Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы
2.1. Общая характеристика заболевания.
Возбудитель, эпизоотологические данные и клиническое проявление туберкулеза у крупного рогатого скота 11
2.2. Методы диагностики туберкулеза крупного рогатого скота 14
2.3. Методы прижизненной диагностики 14
2.3.1. Туберкулинодиагностика (аллергическая диагностика, внутрикожная туберкулиновая проба) 14
2.3.2. Серологическое исследование 18
2.4. Методы послеубойной (посмертной) диагностики 20
2.4.1. Патологоанатомическое исследование 20
2.4.2. Бактериологическое исследование
2.4.2.1. Бактериоскопическое исследование 25
2.4.2.2. Культуральное исследование 26
2.4.2.3. Биологическое исследование (биопроба) 30
2.5. Полимеразная цепная реакция при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота 31
3. Собственные исследования
3.1. Материалы и методы 45
3.1.1. Исследования различных видов культур микобактерий 46
3.1.2. Исследования экспериментально зараженных М. bovis телок 46
3.1.3. Исследования в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах
3.1.4 Сбор биоматериала, обработка его и выделение ДНК перед постановкой полимеразной цепной реакции
3.1.5. Методика постановки полимеразной цепной реакции с использованием тест-системы senX3-regX3 52
4. Результаты исследований
4.1. Исследования полимеразной цепной реакцией различных видов культур микобактерий 56
4.2. Сравнительное изучение диагностической ценности ПЦР-метода и традиционных методов диагностики туберкулеза на экспериментально зараженных М. bovis телках 62
4.3. Изучение диагностической ценности ПЦР-метода в благополучных по туберкулезу хозяйствах, где установлена сенсибилизация животных атипичными микобактериями 73
4.4. Изучение диагностической ценности ПЦР-метода в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах 80
5. Обсуждение полученных результатов 94
6. Выводы 104
7. Практические предложения 105
8. Список использованной литературы
- Методы прижизненной диагностики
- Бактериологическое исследование
- Исследования в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах
- Изучение диагностической ценности ПЦР-метода в благополучных по туберкулезу хозяйствах, где установлена сенсибилизация животных атипичными микобактериями
Введение к работе
1.1. Актуальность темы. Среди инфекционных болезней животных особенного внимания заслуживает туберкулез крупного рогатого скота, наносящий большой экономический ущерб животноводству и представляющий серьезную опасность для здоровья людей в настоящее время.
Учитывая сложившуюся ситуацию по туберкулезу людей в мире, Всемирная организация здравоохранения и Международный союз борьбы с туберкулезом объявили туберкулез «Проблемой всемирной опасности» и «Экономическим бедствием XXI века», а 24 марта - «Всемирным днем борьбы против туберкулеза».
В России Постановлением правительства № 582 от 11 июня 1998 года утверждена целевая программа «Неотложные меры борьбы с туберкулезом в России на 1998-2004 годы», а Постановлением № 892 от 25 декабря 2001 г. утвержден Федеральный закон «О предупреждении распространения туберкулеза в Российской Федерации».
Известно, что основным звеном в проведении профилактических и оздоровительных мероприятий при туберкулезе животных является своевременная и точная диагностика болезни. Для прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота основным, массовым и доступным для применения в широкой ветеринарной практике методом является внутрикожная туберкулиновая проба с применением ППД-туберкулина для млекопитающих.
В настоящее время диагностика туберкулеза крупного рогатого скота имеет две основные проблемы: с одной стороны, выявление здоровых животных с парааллергическими или неспецифическими реакциями на туберкулин в благополучных хозяйствах, а с другой, недовыявление зараженных туберкулезом животных в неблагополучных хозяйствах. Поэтому, при проведении исследований на туберкулез в благополучных хозяйствах необходимо повысить специфичность, а в неблагополучных - чувствительность диагностических исследований.
