важным показателем полноценности «окна имплантации» является пролиферативная активность эндометрия, основным маркером которой является белок КІ67. Экспрессия КІ67 повышается под влиянием эстрогена и снижается под действием прогестерона и в норме тесно коррелирует с экспрессией ЭР и ПР (Mertens HJ. et al., 2002, Taylor et al., 2005). Известны некоторые особенности экспрессии белка КІ67 в эндометрии при поликистозе яичников, при эндометриозе, при гиперпластических процессах эндометрия (Pickartz Н. et al., 1990, Li S. et al., 1993, Maia HJr. et al., 2004, Zhang E.H. et al., 2006, Lian F. et al., 2007). Но систематические сведения о пролиферативной активности в эндометрии при бесплодии, его различных формах и факторах, отсутствуют.
Гораздо менее изучена экспрессия в эндометрии белков Р27 и циклина Е, которая также находится под влиянием стероидных гормонов. R.L. Dubowy и соавт. (2003) и SXahav-Baratz и соавт. (2004) изучали Р27 и циклина Е в течение нормального менструального цикла и при стимуляции овуляции перед ЭКО. Однако детальное изучение экспрессии этих белков при различных формах бесплодия и при различной патологии эндометрия не проводилось.
Как один из показателей полноценности «окна имплантации» отмечают поверхностную ультраструктуру эндометрия. В этот период на поверхности клеток появляются характерные выросты цитоплазмы — пиноподии (Develiogiu О.Н. et al., 1999, Acosta А.А. et al., 2000). По данным ряда исследователей развитие пиноподии находится под контролем тех же гормональных механизмов, что и стероидная рецептивность эндометрия (Martel D. et al., 1991). По мнению G. Nikas и соавт. (1995; 1997) изучение поверхностной ультраструктуры эндометрия дает возможность согласовать время подсадки эмбриона с периодом максимального развития пиноподии и позволяет повысить шансы на успешную имплантацию. Но,, в целом, сведения- о поверхностной, ультраструктуре эндометрия при бесплодии весьма фрагментарны.
Таким образом, целостной морфологической и иммуногистохимической характеристики эндометрия при бесплодии, его разных типах и факторах пока не существует. Изучения также требуют многие клинико-морфологические и лабораторно-морфологические корреляции. В то же время, эти данные имеют большое теоретическое, диагностическое и прогностическое значение. Все вышесказанное обусловливает актуальность работы в данном направлении и позволяет обозначить цель и задачи исследования.
Цель исследования: представить морфологическую характеристику эндометрия при первичном и вторичном бесплодии и при различных факторах бесплодия; оценить диагностическое и прогностическое значение комплексного гистологического, иммуногистохимического и ультраструктурного исследования эндометрия- при подготовке к лечению методами вспомогательных репродуктивных технологий.
Задачи исследования
1. Изучить а- и (3-эстрогеновую и прогестероновую рецепцию, экспрессию белков Р27 и циклина Е, пролиферативную активность и поверхностную ультраструктуру эндометрия периода нормального «окна имплантации».
2. Изучить патологию эндометрия в соскобах и биоптатах у пациенток с первичным и вторичным бесплодием и с различными факторами бесплодия.
3. Оценить экспрессию рецепторов к эстрогенам а и 3 и к прогестерону в эндометрии во время предполагаемого «окна имплантации» у пациенток с первичным и вторичным бесплодием, различными факторами бесплодия и различной патологией эндометрия, сопровождающей бесплодие.
4. Исследовать экспрессию фактора пролиферации белка КІ67, белков Р27 и, циклина Е, регулирующих клеточный цикл; в эндометрии во время? предполагаемого «окна имплантации» у данного контингента пациенток.
5. Исследовать особенности поверхностной ультраструктуры эндометрия, у пациенток с бесплодием.
6. Оценить соотношения между морфологическими и иммуногистохимическими проявлениями в эндометрии, клиническими типами и факторами бесплодия, показателями гормонального статуса.
7. Определить значение и место комплексного морфологического исследования эндометрия в алгоритме обследования пациенток в рамках программ ВРТ.
