Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Общие сведения о микобактериях 10
1.2. Лабораторная диагностика туберкулеза 13
1.3. Консервация, хранение биологического материала 20
1.4. Методы обработки биологического материала для выделения микобактерий туберкулеза 23
1.5. Питательные среды для культивирования микобактерий 28
туберкулеза 28
2. Собственные исследования 32
Материалы и методы исследований 32
Результаты исследований 38
2.1. Использование белых мышей в комплексе бактериологических исследований при туберкулезе крупного рогатого скота 38
2.1.1. Определение оптимальной заражающей дозы микобактерий туберкулеза {M.bovis, M.avium, M.smegmatis, Mfortuitum) для белых мышей
2.1.2. Инфицирование белых мышей М. bovis 44
2.1.3. Инфицирование белых мышей М. avium 47
2.1.4. Чувствительность белых мышей кМ./ortuitum 50
2.1.5. Чувствительность белых мышей кМ. smegmatis
2.1.6. Инфицирование белых мышей штаммами М. bovis одновременно cM.fortuitum 55
2.1.7. Заражение белых мышей штаммами М. bovis одновременно с М. smegmatis 57
2.1.8. Инфицирование белых мышей штаммами М. avium одновременно cM.fortuitum 60
2.1.9. Заражение белых мышей штаммами М. avium одновременно с М. smegmatis 2.1.10. Инфицирование белых мышей биоматериалом, полученным от крупного рогатого скота, положительно реагирующего на ППД-туберкулин для млекопитающих 64
2.1.11. Изучение патогенного действия культур микобактерий туберкулеза, полученных из биоматериала от белых мышей, на организм лабораторных животных (морских свинок, кур) 68
2.1.12. Сравнительная оценка использования белых мышей в качестве лабораторной модели с целью изоляции микобактерий туберкулеза из проб биоматериала от крупного рогатого скота, положительно реагирующего на ППД-туберкулин для млекопитающих, с общепринятым методом 72
2.2. Анализ эффективности различных методов обработки и хранения проб биоматериала перед посевом их на питательные среды 76
2.2.1. Различные способы предпосевной обработки биоматериала от лабораторных животных (кролик, курица, белая мышь), зараженных M.bovis nM.avium 76
2.2.2. Влияние длительного хранения биологического материала от экспериментально зараженных животных и крупного рогатого скота на изоляцию микобактерий туберкулеза 89
2.3. Разработка компьютерной базы данных для обработки полученных
результатов 99
CLASS 3. Обсуждение результатов исследований 10 CLASS 9
4. Выводы 119
5. Практические предложения 120
6. Список литературы
- Консервация, хранение биологического материала
- Методы обработки биологического материала для выделения микобактерий туберкулеза
- Определение оптимальной заражающей дозы микобактерий туберкулеза {M.bovis, M.avium, M.smegmatis, Mfortuitum) для белых мышей
- Анализ эффективности различных методов обработки и хранения проб биоматериала перед посевом их на питательные среды
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ Туберкулез - инфекционное, хронически протекающее заболевание человека и животных, представляющее одну из первостепенных проблем здравоохранения и ветеринарии, приводящее к большим потерям среди поголовья сельскохозяйственных животных (М.П. Зыков, 1976, 1978; В.П. Шишков, В.П. Урбан, 1991, 1998; А.С. Донченко, 1998; Н.А. Шкиль, Возбудитель - бактерии рода Mycobacterium, в который входит более 38 самостоятельных видов. Болезнь у животных вызывают микобактерии туберкулёза бычьего (М bovis), человеческого (М tuberculosis), птичьего (M.avium) видов. Каждый из них является патогенным как для животных, так и для человека, возможно и перекрёстное заражение (А.С. Донченко и соавт., 2002).