Учитывая масштабность проведения исследований на туберкулез, отстандартизовать организмы всех исследуемых животных по реактивности из-за различных внешних и внутренних влияний мы не можем и вряд ли это возможно, так как в разных хозяйствах с различной эпизоотической ситуацией по туберкулезу имеются разные животные с различным проявлением микобактериальной инфекции. Поэтому, прижизненная диагностика туберкулеза крупного рогатого скота на основе только аллергической внутрикожной туберкулиновой пробы в настоящее время становится недостаточной (А.Х. Найманов, 2004).
Лабораторные методы диагностики туберкулеза крупного рогатого скота являются трудоемкими, длительными (до 6 мес.) и не позволяют в короткие сроки поставить точный диагноз.
Одной из главных проблем при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота является выявление в благополучных хозяйствах реагирующих животных с парааллергическими реакциями, по причине сенсибилизации организма животных различными видами атипичных микобактерий (А.Н. Шаров, 1982, 1985; А.С. Донченко, 1991,1997; Н.П. Овдиенко, 1991; А.Х. Найманов, 2002).
Актуальность этой проблемы увеличивается из года в год. Так, по данным официальной ветеринарной статистики, в настоящее время в благополучных по туберкулезу хозяйствах РФ выявляется в 5,3 раза больше реагирующих на туберкулин животных, чем в неблагополучных хозяйствах.
Массовые выявления парааллергических реакций на туберкулин приводят к убою большого количества реагирующих здоровых животных, что увеличивает размеры экономического ущерба и вызывает обоснованные сомнения в правильности диагностики^туберкулеза общепринятыми методами.
Поэтому, оценка диагностической ценности и изучение возможности применения современных методов исследований при диагностике туберкулеза является актуальной в настоящее время.
В последние годы для выявления возбудителей некоторых инфекционных заболеваний все большее распространение получают молекулярно-биологические методы, в частности полимеразная цепная реакция (ПЦР).
В 1983 г. К. Мюллис открыл принцип избирательного умножения нуклеотидных последовательностей, а в 1984 г. разработал метод ПЦР, позволяющий за несколько часов получать миллионы копий выбранного фрагмента ДНК, что приводит к накоплению ДНК в реакционной смеси.
Метод ПЦР основан на идентификации возбудителя болезни по видоспецифическому участку ДНК, позволяющий получить положительный результат при наличии в исследуемом материале единичных клеток возбудителя.
Для амплификации специфического ДНК-фрагмента методом ПЦР достаточно знать нуклеотидную последовательность двух коротких участков ДНК, окаймляющих фрагмент-мишень. На основе этих последовательностей химически синтезируют два олигонуклеотида (праймера), которые необходимы для полимеризации ДНК в каждом цикле ПЦР. Длина праймеров (обычно 20-30 нуклеотидов) должна быть такой, чтобы их последовательность была уникальна и не встречалась в других участках ДНК, присутствующей в реакционной смеси. ПЦР включает серию повторяющихся циклов. Поскольку число молекул ДНК удваивается в каждом цикле, то многократное их повторение приводит к нарастанию (амплификации) количества специфических фрагментов ДНК (ампликонов), которое затем выявляют методом электрофореза.
Преимущества ПЦР в лабораторной диагностике связаны с быстротой, высокой чувствительностью и специфичностью, что позволяет обнаруживать микроорганизмы, имеющиеся в исследуемом материале в очень малом количестве (D. Cousins et al., 1991; G. Buck et al., 1999).
Следует отметить, что в последние годы в нашей стране успешно испытаны тест-системы ГЩР при диагностике ящура, сибирской язвы, хламидиоза, классической чумы свиней и бруцеллеза.
В настоящее время проводятся исследования по изучению возможности применения полимеразнои цепной реакции при диагностике туберкулеза людей и животных. Тем не менее, единого мнения об эффективности ГЩР при диагностике туберкулеза нет (D. Thierry et al., 1990,1992; В.В. Пунга, 1998).
