Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Современные представления о молекулярно-клеточных механизмах инфекционного процесса при туберкулезе 9
1.2. Теоретические и экспериментальные основы хемилюминесценции биологических тканей 16
1.3. Использование хемилюминесценции для диагностики болезней человекам животных 23
1.4. Заключение по обзору литературы 33
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 35
2.1. Материалы и методы 35
2.2. Выделение клеток крови и определение условий их максимальной хемилюминесценции
2.2.1. Способ выделения лейкоцитов 43
2.2.2. Изготовление стабилизирующего раствора 46
2.3. Хемилюминесценция иммунокомпетентных клеток крови лабораторных животных, экспериментально зараженных М. bovis 49
2.4. Хемилюминесценция иммунокомпетентных клеток крови телят, экспериментально зараженных M.bovis 56
2.5. Хемилюминесценция иммунокомпетентных клеток крови коров, экспериментально зараженных M.bovis 69
2.6. Результаты испытания диагностической эффективности иммунохемилюминесцентного метода в производственных условиях 80
ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 86
ВЫВОДЫ 97
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 99
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 100
ПРИЛОЖЕНИЕ
- Современные представления о молекулярно-клеточных механизмах инфекционного процесса при туберкулезе
- Теоретические и экспериментальные основы хемилюминесценции биологических тканей
- Материалы и методы
Введение к работе
В системе противотуберкулезных мероприятий решающая роль отводится диагностике, так как успех борьбы с этой антропозоонозной инфекцией во многом зависит от полного и своевременного выявления источников возбудителя болезни. Между тем, многолетний опыт использования традиционных методов диагностики туберкулеза выявил ряд свойственных им недостатков. Основной метод массовых аллергических исследований, туберкулиновая проба, не выявляет в стаде всех больных туберкулезом животных. Это вынуждает проводить многократные повторные исследования, что значительно затягивает сроки оздоровления неблагополучных стад (М.К.Юсковец, 1948, 1965, В.П.Урбан, 1982, 1998; Л.М. Ходун, 1985, 1987, 1988; А.С.Донченко, 1994, 2004; Н.П.Овдиенко, 1997).
В то же время туберкулиновая проба нередко проявляется неспецифически у животных в заведомо благополучных хозяйствах. При исследовании животных в благополучных по туберкулезу пунктах в случае выявления реагирующих на ППД-туберкулин животных значительная их часть подлежит диагностическому убою и последующему исследованию в условиях ветлабораторий. Для дифференциальной диагностики в этих случаях применяют громоздкую, длительную по времени и дорогостоящую схему исследований: симультанную пробу с туберкулином для птиц или КАМ, с последующим убоем и патологоанатомической экспертизой, бактериологическим и биологическим исследованиями биоматериала от убитых с диагностической целью животных (Л.М.Ходун, 1984; 1988; 1990; А.Х.Найманов, 1992; А.С.Донченко, 2000; В.Г.Ощепков, 2001, 2003).
В соответствии с действующими ветеринарными и санитарными правилами (1996 г.) при туберкулезе биоматериал от каждого убитого с диагностической целью животного высевают на твердые яичные питательные среды, заражают морских свинок и кроликов для определения
видовой принадлежности выделенных культур микобактерий и их вирулентности. Кроме того, для дифференциальной диагностики в ряде случаев используют гистологические исследования и серологические реакции: связывания комплемента (Э.Д.Лакман, И.В.Шлыгин, 1976; Ю.Я.Кассич, 1979; Л.М.Ходун, 1983); диффузной преципитации в агаровом геле (РДПА), непрямой гемагглюти нации (РИГА), бласттрансформации лейкоцитов (РБТЛ), торможения миграции лейкоцитов (Е.А.Суворов, 1968; Н.ГШвдиенко и др., 1980; М.В.Харитонов, 1983; Г.Г.Попова, 1985; Е.И.Буряк, 1987; А Л.Лысенко, 1987; F.Griffin,1988).
Но значительная трудоемкость, недостаточная информативность, длительность исследований (3-6 мес), большое число животных, необходимых для диагностического убоя, являются существенными недостатками указанных методов и делают их малопригодными для массовых исследований. Несовершенство методов дифференциальной прижизненной диагностики этого заболевания приводит к тому, что ежегодно на мясокомбинаты сдаются тысячи голов крупного рогатого скота, реагирующих на ППД-туберкулин и подозреваемых в заражении, но во многих случаях не являющихся истинными больными туберкулезом, а это неизбежно увеличивает прямые и косвенные потери животноводства. Возрастают они и за счет сокращения срока эксплуатации продуктивных коров и преждевременного убоя молодняка, не достигшего товарных кондиций (А.Н.Шаров,1982; А.С.Найманов, 1990, 1993; А.С.Донченко, ГО.А.Макаров,1997; А.И.Кузин, 1982).