Отмечены трудности в выделении культур микобактерии туберкулеза на питательных средах (В.И. Голышевская и соавт., 1997) и, в связи с этим, отдельные авторы (Г.М. Николаева, 1995; К. Duncan, 1997 и др.) рекомендуют больше внимания уделять современным методам диагностики: молекулярно-генетическим и иммунологическим. Иммуноферментный анализ и полимеразная цепная реакция обладают высокой чувствительностью и специфичностью, позволяют обнаружить микобактерии в пробах биоматериала в короткие сроки (И.Г. Шемякин и соавт., 2000).
Несмотря на это, до сих пор выделение возбудителя на питательных средах остается основой лабораторной диагностики туберкулеза (А.З. Равилов, 1999). Бактериологический метод позволяет получать чистые культуры микобактерии туберкулеза и проводить их видовую идентификацию, определять биологические и биохимические свойства.
Трудности, связанные с выделением чистых культур микобактерий, обусловлены обсеменненостью большинства анализируемых образцов микроорганизмами (сапрофиты, дрожжеподобные грибы, актиномицеты и др.), размножающимися значительно быстрее микобактерий. В связи с этим предложен ряд методов и препаратов для освобождения исследуемых проб от посторонней микрофлоры. Сведения об их эффективности крайне разноречивы (P.A. Jenkins et all, 1982).
Изучение влияния сроков хранения проб биоматериала на жизнеспособность микобактерий вызывает научно-практический интерес.
Ряд исследователей сообщает о возможности использования при проведении бактериологических исследований в качестве лабораторной модели белых мышей, что снижает материальные затраты и время проведения исследований (М.М. Дыхно и соавт., 1963, Н.С. Боганец, 2006). Однако данных по изучению использования беспородных белых мышей для заражения микобактериями туберкулеза, а также пробами биоматериала от животных, недостаточно.
Лабораторная диагностика туберкулеза до сих пор является наиболее трудоемкой и сложной, поэтому повышение эффективности ее проведения является актуальным.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ Цель работы: повысить эффективность лабораторной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.
Для достижения указанной цели были поставлены задачи:
1. Изучить возможность использования белых мышей в комплексе бактериологических исследований при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота;
2. Провести анализ эффективности различных методов обработки и хранения проб биоматериала перед посевом их на питательные среды и отобрать более информативные для выделения различных видов культур микобактерий туберкулеза;
3. Разработать компьютерную базу данных для учета полученных результатов лабораторных исследований при туберкулезе.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА Впервые установлено, что включение беспородных белых мышей в комплекс бактериологических исследований позволяет повысить эффективность лабораторной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.
Выявлен оптимальный способ обработки проб биоматериала, определены сроки его хранения, повышающие эффективность проведения бактериологических исследований при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота.
Разработана база данных «Электронный журнал учета культур», позволяющая проводить учет полученных результатов лабораторных исследований при туберкулезе.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Результаты исследований открывают возможность повышения эффективности лабораторной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.
Разработаны:
• методические рекомендации «Изоляция и индикация микобактерий туберкулеза из биоматериала животных», рассмотренные и утвержденные подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины СО Россельхозакадемии (прот. № 4, 2007);
• база данных «Электронный журнал учета культур» (свидетельство об официальной регистрации №2007 620301, 2007г. Федеральная служба по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам).
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на: заседаниях Ученого совета ГНУ Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Сибирского отделения Россельхозакадемии (Новосибирск, 2004-2007), П-й Международной научно-практической конференции молодых ученых (Новосибирск, 2006), Международной научно-практической конференции молодых ученых (Омск, 2006).
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
1. Результаты изучения использования белых мышей в комплексе бактериологических исследований при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота;
2. Анализ эффективности различных методов обработки и хранения проб биоматериала перед посевом их на питательные среды;
3. Компьютерная база данных для обработки полученных результатов лабораторных исследований.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ: Диссертация изложена на 147 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений. Работа иллюстрирована 30 таблицами и 29 рисунками. Список литературы включает 216 источников, в том числе 59 иностранных авторов.
Консервация, хранение биологического материала
Для успешной борьбы с туберкулезом важное значение имеет своевременное выявление инфицированных и зараженных возбудителем туберкулеза животных при помощи прижизненной и посмертной бактериологической диагностики.