Поэтому, учитывая сложную эпидемиологическую и эпизоотическую ситуации по туберкулезу в нашей стране, длительность проведения и недостаточную эффективность методов диагностики туберкулеза животных, изучение возможности применения ПЦР-систем при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота является весьма актуальным.
-
Цель исследований. Изучить возможность применения ГЩР-системы, построенной на амплификации генетической области senX3-regX3, для выявления и идентификации ДНК микобактерий, при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах и определить роль и место тест-системы senX3-regX3 в комплексе профилактических и оздоровительных мероприятий при туберкулезе крупного рогатого скота.
-
Основные задачи исследований:
-
Провести испытание ГЩР-тест-системы, основанной на амплификации генетической области senX3-regX3, для обнаружения ДНК микобактерий и идентификации М. bovis от М. tuberculosis и от других видов микобактерий.
-
Изучить влияние различных методов обработки патматериала от убитых животных на результаты ПЦР.
-
Изучить диагностическую ценность ГЩР-системы в экспериментальных условиях на зараженных М. bovis телках.
-
Провести сравнительную оценку диагностической ценности внутрикожной туберкулиновой пробы и ГЩР-системы в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах РФ.
-
Определить роль и место ГЩР-системы в комплексе профилактических и оздоровительных мероприятий при туберкулезе крупного рогатого скота.
1.4. Научная новизна.
Установлено, что ПЦР-тест-система, основанная на амплификации генетической области senX3-regX3, позволяет дифференцировать М. bovis от М. tuberculosis и от других видов микобактерий.
Установлено, что обработка патологического материала с помощью метода А.П.Аликаевой и метода Гона-Левенштейна-Сумиоши для выявления микобактерий не влияет на результаты исследований методом ПЦР.
Установлено, что при исследовании ПЦР-методом экспериментально зараженных туберкулезом телок возбудитель М. bovis находится в организме зараженных животных и не обнаруживается в крови, в то же время возбудитель М. bovis выделяется с мочой и обнаруживается ПЦР.
Установлено, что в благополучных по туберкулезу хозяйствах при исследовании проб крови от реагирующих на туберкулин коров, ПЦР-метод дает ложноположительные показания в 16,3 % случаях. При исследовании патматериала от больных туберкулезом животных ПЦР-система дает положительные показания только в 45,5 % случаях.
Установлено, что при исследовани ПЦР-методом верхнего слоя плотной питательной среды, содержащей суспензию патматериала от больного туберкулезом крупного рогатого скота, при отсутствии роста культур микобактерий, выявляется ДНК возбудителя туберкулеза.
1.5. Практическая ценность. ПЦР-систему целесообразно использовать в
лабораторной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота для
идентификации М. bovis от М. tuberculosis и от других видов микобактерий и
как дополнительный экспресс-метод при исследовании биоматериала от
реагировавших на туберкулин и убитых с диагностической целью животных.
Результаты исследований включены в Наставление по диагностике туберкулеза животных (утверждено Департаментом ветеринарии МСХ РФ в 2002 г.).
По результатам проведенных исследований разработаны «Методические рекомендации по выявлению и дифференциации возбудителей М. bovis от М. tuberculosis и от других видов микобактерий методом полимеразной цепной реакции», рассмотренные и утвержденные на заседании ученого совета ВИЭВ (2003 г.).
1.6. Основные положения, выносимые на защиту. Полученные
результаты исследований позволяют вынести на защиту следующие основные
положения:
-
Материалы по изучению возможности выделения культур микобактерий и дифференциации культур М. bovis от М. tuberculosis и от других видов культур микобактерий методом ПЦР.
-
Результаты изучения диагностической ценности ПЦР в экспериментальных условиях на зараженных М. bovis телках.
-
Результаты изучения диагностической ценности ПЦР-метода в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах.
-
Целесообразность применения ПЦР-метода в лабораторной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота для дифференциации культур М. bovis от М. tuberculosis и от других видов микобактерий и в качестве дополнительного экспресс-метода при исследовании биоматериала от
реагировавших на туберкулин и убитых с диагностической целью животных.