Современные достижения зарубежной и отечественной науки в области биологии и медицины открывают возможности в создании нового поколения средств и методов диагностики туберкулеза с высокой чувствительностью и специфичностью.
В этом плане перспективны биофизические и иммунохимические методы, позволяющие разработать эффективные способы прижизненной диагностики туберкулеза. Наибольшее признание получили метод иммуноферментного анализа - ИФА, общий принцип которого состоит в том, что антигены или антитела фиксируются на твердой фазе, а затем выявляются с помощью соответствующих антител или антигенов, меченых пероксидазой хрена или другим ферментом путем определения ферментной активности в субстратах смеси по уровню окрашивания фермента (Y.Morris,C.Thorm,1985; Р.А.Хамзин и др., 1985; А.А.Нуррулин, 1986; Е.Маслов с соавт., 1986; T.M.Daniel, 1987; М.В.Андросова, 1987, 3989; Л.М.Ходун, 1989; Л.М.Ходун с соавт., 1990; Н.И.Цунская с соавт., 1991; Н.П.Овдиенко с соавт., 2001; О.А.Верховский с соавт., 2001; М.Ф.Губкина с соавт., 2002); полимеразная цепная реакция - ПЦР, которая дает возможность экспрессно выявлять ДНК микобактерий туберкулеза в клиническом материале (AJ.Hance,1988; B.Boddinghaus, 1999; Kaneko S. et al.,1995; Cheong.H.I. et al.,1996; А.Н.Шаров и др., 2002; M.B Чеснокова. и др. 2001, 2003; М.А.Владимирский и др.., 2003; А.Х.Найманов и др., 2004), а также биохемилюминесцентный анализ (А.И Журавлев, 1961, 1968, 1974, 1975; Э.А. Бурнштейн, 1964; А.А.Аревшатян, 1965, 1966; Н.А.Клипсон, Т.Г.Мамедов, 1965; Журавлев А.И., В.Н.Тростников, 1966; У.М.Авакян, 1967; Ю.А.Владимиров, С.Ф.Львова, З.П.Черемисина, 1966; Г.М. Баренбойм с соавт., 1966; ВА.Веселовский с соавт., 1963; Г.И. Лихштейн с соавт., 1966; Е.И Шуцкая., 1979; Н.К.Куликов, В.Ю.Куликов, 1985 и др.).
Высокая эффективность применения последнего биофизического теста в биологии и медицине, актуальность проблемы дифференциальной диагностики туберкулеза предопределили направленность наших исследований.
Современные представления о молекулярно-клеточных механизмах инфекционного процесса при туберкулезе
Туберкулез - инфекционное заболевание сельскохозяйственных животных и человека, наносящее огромный экономический и социальный ущерб обществу. Причиняемый ущерб складывается из потерь продукции животноводства вследствие падежа или вынужденного убоя, утилизации и преждевременной выбраковки животных, а также снижения санитарного качества и сортности продукции, потери племенной ценности животных, недополучения приплода (В.П.Урбан с соавт., 1991; А.С.Донченко, 1994; Ю.И.Смолянинов, 1995 и др.).
Характерные особенности патогенеза и патологической морфологии определяются древностью этой инфекции, хроническим течением и волнообразным проявлением клинико-анатомических форм. Возбудитель туберкулеза, попадая в пищеварительный тракт, легкие и другие ворота инфекции человека и животных, мигрирует по лимфатическим и кровеносным сосудам. Экзотоксины бактерий вызывают раздражение, а затем и повреждение ткани, эмиграцию нейтрофильных лейкоцитов, размножение макрофагов. Лизосомные ферменты фагоцитов усиливают альтеративную фазу воспаления, разрушают капилляры в очаге воспаления, который становится бессосудистым. Из поврежденных сосудов выделяется плазма крови, она свертывается и в смеси с омертвевшими элементами местных тканей образует казеозную массу, макроскопически напоминающую творог, весьма характерную для туберкулезного поражения. В творожистой массе довольно быстро откладываются глыбки извести, а впоследствии возможно значительное обызвествление очага некроза. При микроскопическом исследовании в относительно гомогенной некротической массе видны комковатые, сморщенные ядра и их обломки-следы кариопикноза и кариорексиса клеточных элементов (Н.З.Хазипов, 1985).