Диагноз на туберкулез устанавливают на основании результатов аллергического, патологоанатомического и бактериологического исследований с учетом эпизоотологических данных (А.Н. Шаров, 1982; Ю.Я. Кассич и др.,1990; И.И. Румачик, 1990; Н.Е. Muller, 1988; P.H.G. Peerbohms, 1995; Т.М. Shinnik, 1996).
Бактериологическое исследование необходимо, в частности, для подтверждения результатов аллергического и патоморфологических методов диагностики туберкулеза и включает культуральный и биологический методы изучения возбудителя (Ю.Ю. Данко, 1984; С.Н. Collins, 1982; D. Dellago, 1994).
Бактериоскопический метод включает микроскопию мазков, флотацию и люминесцентный метод исследования. В мазках, окрашенных по Циль-Нильсену, микобактерии туберкулеза могут быть обнаружены при наличии не менее 100000 бактериальных клеток в 1 мл патологического материала.
В зависимости от результатов бактериоскопии на присутствие микобактерии и наличие посторонних микроорганизмов, выбирают метод обработки материала для культурального исследования и концентрацию раствора кислот для уничтожения сопутствующей микрофлоры (В.П. Шишков, В.П. Урбан, 1991).
Культуральный метод диагностики возбудителя туберкулеза дает положительные результаты при наличии в 1мл исследуемого биологического материала от 20 до 100 микобактерии. В результате размножения из отдельных микобактерии формируются микроколонии, которые, сливаясь между собой, образуют культуру (О.Р. Драбкина, 1963).
Культуральный метод считается эффективным не только в отношении его диагностической ценности, он позволяет с большей достоверностью дифференцировать кислотоустойчивые сапрофиты от микобактерии туберкулеза. Это открывает перспективы в области специфической профилактики и терапии.
Культуральный метод дает возможность выделить чистую культуру микобактерии и определить видовую принадлежность, что имеет большое значение в эпизоотологии туберкулеза, позволяет своевременно и точно поставить диагноз, установить биохимические и биологические особенности и лекарственную чувствительность возбудителя (Н.М. Макаревич, И.В Дорожкова, 1983; И.И. Румачик, 1987; Ю.Я. Кассич и др., 1990; D.V. Cousins et al., 1989).
Этот метод является наиболее информативным в сравнении с прямой и с люминесцентной микроскопией, а диагностическая ценность микробиологических методов выявления возбудителя туберкулеза зависит от характера патологического материала (О.Р. Драбкина, 1963; В.М. Дол-жанский, Е.В.Милованова, 1979).
Наряду с культуральным исследованием, необходимо проводить биологическую пробу, так как данное исследование обладает некоторым преимуществом при туберкулезе и позволяет дифференцировать микобак-терии разных видов. При этом методе диагностики лабораторные животные заражаются даже при введении в их организм от 1 до 5 бактериальных клеток возбудителя туберкулеза (A.M. Кадочкин, 1984; М.Т. Клименко, Т.С. Гинзбург, 1987; L. Joubert, М. Prave, 1975).
Биологический метод исследования туберкулеза, как в медицине, так и ветеринарии широко применяется с момента открытия возбудителя инфекции. Метод не потерял своей диагностической ценности и до настоящего времени. Биологическая проба (биопроба) на лабораторных животных остается наиболее чувствительным диагностическим тестом индикации микобактерий туберкулеза. По мнению Е.А. Финкель, Л.В. Михайловой (1976), успехи научных исследований в проблеме туберкулеза невозможны без широкого воспроизведения и моделирования заболевания на различных видах лабораторных животных.
В основе биологического метода лежит способность микобактерий туберкулеза размножаться и вызывать специфические изменения в организме чувствительных к туберкулезу животных. Уникальность метода определяет возможность решения весьма широкого круга задач, как в диагностике туберкулеза, так и в научных исследованиях. Биологический метод является основным по определению видов микобактерий, их патогенносте и вирулентности, широко используется для воспроизведения туберкулеза, изучения вопросов иммунитета, аллергии, эффективности вакцинных, химиотерапевтических и химиопрофилактических средств.
