Содержание к диссертации
Принятые сокращения ,6
Глава I. ВВЕДЕНИЕ 7
Глава II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.Алеутская болезнь норок 11
а) возбудитель АБН 11
б)структура генома вируса АБН 12
в)неструктурные белки вируса АБН 15
г)структурные белки вируса АБН 16
д)характеристика штаммов вируса АБН 21
2 Пути распространения вируса АБН 23
3.Клинические формы и патологоанатомические изменения при АБН 2 6
3.1.Алеутская болезнь новорожденных щенков 26
3.2.Классическая форма АБН 29
4 . Иммунитет при АБН 32
5 . Профилактика АБН 36
6 . Диагностика АБН 37
Глава III.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 4 3
1 . МАТЕРИАЛЫ 4 3
1.1.Вирусы, бактериальные штаммы, плазмиды и питательные среды 4 3
1.2.Реактивы 43
1.3.Праймеры 44
2 . МЕТОДЫ 4 4
2.1.Выделение плазмидной ДНК щелочным методом 4 4
2.2.Обработка ДНК рестрикционным эндонуклеазами 4 6
2.3.Постановка полимеразой цепной реакции 4 6
2.4. Электрофорез в агарозном геле 47
2.5.Очистка ПЦР-фрагментов электрофорезом в агарозно геле 47
2.б.Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля 47
2.7.Получение рекомбинантных молекул т vitro 48
2.8.Приготовление компетентных клеток и трансформация их репаратами плазмидной ДНК 4 8
2.8.1.Подготовка компетентных клеток 48
2.8.2.Электротрансформация 49
2.9.Выделение суммарной клеточной ДНК из органов животных(фенольный метод) 4 9
2.10.Клонирование ПЦР-продуктов 4 9
2.11.Кинирование ПЦР-продуктов 50
2.12.Достройка ПЦР-продуктов 50
2.13.Электофорез белков в ПААГ-ДСН 51
2.14.Окраска кумасси 51
2.15.Методика постановки ПЦР-ИФА 51
2.15.1.Полимеразная цепная реакция 51
2.15.2.Подготовка полестероловых микроплашек для ПЦР-ИФА 52
2.15.3.Условия постановки ПЦР-ИФА 52
2.16. Постановка РИЭОФ на АБН 52
2.17.Определение активности термостабильной пирофосфатазы (PPase) 53
2.18.Экспрессия белков 54
2.19.Определение растворимости белка 5 4
2.20.Методика иммуноферментного анализа 55
2.20.1.Сущность метода 55
2.20.2.Постановка реакции 55
2.20.2.1.Сенсибилизация планшетов 55
2.20.2.2.Внесение исследуемых сывороток и антивидвого коньюгата 55
2 20 2 3 .Внесение субстрата и учет реакции 56
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 57
ЧАСТЫ. Разработка ПЦР - диагностикума для обнаружения ДНК
вируса алеутской болезни норок 57
1.Получение ПЦР-продукта 715 57
2.Получение плазмиды Y1C (положительный контроль) 59
3.Получение плазмиды Y1CBK (внутренний контроль) 59
4.Отработка условий постановки полимеразной цепной реакции с плазмид Y1C и Y1CBK 62
5.Определение минимального расчетного количества плазмиды Y1C, необходимого для детекции ПЦР-продукта в агарозном геле 63
6.Потеря ДНК вируса алеутской болезни норок при выделении фенольным методом 64
7.Определение минимального количества плазмиды Y1CBK для проведения диагностического ПЦР 65
8.Апробация ПЦР с пробами клинического материала 67
ЧАСТЫ I. Детекция ПЦР-продуктов ДНК вируса алеутской болезни норок в ИФА формате 6 9
1.Определение специфичности праймеров N-Aleutl и N- Aleut2 70
2. Определение способности ПЦР-продуктов вируса АБН с праймеров N-Aleutl и N-Aleut2 связываться с белком LV-GCN4 71
3.Определение рабочей концентрации белка LV-GCN4 для детекции ПЦР-продуктов в плашечном ИФА - формате 7 3
4.Сравнение чувствительности ПЦР и ПЦР-ИФА при детекции ПЦР-продуктов вируса алеутской болезни норок 7 4
5.Апробация с пробами клинического материала 75
ЧАСТЫII.Типирование вируса АБН выделенного в зверосовхозе «Родники» Московской области 77
1.Эпизоотологическое состояние зверосовхоза «Родники» Московской области по алеутской болезни норок 77
2.Сиквенс ПЦР-продуктов изолятов вируса алеутской болезни норок и сравнивание их со штаммом ADV-G 7 8
3.Анализ гипервариабельного участка вирусов АБН 81
ЧАСТЫУ.Создание химерного белка, содержащего детерминанту вируса алеутской болезни норок, и изучение ее физико- химических свойств 84
1.Получение рекомбинантной плазмиды, содержащей ген химерного белка RpY-6 84
1.1.Получение "ПЦР-продукта 530", содержащей ген пирофосфатазы 84
1.2.Получение рекомбинантной плазмиды RpP-pa, содержащей ген белка пирофосфотазы 85
1.3.Получение «ПЦР-продукта 302», содержащего детерминанту вируса алеутской болезни норок 86
1.4.Получение рекомбинантных плазмид Y5-A1, содержащих спейсер и детерминанту вируса АБН 86
1.5.Получение рекомбинантной плазмиды RpY-б, содержащей ген пирофосфотазы с присоединенной через спейсер детерминанту вируса АБН 87
2.Изучение физико-химических свойств химерного белка pRY-6 88
2.1.Экспрессия конструкций pRY-б в штамме M15[REP4] E.Coli 88
2.2.Определение экспрессии и растворимости химерного белка RPY-б 89
2.3.Очистка химерного белка pRY-6 91
2.4.Определение специфичности детерминанты химерного белка в ИФА с пробами клинического материала 92
Глава IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 95
Глава V.ВЫВОДЫ 98
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 100
ПРИЛОЖЕНИЕ 116
Рекомендации по использованию метода ПЦР для диагностики вируса Алеутской болезни норок
Введение к работе
По данным ЗВЕРОПРОМА в 1990 году на внутренний и внешний рынки СССР было поставлено более 9,3 млн. шкурок норки. В 2 0 00 году эта цифра составила чуть меньше 2 млн. шкурок норки. В период с 1990г по 2000г в России прекратили свое существование около 50% зверосовхозов, входивших в состав ЗВЕРОПРОМА, часть из этих хозяйств были ликвидированы в связи со 100% поражением основного стада норок алеутской болезнью. В настоящее время алеутская болезнь норок наносит огромный экономический ущерб звероводству вследствие уменьшения делового выхода молодняка, ухудшения качества пушнины, высоких денежных и трудовых затрат на сдерживание распространения заболевания и его ликвидации. В последние годы в нашей стране наблюдается дефицит информации у ветеринарных врачей и , зоотехников звероводческих хозяйств по алеутской болезни норок. Попытки исследований этого заболевания в России носят спорадический характер, а проводимые исследования часто повторяют друг друга.
