Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 8
2.1. Общие сведения о микобактериях и методы их идентификации 8
2.2. Фагоцитоз и его значение при туберкулезе 22
2.3. Выбор, подготовка лабораторных животных к заражению и способы заражения 35
3. Собственные исследования 38
3.1. Материалы и методы исследования 38
4. Результаты исследований 44
4.1. Эпизоотическая ситуация по туберкулезу крупного рогатого скота в Республике Татарстан 44
4.2. Изучение бактериологических, биохимических и биологических свойств выделенных культур микобактерий из биоматериала реагировавших на туберкулин животных 56
4.2.1. Идентификация микобактерий, выделенных из биоматериала животных, реагировавших на туберкулин 58
4.2.2. Изучение биохимических свойств выделенных культур 64
4.2.3. Изучение патогенного действия выделенных культур микобактерий на организм лабораторных животных 79
4.3. Усовершенствование постановки биопробы на лабораторных животных при туберкулезе 85
4.4. Фагоцитарная активность лейкоцитов периферической крови у разных видов животных и ее эпизоотическое значение 93
4.4.1.Фагоцитарная активность и фагоцитарный индекс лейкоцитов по отношению к М. bovis штамма №14 in vitro 94
5. Обсуждение результатов 119
6. Выводы 131
7. Практические предложения 133
8. Список литературы 134
9. Приложение 155
- Общие сведения о микобактериях и методы их идентификации
- Собственные исследования
- Эпизоотическая ситуация по туберкулезу крупного рогатого скота в Республике Татарстан
Введение к работе
Актуальность темы. Туберкулез в значительной степени отличается от других инфекционных болезней тем, что инфекционный процесс при нем характеризуется нередко незаметно развивающимися болезненными симптомами, длительным течением и рецидивами вспышек.
Немалое влияние на характер эпизоотического процесса при туберкулезе оказывают особенности жизнедеятельности микобактерий в организме зараженных животных и во внешней среде, их вирулентность и полиморфизм (Н.М. Колычев, 1992; М.В. Харитонов, 1998; А.И. Кузин, 2003 и др.).
С тенденцией широкого распространения этой инфекции за последние годы и среди людей, проблема туберкулеза приобрела особую актуальность не только в ветеринарной, но и в медицинской практике.
Широко применяющейся в ветеринарной практике аллергический метод диагностики туберкулеза не во всех случаях обеспечивает точную постановку диагноза (А.С. Донченко, 1987; Ю.А. Макаров 1991 и др.) особенно у больных животных, находящихся в состоянии анергии. Поэтому своевременность постановки первичного диагноза и выяснение причин сенсибилизации макроорганизма к туберкулину во многом зависит от качества лабораторных исследований и идентификации выделенных культур, без проьедення которых эпизоотическая ситуация может оставаться неясной на протяжении ряда лет, что и бывает в некоторых случаях (Н.П. Овдиенко, 1986; А.Х. Найманов 1993; М.А. Бажин, 1995, А.Х. Найма-нов, 1993 и др.).
Отсутствие достаточно надежных методов дифференциации туберкулезных и атипичных микобактерий требует необходимость совершенствования имеющихся и изыскание новых, более доступных методов исследований в этой области, в
том числе и лабораторных, т.к. для успешной борьбы с любой инфекцией, прежде всего, необходимо выделить и изучить возбудителя.
Все вышеизложенное свидетельствует об актуальности поставленного вопроса и требует дальнейшего совершенствования системы диагностики туберкулеза и идентификации выделенных культур микобактерий в производственных условиях. Исходя из актуальности проблемы, перед нами были поставлены соответствующие цели и задачи.
Цель работы заключалась в изучении эпизоотической ситуации хозяйств республики по туберкулезу в постэпизоотическом периоде и комплексном изучении свойств выделенных культур микобактерий в этот период, а также совершенствование ускоренной диагностики биопробы при этой болезни.
При выполнении настоящей работы были решены следующие конкретные задачи, отражающие одновременно последовательность проведения исследований:
Проведен эпизоотологический мониторинг Республики Татарстан по туберкулезу за 2001-2005 годы.
Изучены бактериологические, биохимические и биологические свойства культур микобактерий, изолированных в хозяйствах Республики Татарстан.