Результаты испытания ряда диагностических тестов при туберкулезе убедительно показали высокую чувствительность и преимущество биологической пробы в сравнении с культуральным методом (М.С. Чижков, 1957; P.O. Драбкина, 1963; М.Н. Немсадзе, 1966; СИ. Антипова, 1977; В.В. Поспелов и соавт, 1987; М.Т. Клименко и соавт., 1987; G. Meissner, 1964; V. Scutil et al., 1965; L. Weed, N. Масу, 1970; J. Albrecht, H. Rheinfurth, 1971; K. Konig, 1974). Однако имеется и альтернативная точка зрения. Так, по заключению СМ. Вульф (1968) сравнительное изучение результатов биологического материала при заражении морских свинок и параллельном посеве его на питательные среды, не всегда позволяет выявить существенные преимущества биологической пробы.
Сопоставляя этот метод исследования с другими, И. Дайглер (1952) установил, что биопроба подтверждает туберкулез в 100% случаев. В целом этот метод позволяет выделить возбудителя в два раза чаще, чем методом посева биологического материала на питательные среды (Kosterzenski et al., 1978).
Методы обработки биологического материала для выделения микобактерий туберкулеза
Белые мыши были заражены культурами М. bovis (шт. 14) и М. fortuitum в равных пропорциях в дозе 0,5 мл, разведенных по стандарту мутности 10 ME. После внутривенного инфицирования белых мышей штаммами М. bovis одновременно с М. fortuitum, у них отмечали значительное увеличение печени, почек и селезенки. После подкожного заражения у мышей наблюдали незначительное увеличение печени и селезенки.
Следует отметитьь, что рост культур из биоматериала от интактных животных отсутствует. У второй и третьей групп первичный рост исход 56 ных культур наблюдали на среде Финн-2 на 10-е сутки, на среде «Новая» на 11-е, на «ИЭВСиДВ» на 9-е. Интенсивности рост достигал соответственно на 11- 13-е сутки. В четвертой группе отметили появление роста культуры на 10-е сутки, интенсивности рост достигал на 12-е сутки на всех питательных средах. В пятой группе наблюдали первичный рост культур на 11-е сутки, а интенсивный - на 16-е.
Для всех культур, выделенных из биоматериала от белых мышей, отмечен обильный и пышный рост. Видовой состав полученных культур определили по общепринятым методикам, используя тесты с салицилатом натрия, рост при различных температурах (22, 37, 45 С), биохимический тест нитратредуктазы. Исследования показали наличие двух культур, выделенных из биоматериала от белых мышей
Дальнейшие исследования по изучению патогенных свойств культур микобактерий, выделенных из биоматериала белых мышей, проводили на морских свинках. При заражении М. bovis совместно с М. fortuitum морские свинки пали на 30 сутки, у них отмечали значительное увеличение селезенки, печени с плотными серо-белыми мелкими некротическими сливающимися узелками, в легких обнаружили множество серо-белых узелков, а на месте введения культуры - гнойный абсцесс. Результаты указывают на сохранение патогенности М. eovis.
При посеве проб биоматериала от белых мышей, инфицированных внутривенно, отмечали более активный рост культур микобактерий на питательных средах, в сравнении с подкожным заражением (рис.6). Следует обратить внимание на то, что при обработке биоматериала мышей, зараженных подкожно М. bovis (шт. 14) одновременно с М. fortuitum, скорость роста культур достоверно (РО.001) выше, чем при посеве суспензии биоматериала мышей, зараженных подкожно чистой культурой М. bovis (шт. 14). Интенсивность роста культур микобактерий, изолируемых из проб биоматериала от белых мышей, зараженных сочетанием культур М. bovis и M. fortuitum, значительно выше, чем из биоматериала от мышей, зараженных М. bovis. Исходя из полученных данных, можно предположить, что М. fortuitum способствует усилению ростовых свойств микобактерий бычьего типа. Из таблицы 13 видно, что сроки появления видимых культур, исследуемых микобактерий, не зависят от сроков убоя белых мышей (15 и 30 суток).