Научная новизна. Получены новые данные о патологии эндометрия и рецепции к стероидным гормонам в период предполагаемого «окна имплантации» при первичном и вторичном бесплодии и при различных факторах бесплодия. Патология эндометрия (хронический эндометрит, гиперпластические процессы эндометрия, недостаточность лютеиновой фазы) выявлена у всех обследованных пациенток с бесплодием, без существенных различий при первичном и вторичном его типах. Выявлены очевидные отличия нозологического спектра в подгруппах с различными факторами бесплодия. Существенные изменения в экспрессии эстрогеновых рецепторов а и прогестероновых рецепторов обнаружены у пациенток с разными факторами бесплодия и при различной патологии эндометрия, сопровождающей бесплодие. Показана разная степень выраженности повреждения стероидной рецепции в железах и в строме эндометрия.
Впервые получены количественные данные об экспрессии эстрогеновых рецепторов (3. Снижение их количества при бесплодии и выраженные отличия при различной патологии эндометрия могут отражать роль эстрогеновых-Р рецепторов в патогенезе бесплодия.
Получены новые сведения о пролиферативной активности, регуляции клеточного цикла и поверхностной ультраструктуре эндометрия при бесплодии. Различия экспрессии белков КІ67, Р27 и циклина Е при различных факторах бесплодия объективно отражают неадекватность регуляции клеточного цикла и пролиферативных процессов: Степень отклонения показателей от нормы во многом связана с особенностями нозологического спектра. У всех пациенток с бесплодием и различной патологией эндометрия, сопровождающей его, отмечены существенные дефекты в развитии пиноподий.
Практическая значимость.
Полученные сведения о гистологических, иммуногистохимических и ультраструктурных особенностях эндометрия при бесплодии представляются важными для патологоанатомической диагностики и гинекологической практики. Данные об экспрессии стероидных рецепторов, белков, регулирующих клеточный цикл, и о развитии пиноподий представляют собой важные диагностические признаки, позволяющие на новом уровне формулировать патологоанатомические заключения по биопсийному материалу и соскобам эндометрия.
Результаты исследования открывают новые аспекты в традиционных клинических классификациях и, соответственно, в создании групп пациенток с учетом морфологического и иммуногистохимического исследования биоптатов и соскобов эндометрия. Это дает возможность более точно контролировать эффективность гормонального лечения, обеспечить индивидуальный подход к пациентке, а, следовательно, оптимизировать схемы гормональной терапии.
Установленные морфологические и иммуногистохимические особенности эндометрия подчеркивают значимость и необходимость комплексного исследования соскобов и биоптатов в алгоритме обследования пациенток в плане подготовки к лечению бесплодия методами ВРТ.
Результаты исследования могут быть использованы в педагогическом процессе в соответствующих разделах курсов патологической анатомии и гинекологии для. студентов медицинских ВУЗов и; при последипломном обучении патологоанатомов и гинекологов.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Эндометрий женщин с бесплодием в период предполагаемого «окна имплантации» характеризуется значительными гистологическими и иммуногистохимическими особенностями, существенными изменениями поверхностной ультраструктуры.
2. Стероидная рецепция, экспрессия фактора пролиферации, белков, регулирующих клеточный цикл, и поверхностная ультраструктура эндометрия являются важными показателями полноценности «окна имплантации».
3. Комплексное морфологическое и иммуногистохимическое исследование позволяет дополнить алгоритм обследования эндометрия в плане подготовки к лечению бесплодия, методами ВРТ.
Бесплодие. Вспомогательные репродуктивные технологии
Бесплодие представляет собой одну из актуальных проблем современного здравоохранения и может быть»как женским, так и-мужским. На долю женского бесплодияшриходится не менее 65% (И.В- Корнеева, Т.П. Лопатина, 2006; В.П. Сметник, Л:Г. Тумилович; 2006; Т.А. Назаренко и др., 2008).
Единая классификация бесплодия отсутствует, однако существует несколько взаимодополняющих друг друга классификаций. На основании анамнестических данных различают первичное бесплодие (у женщин, живущих регулярной половой жизнью без предохранения и не имевших ни одной беременности) и вторичное (при беременностях в прошлом, но в настоящее время отсутствии их при регулярной половой жизни без предохранения в течение не менее 1 года). Как первичное, так и вторичное бесплодие может быть относительным, когда возможность беременности сохраняется, и абсолютным, когда возможность забеременеть естественным путем полностью исключена (при отсутствии матки, маточных труб, яичников, при, ряде аномалий развития половых органов) (Г.М: Савельева, В.Г. Бреусенко, 2007).