Изучена фагоцитарная активность лейкоцитов по отношению к ми-кобактериям различной вирулентности.
Усовершенствована постановка биологической пробы на лабораторных животных при изучении патогенносте микобактерий.
Научная новизна работы. Изучена эпизоотическая ситуация животноводческих хозяйств по туберкулезу за 2001-2005 годы после оздоровления Республике Татарстан от туберкулеза. Впервые определен основной видовой состав микобактерий, циркулирующих среди крупного рогатого скота за эти годы.
В результате проведенных исследований изучены особенности взаимодействия микобактерий с фагоцитирующими клетками крови в динамике. При этом выявлены различия в фагоцитарной активности макрофагов в зависимости от вирулентности микобактерий. Микобактерии вирулентных штаммов фагоцитировались менее активно, по сравнению с микобактериями низкой вирулентности.
При экспериментальном туберкулезе установлено, что у морских свинок, зараженных в брюшную полость с микобактериями туберкулеза суспендированными в стабилизированной крови, туберкулезный процесс имеет острое течение с прогрессирующим истощением и гибелью животных в более короткие сроки.
Практическая ценность работы. Полученные результаты дают представление об особенностях туберкулезных вспышек в отдельных хозяйствах. По материалам исследований получено удостоверение на рац. предложение №462 от 10.12.2004г. и подана заявка на патент. Разработаны методические рекомендации: «Заражение морских свинок в брюшную полость при экспериментальном туберкулезе», утвержденные НТС и Ученым советом факультета ветеринарной медицины КГАВМ №3 от 28 февраля 2006 г.
Основные положения диссертации, выдвигаемые на защиту:
анализ современного состояния Республики Татарстан по туберкулезу, за последние 5 лет;
характеристика изолированных культур микобактерий по бактериологическим, биохимическим и биологическим свойствам исследований;
фагоцитарная активность лейкоцитов периферической крови у животных: здоровых, больных туберкулезом и гельминтозами;
заражение морских свинок в брюшную полость микобактериями туберкулеза, суспендированными в стабилизированной крови.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены: на заседаниях Ученого совета в 2001-2005 г.г.; на Всероссийской научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии (Казань, 2002); Международной научно-производственной конференции по актуальным проблемам Агропромышленного комплекса (Казань, 2003); на Конференции молодых ученых и специалистов ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана (2004 г.).
Публикации результатов исследований. Основные научные положения и практические рекомендации изложены в 8 научных трудах, опубликованных в «Ученых записках КГАВМ», журналах «Ветеринария» и «Ветеринарный врач», Материалах Международных научных конференций ив других изданиях.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 167 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы и методов исследований, результатов исследования и их обсуждений, заключения, выводов, практических предложений, библиографического списка и приложения. Работа иллюстрирована 26 таблицами, 7 рисунками. Список литературы включает 230 источников, в том числе 61 иностранных авторов.
Общие сведения о микобактериях и методы их идентификации
Микобактерии представляют собой группу микроорганизмов, важную с точки зрения ветеринарных и медицинских специалистов, в силу их положения в систематике рода, представляющего промежуточную ступень между бактериями с одной стороны, и актиномицетами с другой. Особая устойчивость к кислотам и щелочам, а также факт принадлежности к ним патогенных видов усугубляет значение этих микроорганизмов.
Возбудитель туберкулеза, по своим морфологическим, культуральным и биологическим свойствам отнесен к порядку Actinomycetales, семейству Mycobacterium. Клетки микобактерии - палочковидные или слегка искривленные, иногда булавовидные. Чаще всего микобактерии не ветвятся, однако, у некоторых представителей этого рода формируются гифы или первичный мицелий. Длина микобактерии колеблется от 0,8 до 3-6 мкм, ширина от 0,2 до 0,5 мкм. Микобактерии имеют аэробный тип дыхания, неподвижны, не образуют спор, по Грамму окрашиваются положительно и часто содержат одно или несколько кислотоустойчивых зерен (Ю.К. Вейсфейлер, 1975; В.Ф. Романенко, A.M. Дьяченко, А.И. Супру-ненко, 1997; P. Bergey, 1974; F. Portaels е. а, 1981).