Белых мышей заражали культурами М. bovis (шт. 14) и М. smegmatis в равных пропорциях в дозе 0,5 мл, разведенных по стандарту мутности 105 ME. Материал от убитых животных исследовали патологоанатомическим и бактериологическим методами. У интактных мышей изменений не обнаружили; у животных второй группы отмечали резкое увеличение печени, почек селезенки; у третьей - увеличение печени, почек, селезенки; у мышей четвертой группы изменений не обнаружили; в пятой группе у белых мышей отметили незначительное увеличение селезенки.
При бактериологическом исследовании биоматериал (легкие, печень, селезенка) высевали на питательные среды: Финн-2, «Новая», «ИЭВСиДВ». Таблица 15 - Рост культур М. bovis в сочетании с М. smegmatis на раз личных питательных средах в зависимости от способа заражения белых мышей
В первой группе рост культур не отмечали. Первичный рост культуры у второй группы обнаружили на 11-е сутки на питательных средах Финн-2 и «ИЭВСиДВ» на 12,8±0,42 сутки на среде «Новая». Интенсивности рост достигал на 15-е сутки. При посеве суспензии биоматериала от животных третьей группы первичный рост обнаружили на 11-е сутки на средах Финн-2 и «ИЭВСиДВ», на 12,9±0,31 сутки на среде «Новая». Интенсивный рост отмечали на 15-16-е сутки. Первичный рост в четвертой группе наблюдали на 15-18-е сутки, а интенсивный на 20-24-е. В пятой группе первичный рост наблюдали на 15,0±0,47 сутки на среде «ИЭВСиДВ», интенсивный на 20,8±0,42. На средах Финн-2 и «Новая» на 20-е сутки отмечали первичный рост, а на 26-е интенсивный.
При определении видового состава полученных культур использовали методики, описанные выше. У второй и четвертой групп определили наличие двух культур М. bovis и М. smegmatis, у третьей и пятой групп обнаружили только рост культуры М. bovis.
Примечание: «-» - нет роста У контрольной группы роста культур не наблюдали. У второй группы на среде «Новая» рост исходных культур зафиксировали на 6,1±0,32 сутки, а на средах Финн-2 и «ИЭВСиДВ» на 7-е. Интенсивный рост отмечали на 8-9-е сутки. У третьей группы на всех питательных средах культура появлялась на 6-е сутки, а достигала интенсивного роста на 8-е сутки. В более поздние сроки рост культур отмечали на среде «Новая» в четвертой группе: первичный - на 13,9±0,87, интенсивный - на 15,4±1,07. В четвертой группе на питательных средах Финн-2 и «ИЭВСиДВ», в пятой группе на всех средах первичный рост наблюдали на 16-е сутки, а интенсивный рост на 20-е.