Специфические очаги- туберкулы могут возникать в любых органах и тканях зараженного животного и иметь размер от просяного зернышка до горошины, куриного яйца и более (М.К.Юсковец, 1965).
В патогенезе туберкулеза принято различать определенную стадийность: образование первичного и вторичного комплексов. При первичном заражении формируется первичный комплекс, который может быть полным (одновременное поражение регионарного и отдаленного лимфатических узлов или органов) и неполным (поражение только регионарного лимфатического узла). Из первичных очагов патогенные микобактерии могут попасть в кровь, что приводит к генерализации инфекционного процесса и развитию в различных органах и тканях вторичных туберкул (вторичный комплекс).
При генерализованной форме туберкулеза и обширных поражениях в легких нарушается газообмен, угнетается эритропоэз, наблюдается анемия, понижается продуктивность, наступает истощение и смерть животного (М.К.Юсковец, 1965; А.И.Кузин, 1992).
Иммуногенез начинается с момента первоначального контакта возбудителя с иммунокомпетентными клетками и зависит от многих факторов, прежде всего, от биологических свойств микобактерии, функциональных особенностей клеток хозяина и условий, в которых происходит их взаимодействие (В.П.Урбан, В.П.Шишков и др., 1991).
Структура клеточной стенки микобактерии по сложности организации является уникальным образованием, не имеющим аналогов среди других прокариотических клеток. Внутренний слой клеточной стенки -цитоплазматическая мембрана - состоит главным образом из фосфолипидов. Гидрофильные группы этих соединений находятся на поверхности, а гидрофобные цепи жирных кислот располагаются внутри мембраны навстречу друг другу, образуя слой, физические свойства которого (текучесть, проницаемость и др.) регулируются составом жирных кислот (E.D.Wills, 1965; А.Л.Лазовская, Л.М.Пинчук, 1988; Я.Кагава, 1985).
При туберкулезе, также как и при других бактериальных инфекциях, различают три стадии иммунологической реактивности: неспецифическая, направленная не на антиген бактерий, а на саму бактериальную клетку, и специфическая, обеспечивающая гуморальную и клеточную защиту: образование Т- и В-системы лимфоцитов, а также иммуноглобулинов соответствующих классов; стадия антибактериальной защиты, которая определяется феноменами повышенной чувствительности — немедленной (ПЧНТ) и замедленной (ПЧЗТ) (Э.Н.Шляхов, 1977).
Патологические процессы, протекающие в организме, как правило, влияют на состав и физико-химические свойства компонентов крови, поэтому одним из важнейших аспектов иммунологических исследований является изучение взаимодействия лимфоцитов и макрофагов. Клетки этих типов участвуют в самых различных реакциях иммунитета. Обработка антигена макрофагами, концентрирование антигена на поверхности макрофагов, возможно, образование комплекса макрофагальная РНК+антиген играют важную роль в индукции ПЧЗТ, антителообразования, толерантности и иммунологической памяти. В процессе индукции ГЗТ и выработки приобретенной резистентности к туберкулезу имеет место кооперативное взаимодействие лимфоидных клеток (Р.В.Петров, 1982).
Клеточный иммунитет является центральным звеном резистентности к возбудителю туберкулеза, и клетки-эффекторы клеточного иммунитета оказывают свое регулирующее действие на течение туберкулезной инфекции, усиливая фагоцитарную активность макрофагов как непосредственно, так и с помощью синтезируемых ими медиаторов (Descamps-Latsha,1982; А.Г.Хоменко, М.М.Авербах и др., 1988).
Теоретические и экспериментальные основы хемилюминесценции биологических тканей
Биолюминесценция - свечение живых организмов и биосубстратов, превышающее их равновесное тепловое излучение за счет энергии экзотермических биохимических или химических процессов, протекающих в целостном организме, его тканях и органах (А.И.Журавлев, 1974).
Хемилюминесцентный анализ - метод исследования различных объектов под действием индукторов, вызывающих хемилюминесценцию (сверхслабое метаболическое свечение) этих объектов.