Всемирная Организация Здравоохранения выделяет 22 фактора (причины) женского бесплодия, причем у 60-70% женщин имеет место сочетание двух и более причин (Руководство ВОЗ по стандартизированному обследованию и диагностике бесплодных супружеских пар, 1997). Наиболее распространенными факторами бесплодия у женщин (И.Е. Корнеева, Т.В. Лопатина, 2006) являются: Эндокринные факторы, представленные нарушением процесса овуляции, причинами чего могут стать поражения любого из уровней репродуктивной системы (Т.А. Назаренко и соавт., 2006, 2008). К ним относятся: Нарушения гипоталамо-гипофизарного генеза (И.Б. Манухин и др., 2006), вызванные:
а) функциональными причинами.(гиперпролактинемия; нейрообменно эндокринный синдром, гипогонадотропнаяї гипоталамическая аменорея; хроническая ановуляция/гиполютеинизм);.
б) органическими причинами (аденомы гипофиза, гипофизарная гипогонадотропная аменорея).
Нарушения менструального цикла, связанные с гиперандрогенией (И.И. Дедов, Е.Н. Андреева, 2003). Гипофункция яичников, которая может быть а) врожденной (дисгенезия гонад, тестикулярная феминизация) и б) приобретенной (преждевременное истощение функции яичников), в том числе вследствие влияния ятрогенных факторов (И.В. Кузнецова, 2005). Анатомические факторы, приводящие к нарушению проходимости маточных труб или затрудняющие имплантацию трофобласта.
К анатомическим факторам относят патологию матки и влагалища:
а) врожденные аномалии развития (И.Б. Манухин, 2006)
б) приобретенная патология (внутриматочные синехии, эндометрит, миома матки с субмукозным расположением узла) (И:В. Кузнецова, 2005) Основными и наиболее частыми из них являются — трубно перитонеальные факторы (Л.В. Дубницкая, С.В: Куземина, 2006; Л.В. Дубиницкая и др., 2008):
а) нарушение проходимости маточных труб, обусловленное функциональными (хронический стресс, нарушение синтеза половых гормонов и их соотношения, синтеза простагландинов, увеличения метаболитов простациклина и тромбоксана Аг, глюкокортикоидной функции коры надпочечников) (Г.М. Савельева, В.Г. Бреусенко, 2007).
б) нарушение проходимости маточных труб, обусловленное органическими причинами (воспалительные заболевания половых органов, оперативные вмешательства на внутренних половых органах)
Среди анатомических факторов отдельно выделяют наружный и внутренний генитальный эндометриоз. Верифицированный эндометриоз считается основной причиной бесплодия при исключении (или минимальных проявлениях) других факторов (Н.И: Волков, Д.В. Жердев, 2006).
Возможно также наличие шеечного фактора и психогенного бесплодия (Knorre P., Schusling G., 1986). При шеечном факторе, отмечается изменение структуры и состава цервикальнои слизи, что затрудняет транспорт сперматозоидов. Это может быть обусловлено иммунными причинами (образование у женщины антиспермальных антител в шейке матки, реже в эндометрии и маточных трубах, что приводит к фагоцитозу сперматозоидов) (Г.М. Савельева, В.Г. Бреусенко, 2004); воспалительными заболеваниями влагалища и шейки матки с изменением характера секрета (И.В. Кузнецова, 2005); врожденнми или приобретенными (после абортов, родов или операций) анатомическими изменениями шейки матки (В.П. Сметник, Л.Г. Тумилович, 2006).
Иммуногистохимическое исследование
ИГХ реакции проводили в ступенчатых парафиновых срезах пероксидазно-антипероксидазным методом-, с демаскировкой антигенов» в СВЧ -печи. Для визуализации реакций применяли универсальный пероксидазный набор LSAB+kit («Dako», США). Негативные контрольные реакции проводили с мышиной и кроличьей сывороткой (нормальный мышиный и кроличий иммуноглобулин). Ядра докрашивали гематоксилином Майера.
Использовали мышиные моноклональные антитела к ЭРа (клон 1D5 «Dako», США) и ПР (клон 1А6 «Dako», США), к ЭРР (клон PPG5/10 «Diagnostic BioSystems» США), к фактору пролиферации — белку КІ67 (клон МГО 1 «Dako», США), а так же антитела к белкам Р27 и Cyklin Е, регулирующим клеточный цикл (клоны — DCS-72.F6 и НЕ 12, соответственно, «Diagnostic BioSystems» США). ИГХ исследование проводили по следующей схеме:
1. Срезы депарафинировали по общепринятой методике.