Определение оптимальной заражающей дозы микобактерий туберкулеза {M.bovis, M.avium, M.smegmatis, Mfortuitum) для белых мышей
Данные, изложенные в таблице 28, показывают, что, при посеве суспензии, полученной из свежего биоматериала от кроликов, зараженных M.bovis, появление роста культур наблюдали на 12,1±0,57 сутки на питательной среде «ИЭВСиДВ», на 14,3±0,48 - на среде Финн-2, на 15,4±0,84 сутки на среде «Новая», на 20,1±0,32 сутки на среде Левенштейна-Йенсена и на среде Гельберга на 28,0±0,67 сутки. Интенсивности рост достигал на 15,4±1,07; 18,0±0,67; 20,3±0,67; 28,2±0,79 и 35,1±0,32 сутки соответственно. При посеве биоматериала от кроликов, хранившегося 1 месяц в морозильной камере, первичный рост культур зафиксировали на 13,1±0,32 сутки на среде «ИЭВСиДВ», на 15,2±0,42 - на Финн-2, на питательной среде «Новая» на 16,2±0,63 сутки, на Левенштей-на-Иенсена на 21,7±0,48 сутки, а на 28,0±0,47 сутки на среде Гельберга. Интенсивный рост наблюдали на 18,0±0,47; 22Д±0,73; 24,0±0,67; 30,4±0,97 и 35,2±0,42 сутки соответственно. Через 2 месяца хранения отмечали появление роста культур на 17,8±0,63 сутки на среде «ИЭВСиДВ», на Финн-2 - на 25,0±0,47, на средах «Новая» и Левенштейна-Иенсена на 28-29-е сутки. Интенсивности рост культур M.bovis достигал на 24,2±0,42; 31,8±0,42; 40,0±0,47 и 35,1±0,32 сутки соответственно. На среде Гельберга роста культур не наблюдали. При посеве биоматериала от кроликов, хранившегося в морозильной камере 3 месяца, появление роста отмечали только на средах Финн-2, «ИЭВСиДВ» и Левенштейна-Йенсена на 28-30-е сутки. Интенсивности рост достигал на 35-40-е сутки. На средах «Новая» и Гельберга роста не наблюдали.
При посеве свежего биоматериала от белых мышей, зараженных M.bovis, первичный рост культур отмечали на 10,8±0,63 день на среде «ИЭВСиДВ», на 14-15-е дни - на средах Финн-2 и Левенштейна-Йенсена, на 20,0±0,47 день - на питательной среде «Новая». Интенсивный рост на 18,0±0,67; 20,8±0,42; 19,8±1,03 и 27,9±0,57 день соответственно. Спустя 1 месяц изолировали культуру M.bovis на питательной среде "ИЭВСиДВ" на 11,4±0,69 сутки, на Финн-2 -на 14,8±0,42, на Левенштейна-Иенсена - на 18,1±0,32, а на среде «Новая» - на 24,2±0,42 сутки. Интенсивности рост достигал на 17,7±0,48; 21,2±0,42; 23,8±0,63 и 31,9±0,87 сутки соответственно. При посеве биоматериала от белых мышей, хранившегося 2 месяца в морозильной камере, первичный рост культур зафиксировали на 15,4±0,84 сутки на среде "ИЭВСиДВ", на среде "Новая"- на 25,4±0,69, на Финн-2 - на 30,1±0,57. Интенсивности рост культур достигал на 24,3±0,95; 35,2±0,42 и 39,8±0,42 дни соответственно. Роста культур не выявили на средах: Левенштена-Йенсена и Гельберга. При обработке биоматериала от белых мышей, хранившегося в морозильной камере 3 месяца, первичный рост культур отмечали на среде «ИЭВСиДВ» - на 24,7±0,67 сутки, а на среде Финн-2 на 30,4±1,07 сутки. Интенсивный рост наблюдали на 35,2±0,42 и 39,9±0,32 сутки соответственно. На средах «Новая», Гельберга, Левенштейна-Йенсена роста не отмечали.
Первичный рост культур М.avium из свежего биоматериала курицы зафиксировали на 12-е сутки на питательных средах: Финн-2 и ИЭВСиДВ», на 20-е сутки на средах: «Новая» и Гельберга, на 23,7±0,82 сутки на среде Левенштей-на-Йенсена. Интенсивный рост культур отмечали на 16-е, 28-е и 30-е сутки соответственно. После 1 месяца хранения биоматериала от кур провели обработку и посев на вышеуказанные среды. Появление роста культур отмечали на 16,1±0,32 сутки на питательной среде "ИЭВСиДВ", на 18,0±0,47 сутки на среде Финн-2, на 29,1±0,32 - Левенштейна-Йенсена, на 28-е сутки на средах: «Новая» и Гельберга. При обработке биоматериала от кур, хранившегося 2 месяца в замороженном виде, первичный рост культур наблюдали на 28-30-е сутки на питательных средах: «ИЭВСиДВ», Финн-2 и «Новая». Интенсивности рост культур достигал на тех же средах на 35-40-е сутки. На остальных средах роста не наблюдали. Появление роста культур из биоматериала от кур, хранившегося 3 месяца в морозильной камере, зафиксировали на 30-35-е сутки на питательных средах: «ИЭВСиДВ» и "Новая». На остальных средах роста культур не обнаружили.