В 60-х годах экспериментально было обнаружено явление спонтанного, непрерывного сверхслабого свечения тканей животных и их гомогенатов в видимой области спектра и спонтанного, непрерывного сверхслабого свечения тканевых липидов, пищевых жиров и ненасыщенных жирных кислот в присутствии кислорода in vitro при температурах, начиная с 10 -20С (Б.Н.Тарусов и др., 1961). В дальнейшем ученые установили, что наблюдаемое свечение тканей и липидов возникает в результате свободнорадикального автоокисления ненасыщенных жирных кислот как свободных, так и входящих в состав липидов (А.И.Журавлев, Б.Н.Тарусов, 1965); интенсивность свечения тканевых липидов, пищевых жиров и ненасыщенных жирных кислот (олеиновой, линолевой) на два порядка выше интенсивности свечения тканей; свечение имеет максимум в красной и близкой инфракрасной области (А.И. Журавлев с соавт., 1964); интенсивность свечения снижается при введении в липиды ингибитора свободнорадикального окисления - нафтола (Б.Н.Тарусов, А.И.Журавлев, 1965). Экспериментально было доказано участие квантов, квантовых явлений и электронных возбужденных состояний в нормальном темновом метаболизме животных и обнаружено, что кванты видимого участка спектра и соответствующие им электронные состояния являются продуктом метаболизма липидов (А.И.Журавлев, В.Н. Корженко, 1963; А.И. Журавлев, Ю.Н. Филипов, В.В. Симонов, 1964; Б.Н.Тарусов, А.И. Журавлев, 1961; Б.Н.Тарусов, 1962).
Необходимым условием биолюминесценции является химическая реакция окисления, поэтому явление эндогенного свечения называют также биохемилюминесценцией (БХЛ). Известные виды БХЛ можно отнести к одному их двух типов: спонтанная или индуцированная.
Спонтанная БХЛ - энергию которой поставляют эндогенные химические и биохимические экзотермические реакции. Разновидности спонтанной БХЛ: экзотическая БХЛ, сверхслабое митогенетическое излучение, сверхслабое метаболическое свечение.
Индуцированная БХЛ - энергию которой поставляют химические и биохимические процессы, индуцированные в биосубстратах мощным энергетическим воздействием извне: ультразвуком, ультрафиолетом, ионизирующей радиацией.
Сверхслабое метаболическое свечение (ССС) имеет несколько особенностей:
а) энергию для ССС поставляет процесс неферментативного свобод нор адикального окисления тканевых липидов;
б) интенсивность ССС в норме очень низкая, так как свободнорадикальное окисление в живых тканях тормозится системой тканевых антиокислителей,
в) ССС универсально, т.е. оно свойственно всем тканям животных и растительных организмов;
г) основными энергетическими субстратами сверхслабого метаболического свечения являются жиры и липиды. Белки, аминокислоты, а также их водные растворы практически не хемилюминесцируют;
д) ССС не оказывает прямого воздействия на интенсивность клеточного деления;
е) спектр ССС захватывает область длин волн 360 - 800 нм; ж) ССС очень слабо, в нормальных условиях не улавливается невооруженным глазом, однако его измерение проводится объективным физическим методом с помощыо чувствительных фотоэлектронных установок.
Биохемилюминесценция является прямым доказательством наличия в тканях возбужденных электронных состояний - активных состояний молекулярных форм. Переход любого биологически важного соединения в возбужденное состояние значительно увеличивает его реакционную способность, скорость его вступления в ферментативные, гормональные и иммунологические реакции. Возбужденные электронные состояния молекул, т.е. состояния, при которых в молекуле один электрон переведен на высший энергетический уровень, непрерывно присутствуют в тканях и являются одним из показателей гомеостаза. Для получения согласующегося с опытом результата необходимо предположить, что электромагнитное поле вызывает не только переходы атомов из основного состояния в возбужденное, но и переходы из возбужденного состояния в основное с излучением квантов. Спонтанное излучение возбужденного атома с точки зрения квантовой теории происходит скачком. Предсказать момент испускания атомом кванта невозможно, можно только говорить о среднем времени жизни атома в возбужденном состоянии (Е.И.Бутиков, А.А.Быков, А.С.Кондратьев, 1982).
Материалы и методы
Данная работа выполнена в лаборатории диагностики и микробиологии туберкулеза животных и лаборатории клеточной биотехнологии ГНУ ВНИИБТЖ СО РАСХН.
При проведении экспериментов были использованы 15 морских свинок, 15 кроликов, 4 теленка четырехмесячного возраста, 16 коров. При испытании диагностической эффективности хемилюминесцентного метода в производственных условиях были обследованы 96 коров, в т.ч. 66 коров из благополучных по туберкулезу хозяйств и 30 - из неблагополучных по туберкулезу хозяйств.