1.7. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы
доложены на:
Международной научно-практической конференции «Современные проблемы диагностики и профилактики туберкулеза животных», Москва, 2003;
Заседании ученого совета ВИЭВ, Москва, 2003;
Межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ, Москва, 2004.
1.8. Публикации результатов исследований. По материалам
диссертационной работы опубликовано пять статей.
1.9. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена
на 147 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора
литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов,
выводов, практических предложений и списка литературы. Список
использованной литературы включает 365 наименований, из них 134
иностранных автора. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 8 фотографиями.
Методы прижизненной диагностики
Туберкулез - инфекционная, хронически протекающая болезнь животных всех видов и человека, характеризующаяся поражением органов и тканей с образованием в них туберкулов.
Возбудитель — бактерии из рода Mycobacterium, в который входят более 38 самостоятельных видов. Микобактерии туберкулеза бычьего вида (М. bovis) патогенны для крупного рогатого скота и вызывают у него туберкулез. Микобактерии человеческого вида (М. tuberculosis), в основном, сенсибилизируют крупный рогатый скот к туберкулину и лишь иногда вызывают незначительные очаги в отдельных лимфатических узлах.
При подозрении на заболевание крупного рогатого скота туберкулезом проводят эпизоотологическое обследование. При этом обобщают и анализируют статистические данные ветеринарной отчетности о туберкулезе не менее чем за пять лет. Учитывают данные боенской статистики. Выясняют, когда и по каким ветеринарным документам поступили в хозяйство животные, условия их размещения в карантине, дату и результаты исследования в период профилактического карантина; возможность контакта животных данного хозяйства на пастбищах, водоемах и скотопрогонных трактах с животными неблагополучных по туберкулезу хозяйств. Возбудитель туберкулеза может быть занесен в благополучные стада с необеззараженным обратом, доставленным с молочного завода, куда поступало молоко от больных туберкулезом коров из неблагополучной фермы. В таких случаях заболевание обычно регистрируют у телят.
Одна из особенностей туберкулеза крупного рогатого скота заключается в том, что при заражении в молодом возрасте болезнь, как правило, начинает проявляться у коров после первого, второго или третьего отела. Поэтому очень важно выяснить условия выращивания ремонтного молодняка в ранее неблагополучном по туберкулезу хозяйстве.
Человек также может заражать крупный рогатый скот возбудителем туберкулеза бычьего вида, в случаях, если он сам болеет туберкулезом, вызванным М. bovis. Возбудитель туберкулеза человеческого вида сенсибилизирует крупный рогатый скот к туберкулину и лишь изредка вызывает ограниченные изменения, преимущественно в лимфатических узлах, регионарных местам проникновения микобактерий в организм животного. Поэтому, выясняют также наличие больных туберкулезом людей среди обслуживающего персонала. Анализ этих данных способствует своевременному и более точному установлению диагноза на туберкулез.
Течение туберкулеза у крупного рогатого скота обычно хроническое, с постоянно нарастающими симптомами. От момента заражения до появления признаков болезни может пройти несколько месяцев или лет. Клинические признаки туберкулеза у крупного рогатого скота не всегда типичны. У одних больных животных они вообще могут отсутствовать, у других наблюдают неяркие симптомы, по которым можно лишь подозревать заболевание туберкулезом.
При нормальных условиях кормления и содержания туберкулез у крупного рогатого скота обычно протекает без видимых клинических признаков. Клинические признаки болезни могут проявляться только при далеко зашедшем клиническом процессе. Чаще поражаются легкие, кишечник, вымя, а также заглоточные, подчелюстные, средостенные, бронхиальные, брыжеечные и другие лимфатические узлы. Каким бы путем ни возникло заболевание, оно поначалу носит в основном ограниченный характер в виде мелких очагов, преимущественно в легких. При легочной форме вначале повышается температура тела (до 40 С), появляется резкий, короткий и сильный кашель (особенно по утрам), который потом становится слабым, частым. Больные животные постепенно худеют, стоят сгорбленные; передвигаются с трудом, редко ложатся, поднимаются со стоном. Шерстяной покров взъерошен, теряет блеск, кожа теряет эластичность. Через рот и носовые отверстия иногда выделяется слизисто-гнойное истечение. Если поражена плевра, то животное ощущает боль при надавливании между ребрами.
