Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы . 9
1.1. Общие сведения о туберкулезе крупного рогатого скота 9
1.2. Виды микобактерий, их свойства и роль в заражении крупного рогатого скота 11
1.3. Методы диагностики туберкулеза крупного рогатого скота 18
1.3.1. Прижизненные методы диагностики туберкулеза 18
1.3.2. Послеубойная диагностика с видовой идентификацией микобактерий 23
1.4. Использование метода спектофотометрии для исследования биообъектов и диагностики болезней животных 37
1.5. Заключение по обзору литературы 40
2. Собственные исследования 42
2.1. Материалы и методы исследований 42
2.2. Разработка методологических подходов использования спектрофотометрии для диагностики туберкулеза 45
2.2.1. Приборное, лабораторное и программное обеспечение экспериментов 45
2.2.2. Подбор оптимальных разведений гемолизата для получения характерных УФ-спектров, пригодных для диагностических исследований на туберкулёз 48
2.2.3. Выбор диапазона волн для получения диагностически значимых спектров гемолизата морских свинок и крупного рогатого скота 50
2.2.4. Получение спектров гемолизата лабораторных животных, зараженных патогенными и атипичными микобактериями 53
2.2.5. Сравнительная оценка эффективности традиционных и разработанного методов диагностики туберкулёза животных 66
2.3. Определение спектров гемолизата от больных туберкулезом и здоровых коров 73
2.4. Применение спектрофотометрии в эксперименте для дифференциальной диагностики лейкоза и туберкулеза крупного рогатого скота 76
Обсуждение 80
Выводы 91
Практические предложения 93
Список литературы
- Прижизненные методы диагностики туберкулеза
- Разработка методологических подходов использования спектрофотометрии для диагностики туберкулеза
- Подбор оптимальных разведений гемолизата для получения характерных УФ-спектров, пригодных для диагностических исследований на туберкулёз
- Сравнительная оценка эффективности традиционных и разработанного методов диагностики туберкулёза животных
Прижизненные методы диагностики туберкулеза
По краткому определителю бактерий Берги, под редакцией Дж. Хоулта (1980), микобактерий являются обширной группой микроорганизмов, которые по своим морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам отнесены к порядку Actinomycetales, семейству Mycobacteriaceae, роду Mycobacterium.
Род микобактерий включает 30 идентифицированных видов, кроме того, по данным Q. Kubica (1979), имеется около 200 несистематизированных видов.
Микобактерий туберкулеза теплокровных животных и человека, по определителю D. Bergey (1974), по вирулентности, культурально-биологическим и биохимическим свойствам В настоящее время к патогенным микобактериям относят такие виды М. poykilothermorum - паразитирующий у холоднокровных (лягушки, рыбы, змеи и т.п.), М. paratuberculosis - возбудитель паратуберкулеза, М. leprae -возбудитель проказы и М. africanum - возбудитель туберкулеза на африканском континенте.
Кроме этих, истинно патогенных видов, в природе существует большая поливидовая группа так называемых атипичных (условно патогенных) микобактерий, которые не вызывают, как правило, у человека и животных сильных патологий, но часть их видов (М. smegmatis, М. fortuitum и др.) способны индуцировать у животных аллергические реакции, выявляемые туберкулином, а у человека локальные поражения кожи и легких (А.С. Донченко, В.Н. Донченко, 1994 и др.).
На сегодняшний день отсутствует общепринятая научная систематизация микобактерий, учитывающая как фено-, так и генотипические особенности микроорганизмов. Наиболее распространенной остается классификация атипичных микобактерий по Е. Ranyon (1959), в которой выделяются 4 группы:
Группа 1 - фотохромогенные микобактерий, характерным признаком которых является пигментация колоний после экспозиции культуры на свету. Типичным представителем этой группы является М. kansasii.
Группа 2 - скотохромогенные, отличительной особенностью их является образование желто-оранжевого пигмента в темноте. Эта самая большая группа среди атипичных микобактерий (60-70%).
Группа 3 - нефотохромогенные, представители этой группы имеют слабую пигментацию или непигментированы.