При обработке свежего биоматериала от морских свинок, зараженных M.tuberculosis, появление роста культур отмечали на 12,2±0,63 сутки на пита 93 тельной среде "ИЭВСиДВ", на 14,1±0,57 - Финн-2, на 18,2±0,42 на среде Ле-венштейна-Йенсена, на 19,9±0,57 на питательной среде "Новая" и на среде Гельберга на 27,9±0,54 сутки. Интенсивности рост культур достигал на 15,4±1,07; 17,9±0,57; 26,1±0,32; 27,9±0,57 и 35,4±0,84 сутки соответственно. После 1 месяца хранения биоматериала первичный рост культур наблюдали на 20-22-е сутки на средах: «ИЭВСиДВ» и Финн-2, на 28,0±0,47 сутки на среде «Новая» и на 29,6±0,67 сутки на среде Левенштейна-Йенсена. Интенсивный рост культур отмечали на 28,3±0,95; 30,0±0,47; 34,8±0,42 и 40,1±0,32 сутки соответственно. При обработке биоматериала от морских свинок, хранившегося 2 месяца в замороженном виде, первичный рост культур наблюдали на 28-30-е сутки на питательных средах: «ИЭВСиДВ», Финн-2. Интенсивный рост отмечали на 35-40-е сутки. На остальных средах роста культур не обнаружили. После 3 месяцев хранения биоматериала от морских свинок провели обработку и посев на вышеуказанные среды. Появление роста культур не отметили ни на одной из питательных сред.
Анализ эффективности различных методов обработки и хранения проб биоматериала перед посевом их на питательные среды
Изменения во внутренних органах наблюдали у мышей, убитых через 30 дней. Из их биоматериала были выделены типичные микобактерии туберкулеза (M.avium, М.tuberculosis). Атипичные микобактерии были выделены в группе, где мышей декапитировали на 15 сутки.
Изучая патогенность культур, полученных от белых мышей, на лабораторных животных (морские свинки, куры) следует подчеркнуть, что значительно сокращаются сроки гибели экспериментальных животных.
Провели сравнительную оценку использования белых мышей в качестве лабораторной модели с целью изоляции микобактерии туберкулеза из проб биоматериала от крупного рогатого скота, реагирующего на ППД-туберкулин для млекопитающих, с общепринятым методом согласно «Наставлению по диагностике туберкулеза животных» (2002). Изолировали общепринятым методом 13 (30,2%) культур быстрорастущих микобактерии IY группы по Раньону. Предлагаемым методом выделили 23 (53,5%) культуры микобактерии IY группы по Раньону, т.е. дополнительно - 10 (23,3%), также 5 (11,6%) культур микобактерии M.avium и 3 (6,98%) культуры M.tuberculosis.
Таким образом, при бактериологических исследованиях 43 проб биоматериала с использованием беспородных белых мышей удалось выделить на питательных средах на 41,88%) больше изолятов культур микобак 116 терий различных видов, чем при использовании общепринятого метода исследований. Включение беспородных белых мышей в комплекс бактериологических исследований позволяет повысить эффективность лабораторной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.
Патогенные свойства не всегда являются стабильными при пересевах на искусственные питательные среды. Некоторые культуры на питательных средах постепенно утрачивают это свойство, но при пассаже через организм животных могут снова восстанавливать его. Способность размножаться в организме животного и даже вызывать патологические процессы в нем является филогенетически важным свойством, которое отличает микроорганизм от типичных сапрофитных микробов внешнего мира: данный микроорганизм обладает способностью к паразитарной жизни и является факультативно-патогенным. По нашему мнению, модель белой мыши наиболее подходящая для восстановления свойств микобактерий туберкулеза. Это позволит усилить качества культуры за небольшой период времени с минимальными затратами.