Лимфатические узлы увеличиваются в размерах, становятся болезненными, малоподвижными.
Туберкулез кишечника протекает хронически и сопровождается прогрессирующим исхуданием и перемежающимися, не поддающимися лечению поносами.
Туберкулез вымени характеризуется местным процессом с поражением одной или обеих задних долей, а иногда и передних. Пораженная доля увеличена, диффузно или гнездно уплотнена. В глубине железистой ткани вымени после сдаивания молока прощупываются туберкулезные очаги различной величины и консистенции. Надвыменные лимфатические узлы увеличены до размеров куриного яйца, на ощупь плотные, бугристые.
Поражение матки и яичников сопровождается абортами, яловостью.
Болезнь может протекать генерализованно, то есть с поражением многих органов и лимфатических узлов.
При проведении плановых профилактических и оздоровительных мероприятий можно предотвратить развитие клинических признаков туберкулеза. Клинически больных животных чаще выявляют в длительно неблагополучных по туберкулезу хозяйствах. Необходимо учитывать, что клинически больные животные часто находятся в состоянии анергии и не реагируют на туберкулин. Поэтому, в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах одновременно с туберкулинизацией необходимо проводить и клиническое обследование животных, выбраковывать старых, истощенных, подозрительных в заболевании туберкулезом животных.
Бактериологическое исследование
Индикация микобактерий ПНР-методом. К настоящему времени описаны несколько систем для амплификации различных участков генома М. tuberculosis: IS 6110, гена, кодирующего белок теплового шока размером 65 кДа, фрагмента генов МРВ64 и 16SpPHK, гена белка размером 70 кДа (Фаизов Т.Х., Шилова В.И., 1991; Аляпкина Ю.С. и др., 1994; Нестеренко Л.Н. и др., 1994; Цыбанов С.Ж., Вишняков И.Ф., 1994; Рао С. et al., 1988, 1990; Brisson-Noel A. et al., 1989). Испытания различных систем амплификации показали, что чувствительность метода ПЦР составляет от 80,0 до 97,7%. Совместное использование в ПЦР-анализе двух или трех систем амплификации позволяет повысить чувствительность определения до 98%. В то же время, при исследовании трех образцов от каждого пациента, чувствительность метода достигает до 100% (De Wit D. et al., 1990, 1993; Telenti A. et al., 1993; Wards B. etal., 1995).
В 1993 году было проведено сравнительное исследование чувствительности и специфичности метода ПЦР среди семи лабораторий, работающих самостоятельно, вслепую, не зная, какой материал предложен им для исследования (Noordhoek. G. et al., 1994). Результаты превзошли ожидания, но не в смысле определения уровней чувствительности и специфичности, а в смысле появления очень большого числа ложноположительных результатов. По их мнению, это связано с контаминированием проб фрагментами амплифицированной ДНК от предыдущих исследований. Дифференциация различных видов микобактерий ПЦР-методом. М. tuberculosis очень сходна с М. bovis в генетическом отношении. M.microti и M.africanum имеют много общих свойств, вид М. microti не вирулентен для человека. Поэтому, в исследованиях по ПЦР, в большинстве случаев, авторы ссылаются на комплекс М. tuberculosis, в который входят M.tuberculosis, M.bovis, M.microti, M.africanum. Parra С. et al. в 1990 г. предложили для дифференциации М. bovis и М. tuberculosis использовать генетическую область mtp 40, так как считалось, что данная генетическая область присутствует у M.tuberculosis и отсутствует у М. bovis. Но в 1996 году Weil A. et al. обнаружили, что некоторые штаммы M.tuberculosis также могут не иметь данную генетическую область. Затем Sreevatsan S. et al. в 1996 г. предложили в качестве дифференциального маркера генетическую область katG, где в позиции 1388 у М. bovis находится тимин, а у M.tuberculosis гуанин, но данный полиморфизм, как было выяснено позже, наблюдается не всегда.