Группа 4 - быстрорастущие, к ним относятся исключительно кислотоустойчивые сапрофиты (М. phlei, М. smegmatis, М. fortuitum и др.).
В современной систематике особого внимания заслуживает птичий вид -М. avium. На основании нумерического анализа, серологических характеристик и изучения патогенности Е. Ranyon (1959), М. Tsucamura (1962), В.П. Шишков, А.В. Ткачев-Кузьмин, СП. Качанова (1986), его относят к третьей группе атипичных микобактерий, объединяя в комплекс avium-intracellularae.
Характерной особенностью микроорганизмов рода Mycobacterium является их кислотоустойчивость, т.е. способность прочно удерживать окраску фуксином или другими анилиновыми красителями при последующем воздействии растворами минеральных кислот. На этом свойстве основана дифференциальная окраска микобактерий по Цилю-Нильсену. Возбудитель туберкулеза в биоматериале имеет вид тонких, слегка изогнутых сплошных или зернистых палочек, длина которых колеблется в пределах 0,8-5,5 мкм, а поперечный диаметр 0,2-0,6 мкм. Микобактерии являются аэробами, неподвижны, окрашиваются по Грамму положительно. Возбудитель туберкулеза и другие микобактерии отличаются плео- и полиморфизмом. Изменения морфологических, культураль-ных и биологических свойств могут носить как временный, так и постоянный характер. Полиморфизм проявляется в образовании различных форм: нитевидных, актиномикотических, зернистых, кокковидных и некислотоустойчивых вариантов.
По данным Л.Н. Кац, А.В. Волк, П.Д. Константиновой (1974, 1981), В.Д. Тимакова, Г.Я. Каган (1973), к измененным формам микобактерии, имеющих значение в патологии человека и животных, относятся различные варианты, дефектные по клеточной стенке. Повреждения, связанные с дефектом, частичной или полной утратой клеточной стенки, приводят к значительным морфологическим и функциональным изменениям микобактерии, проявляющимся в появлении протопластов, сферопластов, форм гетероморфного роста и L-форм бактерий стабильных или нестабильных.
В структурном отношении микобактерии состоят из клеточной стенки, цитоплазматической мембраны и внутриплазматических мембранных структур, цитоплазмы и нуклеоида. Ряд авторов: А.А. Поляков, А.В. Куликовский (1971), Л.Н. Кац, С.А. Гулевская, Л.П. Зубок (1972), С.А. Гулевская, М.Н. Немсадзе (1974), А.Г. Хоменко, В.В. Ерохин (1982), Ю.С. Ченцов (1984), Т. Imaeda, М. Oqura (1963), Н.К. Kolbel (1978) - на поверхности микобактерии выявляют слой, определяемый как микрокапсула, причем интенсивность ее развития и строения находится в прямой зависимости от количества экстрагируемого корд-фактора. Клеточная стенка имеет трехслойное строение и выполняет структурную и защитную функции. Цитоплазматическая мембрана также имеет трехслойное строение и инвагинируясь в цитоплазму формирует внутриплазматическую мембранную систему (мезосомы). Цитоплазма микобактерии представляет собой основную массу клеточного содержимого, представленную сложной коллоидной системой. Цитоплазма содержит гранулы, представленные, в основном, рибосомами, вакуоли и другие включения. Нуклеоид микобактерий представлен ДНК-содержащим материалом в виде фибрилл, гранул и конгломератов, располагающимся в осмиофобной зоне в центральной части клетки.
По данным А.В, Куликовского (1979), ультраструктура атипичных микобактерий сходна с субмикроскопической организацией патогенных микобактерий, но имеет и определенные отличия.
Химический состав микобактерий туберкулеза изучали P.O. Драбкина (1963), Т.Е. Коронелли (1984), В.П. Шишков (1986), С. Ratledge (1982) и др. Ими установлено, что в микобактериях находится вода (80,9%), зольные (2,6%) и органические вещества (11,6%), в том числе липиды, белки, полисахариды и др. Из зольных веществ в микобактериях обнаружены фосфор, кальций, магний, натрий, калий, железо, цинк и марганец. Все вышеназванные вещества находятся в сложных соединениях, поэтому проявление их биологических свойств не тождественно проявлению свойств отдельных компонентов.