Клетка микобактерии имеет тонкую, состоящую из трех и более слоев стенку, выполняющую защитную функцию, а также 3-слойную мембрану, в которую заключена цитоплазма с находящимися в ней рибосомами и полисами. Ядерное вещество располагается в цитоплазме в виде тонких тяжей и трубчатых образований, соединяющихся в ней рибосомами и полисомами. Ядерное вещество располагается в цитоплазме в виде тонких тякей и трубчатых образований, соединяющихся с поверхностью клетки (В.В. Ерохин, 1982, 1999; А.А. Шахбанов, В.М. Кушнарев,1972; А.Г. Хоменко, В.В. Ерохин,1982; И.П. Билько, В.Г. Матусе-вич,1986).
Наиболее важной особенностью этих микроорганизмов является высокое содержание в их клетках разнообразных липидов, большинство из которых концентрируется в клеточной оболочке, и иногда составляя 30 — 60% ее сухой массы (Т.В. Коронелли, 1977, 1984;С. Ratledge,1982).
По некоторым данным липиды в сухом микробном остатке составляют у M.tuberculosis-22,7%,M.bovis-22,3%, М.avium-11,0%. Липиды клеточной стенки содержат миколовые кислоты, имеющие сравнительно высокую молекулярную массу с 80 атомами углерода. Микобактерии, кроме того, синтезируют серии гомологов миколовых кислот с числом атомов с 60-90, которые при гидролизе освобождают жирные кислоты с 22-26 атомами (М.Р. Lechevalier е.а, 1971). У микобактерии туберкулеза обнаружена главным образом кислота с26, у атипичных с24 (Л.В. Андреев, А.К. Склифас,1977; Т.Н. Левченко, 1991;С. Asselineau, J. Asselineau, 1978; J. Asselineau, 1981). Детальная характеристика миколовых кислот микобактерии описана в работах Т.В. Коронелли (1977,1984); V. Levi-Frebault, Е. Rafiadinarivo, I.C. Prome (1983); V. Levi-Frebault е.а. (1986) и др.
Характерной особенностью микроорганизмов рода Mycobacterium является их кислотоустойчивость, т.е. способность прочно удерживать окраску фуксином или другими анилиновыми красителями при последующем воздействии растворами минеральных кислот. На этом свойстве основана дифференциальная окраска микобактерии по Циль - Нильсену, предложенная ими в 1882-1883 г.г.
Основным фактором, определяющим кислотоустойчивость микобактерии является комплекс миколовая кислота - арабиногалактан - пептидогликан (J. Asselineau, 1961, 1981;М.В. Gorene.a., 1978).
С момента открытия Р.Кохом (1882) туберкулезной палочки ее специфическая роль в развитии туберкулезного процесса остается неоспоримой. Р.Кох рас 10 сматривал возбудитель туберкулеза как микроорганизм с раз и навсегда зафиксированными и неизмененными признаками, т.е. с позиций мономорфизма. Однако дальнейшее изучение возбудителя показало многообразие его форм (полиморфизм) и чрезвычайно широкий диапазон изменчивости биологических свойств (плеоморфизм) (СБ. Вольф,2001). В1888 году И.И. Мечников обратил внимание на то, что микобактериям свойственны явления полиморфизма, и отметил, что в зависимости от возраста и условий выращивания, форма клеток может быть не одинаковой. Полиморфизм может проявляться в образовании зерен и кокковидных форм, впервые описанных Д.А.Гейденрейхом в 1887году. Далее эта концепция развивалась в работах Л.А. Тарасевича (1899); Ю.К. Вейсфейлера (1934;1975),А.И. Каграманова (1972); Е.С. Милько с соавт.(1978; 1980) и др. Большое число исследований было посвящено изучению так называемых некислотоустойчивых форм, которые возникают при нарушении внутриклеточног го обмена. Установлено, что потеря кислотоустойчивое является результатом частичной деструкции клеточной стенки, содержащей значительного количество липидов и миколовой кислоты (В.Д. Ломачев, А.К. Стрелис, 2000).
Вопрос определения видов имеет большое значение для ветеринарных и медицинских работников, которые на основании вида возбудителя устанавливают эпизоотологическую или эпидемиологическую обстановку. Решение вопроса о видовой принадлежности возбудителя, влечет за собой целый комплекс мероприятий направленный в первую очередь на выявление источников инфекции (В.В. Пунга,1998).