Для дифференциации М. tuberculosis и М. bovis Espinosa L.E., Monteros D.L. et al. в 1998 г. предложили проводить аллель-специфическую ПЦР, используя полиморфизм в генетической области pnsA, где в позиции 169 у М. bovis находится гуанин, а у M.tuberculosis цитозин. Проанализировав 116 клинических изолятов, которые относились по микробиологической характеристике к М. bovis, было выяснено, что 18 образцов содержали полиморфизм, специфичный для M.tuberculosis. Данные клинические изоляты являлись козьими. Из-за неоднозначности дифференцировки дополнительно проводили исследования, используя генетическую область оху R, в которой наблюдается полиморфизм в позиции 289. Все козьи изоляты в данной позиции у М. bovis имеют аденин.
Niemann S., Harmsen D. et al. в 2000 г. предложили для дифференциации М. bovis, M.tuberculosis, М microti и M.africanum использовать генетическую область gyrB и применили анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Magdalena и Zumarraga M. (1998, 1999) в своих работах описали генетические области RD2 и SENX3-REGX3, которые содержат повторяющиеся элементы, получившие обозначения MIRU (mycobacterial interspersed repetive units). В геномах микобактериального комплекса они обнаружили несколько десятков локусов, содержащих разное количество тандемноповторяющихся элементов MIRU. Число повторяющихся элементов в локусе SENX3-REGX3 может варьировать от штамма к штамму в зависимости от видовой принадлежности и региона выделения штамма, при этом штаммы М. bovis и M.tuberculosis попадают в разные группы.
Zumarraga М. с соавт. в 1999 г. сконструировал ПЦР-систему, основанную на амплификации генетической области RD2, в которой у М. tuberculosis имеется фрагмент 12,7 п.о. и отсутствует у М. bovis.
В 1993 году Hughes М., Skuce R., Beck L., Neill S. в Северной Ирландии провели сравнение методов идентификации микобактерий. По их мнению, методы с использованием нуклеиновых кислот имеют наилучший потенциал для быстрой и окончательной идентификации микобактерий, так как дают возможность определения эволюционного родства между и внутри различных видов. Эти методы типирования основаны на амплификации в ПНР специфичных генов, таких, как 16S rRNA, ген, присутствующий у всех прокариотов, а также ген 65 кДа может использоваться для дифференциации видов микобактерий (Fries J. et al., 1990; Sjobring U. et al., 1990; Shankar P. et al., 1991; Shawar R. et al., 1993; Vitale F. et al., 1998).
Исследования в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах
При определении специфичности тест-системы senX3-regX3 в реакциях, в
которых в качестве матриц использовали ДНК различных видов микобактерий (М. tuberculosis, М. bovis, М. avium, М. paratuberculosis, М. kansasii, М. terrae, М. fortuitum, М. gordonae, М. marinum, М. phlei, М. scrofulaceum) специфические ампликоны были получены только с ДНК М. tuberculosis и М. bovis, при этом полученные ампликоны имели разные размеры М. bovis — 440 п.н., М. tuberculosis - 370 п.н., т. е. система senX3-regX3 дифференцировала М. bovis от М. tuberculosis (фотография 1, дорожки 2,3).
Изучение возможности дифференциации культур микобактерий тест-системой senX3-regX3 провели на 78 культурах различных видов микобактерий (22 культуры М. bovis, 14 культур М. tuberculosis и 42 культуры различных видов атипичных микобактерий, М. avium и М. paratuberculosis).
Результаты проведенных исследований представлены в таблице 3.