По данным Н.К. Kolbel (1978), белки составляют 57-84% сухой массы микобактерий, они имеют ряд характерных свойств, каждому виду микобактерий присущ свой набор характерных белковых фракций, которые можно использовать для идентификации различных видов микобактерий. Кроме того, белки микобактерий содержат до 18-20 аминокислот. Из микобактерий туберкулеза выделены туберкулопротеиды, которые являются полными антигенами, вызывая в организме животных специфические антитела. Кроме них выделен нуклеопротеид, родственный нуклеопротеиду клеток соединительной ткани животных и человека.
Разработка методологических подходов использования спектрофотометрии для диагностики туберкулеза
За основу прижизненной диагностики туберкулеза сельскохозяйственных животных в настоящее время принята внутрикожная туберкулиновая проба (Н.П. Овдиенко, А.И. Кузин, 1980; А.Н. Шаров, 1982; Н.П. Овдиенко, А.Х. Найманов, 1989; А.С. Донченко, В.Н. Донченко, 1994; Н.П. Овдиенко, П.Н. Пыталев, А.Х. Найманов, А.П. Шаров, В.А. Бричко, А.С. Донченко, Б.Я. Хайкин, Л.М. Ходун, В.И. Околелов, В.М. Авилов, В.Ф. Пылинин, В.А. Седов, В.И. Косенко, 1996). При этом используются аллергены (туберкулины) двух типов: один для исследования млекопитающих, второй - для птиц. Оба туберкулина выпускают в высушенном виде или в виде стандартного раствора, готового к применению.
Туберкулин вводят строго внутрикожно: крупному рогатому скоту, буйволам, зебувидным, оленям (маралам) в область средней трети шеи; быкам-производителям - в одну из подхвостовых складок; верблюдам - в кожу брюшной стенки в области паха на уровне горизонтальной линии седалищного бугра; свиньям - в области средней части наружной поверхности уха в двух сантиметрах от его основания (в кожу одного уха вводят туберкулин для млекопитающих, в кожу другого - туберкулин для птиц); козам, овцам, собакам, обезьянам и пушным зверям - в область внутренней поверхности бедра или локтевой складки (норкам - в верхнее веко), курам - в бородку, гусям и уткам - в подчелюстную складку.
Учет и оценку реакции на туберкулин у крупного рогатого скота, буйволов, зебувидных, верблюдов и оленей проводят через 72 часа после введения препарата; у коз, овец, свиней, собак, кошек, обезьян, пушных зверей - спустя 48 часов; у птиц - через 30-36 часов. Положительной реакцией на туберкулин считают при утолщении кожной складки 3 мм и выше у крупного рогатого скота, у всех других видов животных, в том числе, у буйволов-производителей на 2 мм.
Согласно санитарным и ветеринарным правилам «Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных» (1996), в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах животных, реагирующих на туберкулин, признают больными, в благополучных - их убивают для уточнения диагноза (путем патологоанатомических, гистологических и бактериологических исследований).
А.Н. Шаров (1982), Н.П. Овдиенко, А.Х. Найманов (1989), В.Г. Ощепков с соавт. (1997, 1999), и другие отмечают, что при выборе животных для диагностического убоя нужно также учитывать, что положительная реакция на внутрикожно введенный аллерген (туберкулиновая проба) может быть следствием носительства животными не только микобактерий туберкулеза, но и близкородственных по антигенной структуре микобактерий паратуберкулеза и атипичных микобактерий.
А.С. Донченко (1972, 1976, 1977), М.А. Сафин (1981), П.Н. Смирнов, В.А. Апалькин, Ф.А. Волков (1994), Ю.И. Смолянинов, A.M. Падалица (1995), A.M. Падалица (1997), В.И. Околелов (2002) установили, что могут быть псевдоаллергические реакции на туберкулин при эндо- и эктопаразитах (эхинококкоз и др.), актиномикозе подчелюстных лимфоузлов, гнойно-некротических процессах и нарушении обмена веществ.
П.Н. Смирнов, А.С. Донченко, С.Н. Магер (1992) выявили тесную корреляционную взаимосвязь между уровнем инфицированности стад вирусом лейкоза и реагированием коров на туберкулин.