Для аллергических реакций использовали ППД-туберкулин для млекопитающих производства Курской биофабрики: серия 56, контроль 56, срок годности до 9.10.1995 г.; серия 23, контроль 23, срок годности до 5.08.1997 г.; серия 17, контроль 17, срок годности до 30.10. 2002 г.; серия 1, контроль 1, срок годности до 23.01.2006 г.
Для определения хеми люминесценции (ХЛ) клеток крови лабораторных животных, телят и коров использовали люминометр серии CL3604, выполненный в виде единого конструктива и работающий под управлением ПЭВМ типа IBM XT/AT.
Люминометр предназначен для исследования кинетики хемилюминесценции биологически активных объектов. Допускает параллельное измерение до 36 образцов, загружаемых в термостатируемый кюветный барабан, имеет систему термостатирования в заданном диапазоне, систему промывки магистралей, сервисное программное обеспечение (программное обеспечение рассчитано на работу с EGAWGA мониторами).
Электропитание монитора осуществляется от однофазной сети переменного тока напряжением 220 В с частотой 50 (+1/- 1) Гц с заземлением. Охлаждение термостатируемого барабана осуществляется водой, а ФЭУ — с помощью полупроводникового микроохладителя типа ТЭМО — 4, с отводом тепла из зоны нагрева проточной водой от вакуумного насоса. Возможна подача воды из буферной емкости водяного столба не более 1,5 м. Прибор нельзя подключать к водопроводной магистрали напрямую во избежание обрыва трубопроводов внутри прибора из-за большого напора и возможных пульсаций питающей сети.
Блок управления прибором собран на отдельной плате и включает в себя функциональные узлы.
Программное обеспечение. Дискета с программным управлением идет в комплекте с прибором. В первую ячейку кюветного барабана устанавливается кювета с эталоном яркости.
Разработка твердотельных радиолюминесцентных эталонов яркости ЭЯ-1 и подобных ему аналогов, а также современных фотонносчетных устройств позволяет подойти к фотометрии хемилюминесцентного излучения на единой метрологической основе. Эталон яркости ЭЯ — 1 представляет собой радиолюминесцентный источник на основе светосостава постоянного действия и возбудителя - изотопа С14. Диапазон интенсивности излучения: 1х1015 - ЗхЮ10 квантов за секунду с 1 см2, спектр излучения: 400 - 600 нм. Величина погрешности относительных изменений интенсивности светового потока составляет 2-10 % в зависимости от номинального значения интенсивности эталона. Наличие ФЭУ и эталонов яркости со спектральной характеристикой, близкой к спектру хемилюминесценции биологических сред, в сочетании с одноэлектронным режимом ФЭУ, термостабилизацией ФЭУ и проб, а также компенсацией фона ставит измерение хемилюминесценции на объективную метрологическую основу, обеспечивая контроль стабильности аппаратуры и воспроизводимость результатов измерений.
Следует отметить, что аналогичный хемилюминесцентный эталон яркости ЭЯ - 1 был использован биологами и медиками при количественной оценке ряда хемилюминесцентных реакций («АТФ-люциферин-люцифераза» и «люцегинин-перекись водорода-каталаза») (И.М. Карнаух, Е.П Сидорик, М.И. Данко, Е.В. Гордиенко, Е.А. Баглей, И.Ф. Пельтек, 1976).
Благодаря нормированию одноэлектронных характеристик ФЭУ типа «Квантакон» (таких как плотность темновой эмиссии в одноэлектронном пике, одноэлектронное разрешение и коэффициент усиления первого динода), а также разработке средств метрологического обеспечения измерений сверхслабых потоков излучения появилась возможность перехода от качественных сравнительных оценок уровня свечения биологических объектов к количественным измерениям свечения в единицах квант в секунду на единицу объема или поверхности светящегося биологического объекта.
Удобство и даже в некотором смысле неизбежность применения единицы квант в секунду связаны с тем, что в заданном объеме реагента биохемилюминесцентные реакции излучают макроскопически однородно. Это излучение имеет характер некоррелированных явлений, при которых с поверхности источника излучаются отдельные кванты света, моменты вылета которых между собой не связаны, поскольку каждая молекула реагирует независимо от других подобных ей молекул. Таким образом, явление биохемилюминесцентного излучения в целом есть результат несвязанных между собой световых реакций отдельных молекул при отсутствии какого-либо управляющего механизма в этих реакциях (И.Х.Костюченко и Др., 1978; И.М.Карнаух, Б.В.Урысан, 1983).