2. Для демаскировки антигенов проводили прогревание стекол со срезами в ЮтМ цитратном буфере в СВЧ-печи HYUNDAI Н-MW 1717. Режим Прогревания был установлен опытным путем 7 минут при мощности 810 W и после 20 минут при мощности 360 W.
3. Срезы промывали в деионизированной воде, обсушивали и наносили 6% перекись водорода для ингибирования эндогенной пероксидазной активности.
4. Срезы промывали в фосфатно-солевом буфере (PBS), просушивали и на каждый срез наносили определенную иммунную первичную сыворотку, инкубировали при 37С 30 минут.
5. Срезы промывали PBS, обсушивали, наносили вторичные антитела и инкубировали при 37С 20 минут.
6. Смывали антитела PBS, обсушивали и обрабатывали стрептовидин-пероксидазным комплексом, инкубировали при, 37С 20 минут.
7. Срезы промывали PBS, обсушивали, наносили раствор хромогена (ДАБ). Проявление окрашивания проводили под контролем микроскопа. Отсутствие окраски в контрольных срезах и специфическое окрашивание в опытных позволяло судить о положительной реакции с той или иной сывороткой.
8. Препараты промывали дестилированной водой и дополнительно окрашивали гематоксилином Майера, обезвоживали по стандартной методике и заключали в канадский бальзам.
Для изучения поверхностной ультраструктуры в сканирующем электронном микроскопе отдельные фрагменты эндометрия фиксировали в 2,5% растворе глутаральдегида, дофиксировали в, 1% растворе четырехокиси осмия. Проводили дегидратацию в растворе ацетона, сушку с СС 2 в аппарате «Quorum Technologies» (Англия). Поверхность напыляли золотом в аппарате «Eiko» (Япония) Исследование проводили в сканирующем электронном микроскопе Hitachi S 500 (Япония). Исследование проводили совместно с сотрудниками отдела электронной микроскопии НИИ Морфологии человека РАМН.
Количественный анализ результатов иммуногистохимических реакций проводили под увеличением объектива х400, в участках соскобов и биоптатов с преобладающими диагностическими проявлениями. ИГХ реакция в строме оценивалась только в ее резидентных клетках. Интенсивность ИГХ реакции к ЭРа, ЭРр и к ПР в ядрах клеток эпителия желез и стромы оценивали по методу гистологического счета H-score по формуле - S=la+2b+3c, где а.- % слабо окрашенных ядер клеток, b — % умеренно окрашенных ядер клеток, с — % сильно окрашенных ядер клеток (McClelland R.A. et al., 1991). Степень выраженности экспрессии ЭР и ПР расценивали: 0-10 баллов — отсутствие экспрессии, 11-100 — слабая экспрессия, 101-200 — умеренная экспрессия, 201-300 — выраженная экспрессия. Применение счета H-score по отношению к экспрессии ЭР Р, по имеющимся у нас сведениям, было выполнено впервые.
Интенсивность ИГХ реакции к белку КІ67 оценивали в процентах (количество окрашенных ядер на 100 клеток). Интенсивность реакции к белкам Р27 и циклину Е оценивали в баллах — 1+ - слабая, 2+ - умеренная, 3+ - выраженная и в процентах (количество окрашенных ядер или цитоплазмы на 100 клеток).
Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика «окна имплантации» эндометрия в группе сравнения
Рецепторы к стероидным гормонам. Во всех исследованных образцах, как в ядрах клеток эпителия желез, так и в ядрах клеток стромы, выявлена ИГХ реакция на ЭРа и ПР. Экспрессия ЭРа и ПР и в железах, и в строме распределялась равномерно.
Уровень ПР в ядрах клеток эпителия желез был умеренным, колебался от, 120 до 160 баллов, (по H-score коэффициентвариации составил 0,07, экспрессия в среднем бьша равна 132,5+9;5 баллов..Уровень экспрессии ПР в ядрах стромальных клеток был высоким, находился в пределах от 185 до 240 баллов, коэффициент вариации составил 0,05, а в среднем экспрессия была равна 208,8+11,6 баллов (табл. 2.1, рис.2.2.а).
Показатели ЭРа, как желез эндометрия, так и стромы были низкими. Количество ЭРа в ядрах клеток эпителия желез находилась в пределах от 52 до 80 баллов — 63,2+6,7 баллов, коэффициент вариации был равен 0,1. Уровень экспрессии ЭРа в ядрах клеток стромы колебался от 80 до 100 баллов, коэффициент вариации имел значение 0,06 (89,8+4,1 балла) (табл. 2.1,рис.2.2.б).