Проведенный анализ зарубежной научной литературы по данной проблеме (I. Nassal, 1974; Т. Schlisser, 1976; J. Kanter, I. Roswurn 1978; P. Saifelder et. al., 1983; J. Sanhez, R. Rossel 1983) показал, что в 53% случаев в странах мира природа парааллергии животных к туберкулину обусловлена в основном микобактериями птичьего вида и авиаподобными, в 30% -атипичными микобактериями. В отдельных стадах отмечалась сенсибилизация крупного рогатого скота к туберкулину за счет микобактерий паратуберкулезного энтерита, паразитарной инвазии, стресса, гнойно-некротических процессов в органах и тканях.
Для дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций от специфических А.Н. Шаровым, Э.С. Плотниковым (1980) была предложена симультанная проба с использованием ППД туберкулина для млекопитающих и комплексного аллергена из атипичных микобактерий (КАМ). Вместе с тем, по результатам А.В. Ткачева-Кузьмина (1981), Л.М. Ходуна и др. (1984), B.C. Сысоева (1985), В.А. Авилова, В.Ф. Пылинина (1992) и др., в большинстве случаев, из-за получения неопределенных результатов этой пробы, невозможно уточнить эпизоотическую обстановку по туберкулезу в стаде.
С целью дифференциальной диагностики туберкулеза в ряде случаев используют внутривенную, глазную туберкулиновые пробы, а также реакцию связывания комплемента (РСК) и реакцию ингибиции миграции лейкоцитов (РИМЛ) и др.
Официальная «Методика внутривенной пробы с применением ППД туберкулина для млекопитающих» (1990) предусматривает использование этой пробы только в благополучных по туберкулезу стадах крупного рогатого скота с целью отбора животных (из числа реагирующих на внутрикожную пробу) для диагностического убоя.
По данным А.И. Кузина (1974), А.С. Донченко (1971), А.С. Латышева (1971), М.А. Сафина (1971), И.Т. Нечьваль и др. (1973), П.С. Лазарева и др. (1974), М.М. Григорьева с соавт. (1980), I. Krucku (1973), А. Larsen (1975), I. Kovats et. al. (1979), установлено, что внутривенное введение туберкулина больным туберкулезом животным повышает температуру тела в течение 6-Ю часов. А.С. Донченко, В.Н. Донченко (1994) отмечают, что в отдельных случаях допускается применять на крупном рогатом скоте одновременно с внутрикожной туберкулиновой пробой, глазную туберкулиновую пробу. Свободный от возбудителя туберкулеза, сенсибилизированный атипичными микобактериями и не привитый вакциной БЦЖ скот не реагирует на глазное введение туберкулина. Динамика показаний этой реакции непостоянна, в основном животные реагируют на повторное введение туберкулина на 3, 6, 9, 12-й час читки реакции. Эта проба существенно дополняет внутрикожную, особенно на коровах старше 6 лет.
В качестве дополнительного диагностического теста при туберкулезе крупного рогатого скота Ю.Я. Кассич (1979), Э.Д. Лакман, И.В. Шлыгин (1976, 1980) предложили реакцию связывания комплемента (РСК).
И.Г. Бузмаков (1980), А.И. Кузин (1981), А.С. Донченко с соавт. (1980, 1984) предложили РСК для дифференциации туберкулеза и паратуберкулеза использовать с гомологичными и моновидными антигенами из атипичных микобактерий.
Подбор оптимальных разведений гемолизата для получения характерных УФ-спектров, пригодных для диагностических исследований на туберкулёз
Все остальные культуры растут на среде Левенштейна-Иенсена как с добавлением салицилата натрия, так и с добавлением ПАСК. Однако, у культуры птичьего вида отмечали незначительную задержку роста и снижение его интенсивности с хорошего в контроле до умеренного в эксперименте. Культуральные свойства выросших культур микобактерии были идентичными как в опыте, так и в контроле.
