Введение к работе
Актуальность темы. Важным элементом в диагностике туберкулёза сельскохозяйственных животных является быстрая, чувствительная и специфическая идентификация этиологического фактора. Однако, так называемые, атипичные микобактерии усложняют постановку окончательной дифференциальной диагностики туберкулёза (А.И. Каграманов, 1964). Атипичные микобактерии, обитающие в окружающей среде и персистирующие в организме животных, сенсибилизируют его к ППД туберкулину для млекопитающих, что объясняется их антигенным родством с возбудителем туберкулёза (Ю.Я. Кассич, 1990). В результате чего затрудняется профилактический контроль благополучия стад крупного рогатого скота при проведении внутрикожной туберкулиновой пробы (Р.В. Костюк., 2004; А.Х.Найманов и др., 2004). При проведении эпидемиологического и эпизоотологического контроля различных инфекций, включая туберкулёз, важное место приобретают молекулярно-генетические данные (Г.Д. Каминский и др., 1989; В.В. Макаров и др., 1991).
Для получения эпизоотологически значимых результатов необходимо проводить сравнение генетических данных, полученных в ходе исследования разных популяционных групп. Однако знание молекулярной вариабельности генома микобактерий только в одной группе носителей даёт недостаточно полные объективные данные для уточнения эпизоотической ситуации, но сравнение генетических структур популяций инфекционного патогена, выявленных на различных территориях, в разное время или у различных групп носителей, что может стать ключом к пониманию эволюционной истории микобактерий. Это позволит не только уточнить текущее разнообразие микобактериальных изолятов, циркулирующих в организме крупного рогатого скота, но и выделить исторические этапы эпизоотического процесса.
Цель исследования – изучить генетический полиморфизм и особенности филогенетических и популяционных взаимоотношений популяции микобактерий, циркулирующих среди сельскохозяйственных животных (на территории Новосибирской области) при помощи молекулярно-генетических методов исследования.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Провести подбор праймеров и оптимальных параметров проведения диагностической ПЦР, определить её чувствительность и специфичность. Тестировать референтные штаммы и изоляты микобактерий.
2. Изучить генетический полиморфизм культур, изолированных от животных, а также из объектов окружающей среды и грызунов благополучных и неблагополучных по туберкулёзу хозяйств.
3. Определить степень сходства изолированных культур микобактерий внутри изучаемой видовой выборки и в сравнении с прототипными штаммами.
Научная новизна. Разработана диагностическая ПЦР, использующая в качестве мишени mig-ген M.avium, систему senX3-regX3 для дифференциации M.tuberculosis от M. bovis. Изучено генетическое разнообразие микобактерий. Получены данные по нуклеотидным последовательностям фрагмента mig-гена M. avium и системы senX3-regX3 M. tuberculosis complex. Определена степень сходства микобактерий с использованием популяционного и филогенетического методов исследования. Впервые от свиней на территории России выделен потенциально новый вид микобактерий M. arupense.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследований представляют теоретическую и практическую ценность, поскольку позволяют расширить научные знания о генетическом полиморфизме и популяционных характеристиках микобактерий, циркулирующих среди сельскохозяйственных животных и могут быть использованы при проведении дифференциально-диагностических исследований на туберкулёз, а также при изучении молекулярной эпизоотологии болезни.
Проведены подбор и тестирование олигонуклеотидных праймеров для детекции и дифференциации M. tuberculosis, M. bovis, M. avium, а также атипичных микобактерий. Доказана их эффективность для видоспецифичной экспресс-диагностики туберкулёза и проверена на ДНК 95 штаммов и изолятов различных видов микобактерий.
Материалы диссертации использованы при составлении двух методических рекомендаций «Использование полимеразной цепной реакции со специфическими олигонуклеотидными праймерами для определения видовой принадлежности микобактерий», (Утв. подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, протокол № 4, 2007) и «Применение ДНК-маркеров при генетическом картировании культур Mycoplasma species, Fusobacterium neccrophorum и Mycobacterium avium», (Утв. подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, протокол № 1, 2008 г.).
Апробация работы. Результаты работы доложены на заседаниях Учёного совета ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО Россельхозакадемии (Новосибирск, 2003 – 2007 гг.), на научн.-практич. конф. «Информационные технологии, информационные измерительные системы и приборы в исследовании сельскохозяйственных процессов», (Новосибирск, 2003), II-й международ. научн.-практич. конф. молодых учёных (Новосибирск, 2006), на Российской науч.-практич. конф., посвящённой 110-летию кафедры инфекц. болезней Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (Санкт-Петербург,2006), междунар. конф. молодых учёных (Омск, 2006 г), III Российской науч. конф. с международ. участием (Новосибирск, 2006), международ. конф. «Молекулярная биология 2007» (Москва, 2007).
Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликованы 6 печатных работ, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ («Сибирский вестник с.-х. науки»).
Объём и структура диссертации. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, выводов и списка литературы, включающего 190 источников, из них 108 на иностранных языках. Диссертация иллюстрирована 6 таблицами и 20 рисунками.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Результаты подбора и тестирования олигонуклеотидных праймеров, используемых в ПЦР для выявления ДНК микобактерий.
2. Результаты изучения фрагмента гена 16S-23S рРНК потенциально нового вида микобактерий M. arupense.
3. Результаты изучения генетического полиморфизма, филогенетических и популяционных характеристик, выделенных изолятов как внутри группы, так и в сравнении с прототипными штаммами.
Похожие диссертации на Полиморфизм ДНК микобактерий, вызывающих неспецифические туберкулиновые реакции у сельскохозяйственных животных