Из данных таблицы видно, что при исследовании 22 культур М. bovis, специфические для М. bovis ампликоны размером 440 п.н. получены в 22 случаях, то есть исследуемые культуры М. bovis были правильно идентифицированы в 100 % случаях.
При исследовании 14 культур М. tuberculosis ампликоны размером 370 п.н. (М. tuberculosis) были обнаружены во всех 14 случаях, то есть культуры М. tuberculosis были правильно идентифицированы в 100 % случаях.
При исследовании 7 культур М. avium, ампликоны размером 370 п.н. (М. tuberculosis) и 440 п.н. (М. bovis) не были обнаружены ни в одном случае. Фотография
При исследовании 6 культур М. paratuberculosis, специфические ампликоны для М. tuberculosis и М. bovis не были обнаружены ни в одном случае. Полученные результаты исследований также позволяют считать, что тест-системой можно дифференцировать М. tuberculosis от М. bovis и от культуры М. paratuberculosis.
При исследовании 29 культур различных видов атипичных микобактерий (5 культур М. kansasii, 4 культуры М. marinum - 1 группа по классификации Раньона; 3 культуры М. gordonae, 4 культуры М. scrofulaceum — 2 группа; 5 культур М. terrae - 3 группа; 3 культуры М. fortuitum, 5 культур М. phlei — 4 группа по классификации Раньона), специфические ампликоны для М. tuberculosis - 370 п.н. и для М. bovis - 440 п.н. не были обнаружены ни в одном случае.
Полученные результаты исследований позволяют считать, что тест-система senX3-regX3 является специфичной и позволяет в 100 % случаях дифференцировать М. bovis от М. tuberculosis и различных видов атипичных микобактерий 1,2,3 и 4 группы по классификации Раньона.
Резюмируя все полученные результаты исследований по дифференциации культур различных видов микобактерий, следует указать, что при исследовании тест-системой senX3-regX3 22 культур М. bovis обнаружен ампликон М. bovis, т. е. получен положительный результат в 22 (100 %) случаях. При идентификации 14 культур М. tuberculosis, положительный результат был получен в 14 (100 %) случаях. При исследовании 42 культур М. avium, М. paratuberculosis и различных видов атипичных микобактерий отрицательный результат по ПЦР получен в 42 (100 %) случаях.
Полученные результаты исследований позволяют сделать вывод о целесообразности применения ПЦР-метода для дифференциации М. bovis от М. tuberculosis и от других различных видов микобактерий при диагностике туберкулеза, как современный экспресс-метод лабораторной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.
Изучение диагностической ценности ПЦР-метода в благополучных по туберкулезу хозяйствах, где установлена сенсибилизация животных атипичными микобактериями
Дальнейшие наши исследования были направлены на изучение диагностической ценности ПЦР-метода в благополучных по туберкулезу хозяйствах, где установлена сенсибилизация животных атипичными микобактериями.
При исследовании полимеразной цепной реакцией 43 проб крови от крупного рогатого скота из благополучных хозяйств в 7 (16,3 %) случаях были получены ложноположительные результаты по ПЦР.
Так, ранее было установлено, что эти хозяйства благополучны по туберкулезу, а причиной выявления реагирующих на туберкулин животных является сенсибилизация животных атипичными микобактериями. Кроме того, мы провели диагностический убой животных, давших положительные показания по ПЦР. При патологоанатомическом осмотре убитых коров характерные для туберкулеза изменения не были обнаружены ни в одном случае. Лабораторные исследования патматериала от убитых коров дали отрицательные результаты. Хозяйства благополучны по туберкулезу и в настоящее время.
Шаров А.Н. (2003) указывает, что при исследовании в ПЦР крови от 8898 голов реагирующего на туберкулин скота в различных хозяйствах, положительный результат реакции получен в 67 случаях (0,75 %), туберкулез подтвержден только в одном случае.. Автор считает, что результаты этого производственного испытания указывают на возможность применения ПЦР при контроле благополучия хозяйств по туберкулезу скота.