Полученные результаты свидетельствуют, что салицилат и парааминосалицилат натрия (ПАСК) не всегда подавляют рост микобактерии туберкулеза бычьего вида, что затрудняет оценку результатов теста. Хлорид натрия в 5%-ной концентрации полностью ингибирует рост всех штаммов M.bovis и всех медленнорастущих атипичных микобактерии. Рост М. smegmatis u М. phlei на среде с добавлением хлорида натрия практически не отличается от контроля.
Проведенные тесты позволяют дифференцировать культуры на микобактерии туберкулеза, а атипичные микобактерии отнести к различным группам по Раньону, но все они длительны по времени исполнения.
Кроме того, исследуемые культуры были использованы для проведения ряда биохимических тестов, который включает определение: ниацина, гидролизата Твин-80, активности каталазы при +68С, и деградации салицилата или парааминосалицилата натрия. При изучении биохимической активности культур - М. bovis и полевого изолята получили следующие результаты: культуры являются ниацинотрицательными, со слабо выраженной каталазной активностью, которая при нагревании до 68С в течение 30 минут исчезает. Данные по определению ферментативной активности указанных культур, приведенные в табл. 3, свидетельствуют, что они являются микобактериями туберкулеза бычьего вида и совпадают с результатами бактериологического и биологического исследований.
При подкожном заражении свинок микобактериями туберкулеза бычьего вида, у всех животных на 5-6-й день в месте введения культуры развивается воспалительный инфильтрат, переходящий в дальнейшем в абсцесс. На 6-10-й день увеличились регионарные лимфатические узлы, достигающие через 30 дней размеров горошины. У морских свинок, зараженных микобактериями М. bovis полевого изолята, абсцессы вскрывались на 10-12-й день и на их месте к 13-15-му дню появлялись хорошо выраженные, незаживающие язвы с казеозными массами. У свинок, которым вводили музейные культуры бычьего вида, абсцессы вскрывались на 17-19-й день, язвы формировались на 22-23-й день и их размеры оказались несколько меньше, чем у животных, которым вводили полевой изолят бычьего вида. Продолжительность жизни морских свинок после заражения М. bovis составляла 28-37 дней.
Внутривенное заражение кроликов, как музейными штаммами, так и полевым изолятом бычьего вида вызывало развитие генерализованной инфекции с обширными поражениями легких, с последующей гибелью животных в течение 25-35 дней.
Подкожное введение морским свинкам микобактерий птичьего вида вызывало у них местную воспалительную реакцию в виде абсцессов, которые со временем подвергались рубцеванию и увеличение регионарных лимфоузлов. Гибель животных не наступала.
Штамм № 9 М. avium был патогенен для кур при введении бактериальной суспензии в подкрыльцовую вену, а также для кроликов при внутривенном заражении.
Введение морским свинкам, кроликам и курам культур М. smegmatis, и М. phlei не вызывало у животных развития патологического процесса.
Проведенные исследования еще раз подтверждают, что для идентификации микобактериальной культуры необходимо проводить весь комплекс исследований, включающий изучение морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических и биологических свойств. При этом минимальным сроком идентификации можно считать 2-3 месяца. Кроме того, ни один из проведенных тестов не может быть использован исключительно для определения вида микобактерий.
В то же время, параллельно проводимые испытания по использованию спектрофотометрии для прижизненной диагностики туберкулеза показали, что предварительный диагноз по спектру гемолизата от больных туберкулезом морских свинок можно получить в течение 10 минут с момента взятия крови.
Для примера приводим данные спектров гемолизата морских свинок, больных туберкулезом и здоровых (рис. 12). У зараженных морских Рис. 12. Спектры гемолизата морских свинок в области длины волны 415-420 нм М. bovis шт. 8 начиная с 5-х суток регистрировались характерные пики (коэффициенты поглощения) М-3166,67, т±366,6 в области 415-420 нм. У здоровых лабораторных животных эти значения составили М-2223, т±33,3. Математическая обработка экспериментальных данных выявила достоверность различий. Значение вероятности Р по критерию Стьюдента составило 0,05.
Определение спектров гемолизата от больных туберкулезом и здоровых коров При изучении спектров поглощения гемолизата от коров больных туберкулезом установлено, что имеется характерный пик в области 415 нм с коэффициентом поглощения при туберкулезе 2800-3600, контроль составил 1700-2200 (рис.13).