Полученные нами показатели согласуются с данными, представленными другими исследователями для фазы средней секреции в норме (М.Х. Ашхаб 2003; В.А. Ковязин, 2005). а) рецепторы к прогестерону. В железах - 130 H-score, в строме - 200 H-score. ?& б) рецепторы к эстрогенам. В железах — 52 H-score, в строме - 90 Н Рисунок 2.2. Женщина 30 лет, нормальный эндометрий, 7 ПОД. ИГХ реакция. х200. Рецепторы к эстрогенам р.
В ядрах клеток эпителия желез и клеток стромы всех исследованных образцов эндометрия выявлена экспрессия ЭРр. ИГХ реакция проявлялась равномерно. Таблица 2.1. Рецепторы к эстрогенам р в нормальном «окне имплантации», H-score. М+м. ЭРР в железах ЭРр в строме 110,3±3,6 123,3+7,0
В ядрах клеток эпителия желез экспрессия ЭРР была умеренной, колебалась от 103 до 113 баллов (по H-score), коэффициент вариации был 0,03, экспрессия составила 110,3+3,6 баллов. В ядрах клеток стромы уровень ЭРР также был умеренным,, колебался от 107 до 134 баллов, (123,3+7,0 баллов), коэффициент вариации был равен 0,06 (табл. 2.1, рис. 2.3).
Количественная оценка экспрессии ЭРр по H-score, насколько нам известно, ранее не проводилась. Полученные данные свидетельствуют о том, что в период нормального «окна имплантации» уровень экспрессии ЭРр и в железах, и в строме находится на среднем уровне, что не противоречит данным других исследователей о секреторной фазе МЦ (Lecce G. et al., 2001; Tessier С. et al., 2000; Taylor L.J. et al, 2005).
Пролиферативная активность.
Экспрессия фактора пролиферации белка КІ67 выявлялась в ядрах клеток эпителия желез и в ядрах клеток стромы во всех исследованных образцах. В железах эндометрия в период «окна имплантации» пролиферативная активность была минимальной, составила 0,75+0,25%, коэффициент вариации был равен 0,3. В строме пролиферативная активность была слабой - экспрессия белка КІ67 составляла 3,5+0,6%, колебалась от 2 до 5%, коэффициент вариации равнялся 0,2 (табл. 2.3, рис.2.4). выявлялся исключительно в ядрах с интенсивностью 2+ практически в половине клеток эпителия желез (45,3+6,8%). В большей части клеток стромы (54+17,1%) Р27 выявлялся также только в ядрах, но с меньшей интенсивностью — 1+ (табл. 2.4, рис.2.5).
Циклин Е - белок, активирующий клеточный цикл — в 29,5+13,5% клеток эпителия желез выявлялся со слабой интенсивностью (1+) только в ядрах. В стромальных клетках циклин Е обнаруживался и в ядрах (17,8+4,8% клеток) и в цитоплазме (12,5+4.3% клеток) со слабой интенсивностью (1+) (табл. 2.5, рис.2.6).
При исследовании поверхности эндометрия в сканирующем электронном микроскопе во всех наблюдениях из группы сравнения обнаружены обширные поля с характерными выростами плазматической мембраны — пиноподиями. У всех обследованных женщин группы сравнения были видны многочисленные крупные пиноподии до 5 мкм в диаметре, округлой или овальной формы. Они выступали над поверхностью, полностью скрывая длинные микроворсинки. Такие пиноподии следует, считать «развитыми» (Bentin-Ley U. et al., 1999) (рис.2.7.а).
В случаях, когда материал был получен в 9-10 ПОД, на отдельных участках поверхности эндометрия наблюдались признаки «регресса» части пиноподии, что проявлялось в том, что выросты плазматической мембраны были несколько меньших размеров — 3,5-4 мкм в диаметре. В этих местах были видны длинные микроворсинки (рис.2.7.б).
Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика эндометрия в период ожидаемого «окна имплантации» при бесплодии
Достоверных различий между показателями рецепции к эстрогенам и прогестерону при Б1 и Б2 выявлено не было. Экспрессия ПР и ЭРа в железах была несколько выше при Б 2 по сравнению с Б1, а в строме — несколько ниже.
Показатели экспрессии стероидных рецепторов при различных факторах бесплодия отражены в таблице 3.3.