Более 40 лет (с 1956 года) алеутская болезнь норок является бичом звероводства во всем мире. , За это время была установлена вирусная этиология болезни, выделен вирус, изучены его морфологические свойства, определена полная нуклеотидная последовательность ДНК, построена трехмерная модель вируса, изучены эпизоотологические особенности и нуклеотидные различия некоторых штаммов вируса, отработаны методы специфической диагностики и на основе этих данных разработаны мероприятия по ликвидации данного заболевания. Разработка специфической диагностики АБН и-мероприятий по ликвидации заболевания привели к
сдерживанию распространения заболевания. Хорошую помощь в ликвидации АБН, на многих фермах за границей оказало принятие комплексных государственных программ. Так в Дании, где программа бьша принята с 197 8 года, на данный момент очищено более половины хозяйств. Но к полному освобождению от болезни это не привело, из-за сохранения в стаде латентно инфицированных животных, не выявляемых с помощью имеющихся диагностических тест-систем.
Таким образом, одним из основных путей контроля и профилактики болезни является разработка современных высоко специфических методов лабораторной диагностики АБН, способных составить одно из определяющих звеньев комплексной программы по профилактике и контролю АБН.
2.Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось создание диагностикума для детекции вируса алеутской болезни в крови и во внутренних органах павших или убитых норок.
В процессе работы предстояло решить следующие задачи:
1.Проанализировать нуклеотидные последовательности различных участков генома вируса АБН и определить наиболее консервативные и вариабельные области, пригодные для использования в диагностике.
2.Подобрать оптимальные праймеры для использования их в ПЦР-диагностикуме.
3.Отработать состав реакционной смеси и условия проведения ПЦР, обеспечивающие высокую чувствительность и специфичность метода.
4.Отработать протоколы подготовки проб (выделение ДНК) для их последующего использования в ПЦР.
5.Определить чувствительность и специфичность метода.
6.Определить диагностическую ценность разработанной методики.
/.Определить место предлагаемой методики в схеме ликвидации этого заболевания в хозяйствах. ,
8.На основании разработанного ПЦР - набора провести типирование изолята выделенного во время вспышки в зверосовхозе «Родники» Московской области.
9.Клонировать антигенную детерминанту капсидного белка АБН и изучить её пригодность для ИФА.
3.Научная новизна. Создан ПЦР - диагностикум для обнаружения ДНК вируса АБН и типирования новых изолятов вируса алеутской болезни норок.
Впервые был отработан и применен твердофазный метод детекции ПЦР продуктов, использующий ДНК-белковое взаимодействие для иммобилизации продуктов амплификации на плашке.
Впервые типирован по гипервариабельной области отечественный штамм П-1 вируса АБН и изолят СТЛ-1, выделенный в зверосовхозе «Родники» Московской области во время вспышки.
Впервые получен химерный белок пирофосфотазы E.Coli с антигенной детерминантои капсидного белка VP2 вируса АБН и изучены его физико-химические и антигенные свойства.
4.Практическая значимость. Разработанный ПЦР набор на алеутскую болезнь норок является дополнительным методом в спорных случаях;
Разработанный набор может быть использован для типирования «новых» и «старых» изолятов;
Плашечный формат ПЦР набора на вирус АБН позволяет использовать его в массовых исследованиях в лабораториях звероводческих предприятий;
Материалы исследования вошли в рекомендации по а применению ПЦР - диагностикума не. вирус алеутской болезни норок»; Материалы исследования внедрены в учебный процесс . и на их основе разработаны лабораторно-практические занятия при изучении возбудителей вирусных инфекций на кафедре ветеринарной вирусологии МГАВМиБ им. К.И.Скрябина.
Полученная нами антигенная детерминанта позволяет выявить антитела к парвовирусам в сыворотки крови животных и может быть использоваться в биологической промьшленности и в лабораториях для определения напряженности иммунитета у животных привитых против парвовирусных инфекций;
5.Апробация работы.
1. I Молодежная научная конференция: «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» 27 марта 2001.
2.Методическая и научная конференция Московской ветеринарной академии. Москва 2001.
6.Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе одна в иностранном журнале.