У здоровых животных коэффициенты поглощения составили М-1792, m ±27,7, а у коров инфицированных возбудителем туберкулеза бычьего вида, соответственно М-3055, m ± 91,0. Математическая обработка экспериментальных данных выявила достоверность различий. Значение вероятности Р по критерию Стьюдента составило 0,05.
Анализируя гематологические показатели от коров больных туберкулезом по лейкограмме (рис. 14), мы установили, что при туберкулезе наблюдается выраженный лимфоцитоз и эозинофилия. Количество лимфоцитов по сравнению с контрольными животными увеличивается в 1,2 раза, что, по всей видимости, связано с мобилизацией защитных сил организма в ответ на действие возбудителя болезни. Повышение на 1,5 раза количества эозинофилов можно рассматривать как аллергическую реакцию на присутствие чужеродного агента. 2.4. Применение спектрофотометрии в эксперименте для дифференциальной диагностики лейкоза и туберкулеза крупного рогатого скота
При изучении секторов гемолизата от коров больных лейкозом крупного рогатого скота установлено, что имеется характерный пик в области 415 нм с коэффициентом поглощения 2400-2700, контроль составил 1700-2200 (рис. 15). У животных отмечается сдвиг нейтрофильного ядра влево за счет появления миелобластов и промиелоцитов, юных и палочкоядерных нейтрофилов. Содержание лимфоцитов увеличено в 1,6 раза по сравнению со здоровыми животными (рис. 16).
У здоровых животных коэффициенты поглощения составили М-1792, т+27,7, а у больных коров, соответственно М-2446, т+23,2 (Р 0,05). Математическая обработка экспериментальных данных выявила достоверность различий.
При одновременном сравнении спектров гемолизата от больных туберкулезом, лейкозом и здоровых коров по характерным пикам (коэффициенты поглощения) при туберкулезе - 2800-3600, лейкозе - 2400-2700, у здоровых животных - 1700-2200 можно проводить дифференциальную диагностику (рис. 17).
Анализ полученных результатов позволяет считать, что по спектрам поглощения гемолизата, полученного от коров больных туберкулезом и лейкозом, можно проводить дифференциацию туберкулеза от лейкоза и в дальнейшем разработать дополнительный метод прижизненной диагностики туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота с использованием спектрофотометрии.
Сравнительная оценка эффективности традиционных и разработанного методов диагностики туберкулёза животных
Ориентируясь на вышеприведенные данные, мы считаем, что пики (максимумы поглощения) спектров гемолизата были вызваны структурными комплексами гемоглобина. Морфологические изменения конформационного характера в данных структурах выражались изменениями интенсивности поглощения, что отражалось в спектре гемолизата опытных и контрольных животных. Кроме того, важнейшую роль в этом процессе играет кислородзависимая бактерицидная система фагоцитов, генерирующая свободные радикалы кислорода. При контакте возбудителя инфекции с мембраной фагоцита так интенсивно повышается уровень потребления кислорода клеткой что это явление получило название «дыхательного взрыва». Особая ферментная система фагоцитов, встроенная во внешнюю клеточную мембрану, изменяет электронную структуру молекулы кислорода, превращая его в главное оружие бактерицидной защиты клетки - кислородные радикалы. Таким образом, первичный ответ организма на действие микробного агента заключается в мобилизации кислородзависимой бактерицидной системы фагоцитов.
Сравнительная оценка эффективности традиционных и предлагаемого методов диагностики туберкулеза показала, что при проведении общепринятых методов необходимо затратить на постановку диагноза не менее 2-3 месяцев.
При использовании спектрофотометрии для прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота, предварительный диагноз можно поставить по спектрам гемолизата животных в течение светового дня, с учетом взятия крови у коров в хозяйстве, доставки в лабораторию и постановки диагноза.
Первоначально предлагаемый метод можно использовать в системе противотуберкулезных и противолейкозных мероприятий как дополнительный в пяти назначениях.