В группе с Т-пФ экспрессия ПР в железах хотя и не отличалась достоверно от нормы, но была несколько повышена, составляя 150,6+11,5 баллов. Экспрессия ПР в строме достоверно уступала нормальным значениям (179,8+8,9 баллов). В то же время, экспрессия ЭРа и в железах, и в строме достоверно превышала норму (157,6+11,2 и 123,6+9,6 баллов, соответственно). У пациенток с Т-пФ при Б1 и Б2 достоверных различий не выявлено, но показатели экспрессии ПР и ЭРа в строме при Б2 были более низкими, тогда как экспрессия ПР в-железах была несколько ниже при Б1.
Экспрессия ПР в группе с ЭФ достоверно не отличалась от показателей нормального «окна имплантации» как в железах, так и в строме, составив 136,1+15,7 и 190,6+8,9 баллов H-score соответственно. В то же время количество ЭРа было выше нормы в эпителии желез вдвое (130,4+18,6 баллов), а в клетках стромы — в 1,5 раза (129,2+13,9 баллов). Экспрессия ЭРа в железах несколько уступала таковой при Т-пФ, но в строме незначительно превосходила ее. Особенности реакции с ПР у пациенток с ЭФ и Б1 по сравнению с женщинами с ЭФ и Б2 были разнонаправленными (табл. 3.3). Железистая экспрессия превалировала при Б2, а стромальная — при Б1. Достоверных же различий в количестве ЭРа не было выявлено ни в железах, ни в строме.
При эндометриозе в целом уровень экспрессии ПР в строме был в 1,2 раза ниже нормальных показателей и составлял 180,0+8,5 баллов. В железах экспрессия ПР достоверно от нормы не отличалась, но была несколько пониженной. Количество ЭРа при эндометриозе в ядрах клеток желез превышало нормальные показатели в 2,5 раза, как и при Т-пФ, и составляло 150,9+16,0 баллов, а экспрессия ЭРа в стромальных клетках достоверно не отличалось от нормы (110,3+12,8 баллов). У женщин с эндометриозом и Б2 экспрессия ЭРа в строме в 1,5 раза превышала таковую при эндометриозе и Б1. Достоверной разницы в экспрессии ПР в строме и ЭРа в железах при Б1 и Б2 не обнаружено, но при Б2 эти показатели были несколько выше, чем при Б1 (табл. 3.3).
Наиболее яркие особенности рецепции к стероидным гормонам обнаружены при различной патологии эндометрия, сопровождающей бесплодие (табл. 3.4).
При НЛФ экспрессия ПР в клетках желез несколько превышала нормальную (158,3+14,4 балла), а в стромальных клетках была незначительно ниже нормы (191,6+6,9 баллов) (рис. 3.6 а). Количество ЭРа в железах достоверно превышало нормальные показатели в 2,25 раза, составляя 149,4+13,8, а в строме - в 1,25 раза (118,4+10,6 баллов) (рис. 3.6 б).
При ГЭ обнаружены наиболее высокие показатели экспрессии ПР и ЭРа в железах и ЭРа в строме, все они достоверно отличались от нормы. Экспрессия ПР в ядрах клеток эпителия желез превышала нормальные значения в 1,5 раза (193,9+8,3 баллов), количество ЭРа в клетках желез — в 3 раза, а ЭРа в строме — в 1,5 раза (196,9+14,6 и 138,6+16,4 баллов соответственно). Уровень ПР в строме был понижен в 1,35 раза относительно показателей группы сравнения и составлял 156,3+16,7 баллов (рис. 3.7 а,б).
При ХЭ экспрессия ЭРа в железах и ПР в строме достоверно отличались от нормы. Количество ПР в строме было пониженным в 1,25 раза (165,5+9,6 баллов), а экспрессия ЭРа в железах превышала показатели группы сравнения в 2,75 раза (173,5+17,6 баллов). В строме же она была-несколько- выше нормы и составила 112,5+17,1 баллов (рис. 3.8 а,б). Показатели ПР в железах несколько превьппали нормальные и составляли, в среднем 154,4+23,4 балла.
В ПЭ обнаружены самые низкие показатели экспрессии ПР в ядрах клеток эпителия желез. Они составили 85,5+11,1 баллов и оказались в 1,5 раза ниже чем в группе сравнения. Уровень экспрессии ПР в строме был ниже нормы в 1,2 раза - 187,2+8,8 баллов. Экспрессия ЭРа в железах ПЭ составляла 121,0+11,5 баллов, что в 2 раза выше, чем в группе сравнения, а в строме количество ЭР было в 1,3 раза выше нормы (рис. 3.9.а,б).