Мы не можем согласиться с этими данными, так как по нашим результатам исследований ПЦР-метод дает гораздо больше ложноположительных реакций (16,27%).
В неблагополучных по туберкулезу хозяйствах при исследовании полимеразнои цепной реакцией проб крови от 83 реагирующих на туберкулин коров, положительные результаты ПЦР получены в 15 (18,1 %) случаях. При выборочном диагностическом убое 5 реагирующих на туберкулин и с положительными показаниями по ПЦР коров, характерные для туберкулеза изменения обнаружены в 2 случаях, у остальных 3 коров характерные для туберкулеза изменения не найдены. Патматериал от этих 3 коров был исследован культуральным и биологическим методами. При посеве обработанных по методу А.П.Аликаевой проб патматериала, рост культур возбудителя туберкулеза не выявлен ни в одном случае, но при постановке биопробы на морских свинках, все зараженные лабораторные животные пали с характерными для туберкулеза патологоанатомическими изменениями. Эти исследования еще раз показывают, что диагноз на туберкулез необходимо ставить только комплексно с учетом всех методов диагностики. Так, в данном случае с помощью ПЦР-метода (системы senX3-regX3) и биопробы был поставлен диагноз на туберкулез. Тем не менее, необходимо учитывать, что, по нашим данным, в благополучных по туберкулезу хозяйствах при исследовании крови полимеразнои цепной реакцией выявляются ложноположительные результаты у здоровых животных в 16,27 % случаях.
Другой важный вопрос - возможность применения ПЦР для выявления возбудителя туберкулеза в патматериале, отобранного после убоя. Известно, что при исследовании патматериала от крупного рогатого скота в лабораторию поступают достаточно крупные участки органов, что плохо сочетается с микроколичествами образцов, которые используются для проведения полимеразнои цепной реакции. При анализе патматериала, подозрительного на туберкулез, применяют бактериологическое исследование. Перед проведением культурального исследования патматериал подвергается предпосевной обработке. В качестве предпосевной обработки мы использовали два известных традиционных метода: метод А.П.Аликаевой и метод Гона-Левенштейна-Сумиоши для сравнительного изучения и выяснения возможности использования образцов патматериала, обработанных по одному из этих методов, при исследовании методом ПЦР.
В своей работе мы исследовали полимеразной цепной реакцией (системой senX3-regX3) 22 пробы патматериала от явно больного туберкулезом крупного рогатого скота (с характерными для туберкулеза изменениями). Положительные результаты получены в 10 (45,5 %) случаях из 22. При сравнении ПЦР-метода и культурального метода при диагностике туберкулеза в данном случае было установлено, что полимеразная цепная реакция подтвердила туберкулез в 45,5 % случаев, а культуральный метод — в 62,5 % случаев. Тем не менее, следует отметить, что ПЦР-методом системой senX3-regX3 был дополнительно подтвержден туберкулез в трех случаях, когда культуральным методом не была выделена культура М. bovis из патматериала больного туберкулезом крупного рогатого скота. Кроме того, полученные результаты исследований показали, что пробы патматериала от больных туберкулезом животных, прошедшие обработку по методу А.П.Аликаевой и по методу Гона-Левенштейна-Сумиоши, обладают одинаковой способностью к выявлению ДНК М. bovis методом ПЦР. Однако, эффективность выявления ДНК возбудителя в пробах, прошедших такую обработку, была ниже, чем при культуральном исследовании.
Анализируя полученные результаты исследований, следует особо указать, что вызывает недоразумение тот факт, что по утверждению многих авторов ПЦР очень чувствительный метод. Однако, по результатам наших исследований, которые согласуются с результатами исследований некоторых производственных ветеринарных лабораторий, при исследовании патматериала от больных туберкулезом животных с характерными для туберкулеза изменениями, ПЦР-метод дает положительные показания в 45,5 % случаях, то есть меньше чем обладающий небольшой чувствительностью, традиционный культуральный метод выделения микобактерий туберкулеза.