Первое, согласно санитарным и ветеринарным правилам (1996), где говорится, что в благополучных по туберкулезу хозяйствах, проводят контрольный убой реагирующих на туберкулин коров для уточнения диагноза (путем патологоанатомических, гистологических и бактериологических исследований). Основную роль в данном случае для последующей посмертной диагностики играет правильный выбор животных, которые подлежат комиссионному убою. В данном случае берется гемолизат от всех коров, давших положительную реакцию на туберкулин и проводится изучение спектров в течение дня. При наличии характерных пиков (коэффициентов пропускания) при туберкулезе от 2700 до 3600, такие животные считаются больными и подлежат в первую очередь для контрольного убоя и подтверждения окончательного диагноза.
Второе, как правило, в благополучных по туберкулезу дойных стадах нашего региона регистрируются парааллергические реакции на туберкулин до 80%. При исследовании гемолиза от таких животных, коэффициенты пропускания были как у здоровых коров. Следовательно, исследуя гемолизат от всех реагирующих на туберкулин животных в таких стадах, мы будем выявлять только больных туберкулезом и закроем вопрос о неспецифических реакциях и необоснованном убое скота.
Работа по изучению гемолизата крупного рогатого скота с парааллергическими реакциями на туберкулин в лаборатории продолжается, готовится заявка на патент и после получения положительного решения, результаты будут опубликованы в печати. Третье, при исследовании гемолизата коров, реагирующих на туберкулин, мы, помимо выявления или невыявления туберкулезного процесс-са, можем определить гематологическую стадию лейкоза крупного рогатого скота, где коэффициенты пропускания от 2400 до 2700, у здоровых коров - от 1700 до 2200.
В четвертых, установленный нами феномен, что у морских свинок зараженных возбудителем туберкулеза бычьего вида с 3-5-х суток в гемоглобине происходят конформационные изменения, которые можно регистрировать с помощью спектрофотометрии. Эту особенность можно использовать для послеубойной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.
Сначала послеубойную диагностику туберкулеза проводим по общепринятой схеме, согласно наставлению по диагностике туберкулеза животных 1992 года. Проводим убой реагирующих на туберкулин животных, от них берем лимфоузлы и кусочки внутренних органов из которых готовим суспензию по методу Гона-Левенштейна-Сумиоши, затем осуществляем посев на разные питательные среды с одновременным введением этой взвеси биоматериала морским свинкам (постановка биопробы).
На 3-5-е сутки по нашей методике берем кровь из сердца у подопытных и контрольных свинок и проводим спектрофотометрию их гемолизата. По спектрам можно с точностью до 98% установить наличие или отсутствие возбудителя туберкулеза бычьего вида. Этот дополнительный прием при проведении послеубойной диагностике крупного рогатого скота позволит сократить основное время исследований. Уже на 3-5-е сутки после убоя реагирующих на туберкулин животных можно поставить предварительный диагноз на туберкулез.
И в пятых, спектрофотометрию можно использовать для идентификации атипичных микобактерий в лабораторной диагностике при использовании биопробы на морских свинках или их заражении неизвестным биологическим материалом от реагирующих животных. Как показали опыты, по спектрам гемолизата можно идентифицировать в динамике один вид атипичных микобактерий от другого.
Полученные результаты далеко не исчерпывают возможности спектрофотометрии, выявленные методологические подходы прижизненной диагностики туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота могут послужить для определения других хронически и остро протекающих болезней сельскохозяйственных животных. Судя по спектрам гемолизата лабораторных животных, зараженных патогенными и атипичными микобактериями, уже в течение первых пяти суток происходят заметные изменения в морфологии крови, что позволяет получать характерные пики (коэффициенты поглощения) разной величины. Этот показатель можно использовать для прижизненной дифференциальной диагностики разных болезней.
Материалы, изложенные в диссертации, будут востребованы не только научными сотрудниками для дальнейшего изыскания прижизненной диагностики других болезней, но и студентами Институтов ветеринарной медицины и учащимися ветеринарных колледжей.
Периодически промежуточные результаты наших исследований представлялись вниманию членов методической комиссии, ученого совета ВПИИБТЖ, НТС главного управления сельского хозяйства Администрации Омской области, участников научно-практических конференций разного уровня, включая публикации в научных трудах разных НИИ и вузов.