Микобактерий туберкулеза рассматриваются как микроорганизмы, особо резистентные к внешним неблагоприятным воздействиям. Они действительно очень устойчивы к щелочам и кислотам, а также к ряду антисептических веществ. Это свойство и положено в основу методов диагностических посевов биологических материалов, в которых одновременно могут находиться различные микробы (Ю.К.Вейсфейлер, 1975). Предложено много методов обработки биологического материала для культивирования микобактерий туберкулеза с применением различных химических веществ. Эти вещества должны отвечать следующим условиям: а) они должны удовлетворительно гомогенизировать материал; б) убивать сопутствующую микробную флору; в) в максимально возможной степени сохранять жизнеспособность микобактерий и г) доступность и дешевизна (В.Н. Василев, 1971). Из приведенного литературного обзора, идеальный химический препарат для обработки диагностического материала до сих пор не найден.
Известно много методов обработки биоматериала для выделения возбудителя туберкулеза. Применяемые методы выделения микобактерий из биоматериала с помощью детергентов или ультразвука экономически невыгодны, так как требуют большого количества реактивов и специальной аппаратуры (Я.А. Благодарный, 1982; Б .Я. Циммер, 1984). Общепринятые в ветеринарии методы выделения микобактерий туберкулеза из внутренних органов и лимфатических узлов животных Гона-Левенштейна-Сумиоши и Аликаевой (ГОСТ 26072 - 89, СТ СЭВ 3457 - 81) не обеспечивают достаточно высокой высеваемости микобактерий туберкулеза на питательных средах, и особенно чистоты бактериологических посевов. Исходя из вышеизложенного, одной из задач нашей работы явилось изучение различных способ предпосевной биоматериала от животных и влияние различных химических на рост микобактерий туберкулеза. А в результате работы найти оптимальный способ предпосевной обработки биоматериала от животных с применением химического вещества, отвечающего на требования указанные ранее.
Биологический материал обрабатывали параллельно двумя методами - А.П. Аликаевой и модифицированным, с использованием принципа седиментации, который был разработан в лаборатории по разработке мер борьбы с туберкулезом сельскохозяйственных животных ГНУ ИЭВСиДВ.
Также, в данном опыте, сравнивали эффективность различных химических веществ, использованных для предпосевной обработки биоматериала: 4, 5 и 6 %-ные растворы едкого натра; 4, 6, 8 %-ные растворы щавелевой кислоты; 4, 6, 8 %-ные растворы серной кислоты.
На основании результатов исследований можно сделать вывод, что, используя для обработки биоматериала от животных метод седиментации с применением 6%-ной щавелевой кислоты, можно достичь высокой изоляции микобактерий туберкулеза, ускоренного обильного роста культур с исключением роста условно патогенной микрофлоры.
Установлено, что хранение при -18 С проб биоматериала от крупного рогатого скота в течение одного месяца и более, с момента их взятия до посева на питательные среды, приводит к уменьшению числа изолируемых культур микобактерий. Изолировать микобактерий туберкулеза из проб биоматериала от лабораторных животных возможно в 100% случаях в течение двух месяцев хранения в тех же условиях.
Применение базы данных «Электронный журнал учета культур» в среде Microsoft Office Access 2003 позволит проводить самостоятельный учет и обработку получаемых данных. Она предназначена для автоматизации учета выделяемых и пересеваемых культур микобактерий и других биологических характеристик микроорганизмов с возможностью создания итогового отчетов, автоматизацией контроля сроков пересевов.
Представляет интерес возможность изучения статистических характеристик распределения параметра (например, скорость роста культур) в выборке полученных данных, что позволило бы оценить как однородность самой выборки, так и гетерогенность факторов влияющих на данный параметр. Особенно удобна в Access группировка и сортировка данных (например, вид микроорганизмов).