Собственные исследования
Работа выполнена на кафедре эпизоотологии ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана», в Республиканской ветеринарной лаборатории, хозяйствах Республики Татарстан с различной эпизоотической ситуацией по туберкулезу в соответствии с программой научно-исследовательской работы в 2001-2005 годы. Номер государственной регистрации 01200002297.
При изучении эпизоотологии туберкулеза крупного рогатого скота в ранее оздоровленных по туберкулезу хозяйствах пользовались такими показателями проявления интенсивности эпизоотического процесса (заболеваемость, инцидентность, очаговость), и его экстенсивности (неблагополучие, распространенность), территориальной приуроченности болезни, показатели периодической повторяемости вспышек.
Объектами исследований послужили пробы биоматериалов (кусочки внутренних органов и лимфатические узлы), полученные после убоя реагировавших на туберкулин животных и от лабораторных животных, экспериментально зараженных различными видами микобактерий.
В целях дальнейшего углубленного изучения в лабораторных условиях, были отобраны 30 эпизоотологические штаммы, культур микобактерий, выделенные из биоматериала реагировавших на туберкулин животных в отдельных неблагополучных и благополучных по туберкулезу хозяйствах РТ, в которых выявляли реагирующих на туберкулин животных.
Лабораторные исследования по индикации микобактерий, а в последующем и их идентификацию проводили согласно «Методических указаний по диагностике туберкулеза животных», (1976) и в соответствии с методическими рекомендациями «Бактериологическая и биохимическая идентификация микобактерий», (Т.Б. Ильина, 1975, 1980), а также в соответствии с «Инструкцией по унифицированным методам микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза», утвержденной Министерством здравоохранения Российской Федерации №109, от 21 марта 2003 г.
У выделенных культур микобактерий изучали: характер и скорость роста на среде Левенштейна-Йенсена, или ФАСТ-ЗЛ при температуре 22, 37, 45 и 52С; характер колоний: величину, форму, консистенцию и т.д.; тинкториальные свойства окрашенных мазков по Циль-Нильсену; способность пигментообразования на свету и в темноте; рост на среде Левенштейна-Иенсена или ФАСТ-ЗЛ с содержанием 0,5 и 1,0 мг салицилата натрия; устойчивость к 5%-ному хлориду натрия, для чего в глицериновый бульон добавляли 5% хлорида натрия; каталазной активности при 37 и 68С, для чего платиновой петлей вносили в пробирку с 1мл перекиси водорода небольшое количество исследуемой культуры и отмечали каталазную активность; амидазной активности, для чего готовили синтетическую агаровую среду для выращивания микобактерий: пептон-2 г, агар-40 г, натрий хлорид — 10 г, глюкоза - 2 г, однозамещенный калий фосфат - 4г, глицерин - 20 мл, дистиллированная вода - 2л, рН - 6,9. Приготовленную среду разливали в пробирки по 5 мл, автоклавировали в течение 20 минут при 120С и ставили в наклонном положении для охлаждения.
Амиды растворяли в дистиллированной воде. При этом растворы ацетами-да, никотинамида, сукцинамида стерилизовали нагреванием при 100С в течение 30 мин, а раствор карбамида - фильтровали через мембранный фильтр.
Эпизоотическая ситуация по туберкулезу крупного рогатого скота в Республике Татарстан
Важное место в сельскохозяйственном производстве Республики Татарстан занимает животноводство с развитым скотоводством. Однако в успешном решении задач по животноводству огромное значение имеет обеспечение благополучия хозяйств по инфекционным болезням животных, среди которых особое место занимает туберкулез крупного рогатого скота.
Официально туберкулез крупного рогатого скота в бывшей Казанской губернии, как спорадический случай, был установлен в 1895 году. Но улучшение породных качеств крупного рогатого скота путем ввоза племенных животных из-за рубежа, при отсутствии целенаправленных диагностических исследований на туберкулез, способствовало распространению болезни в целом в России, в том числе и в Республике Татарстан.
Благодаря огромному усилию практических ветеринарных специалистов по борьбе с туберкулезОхМ крупного рогатого скота в Республике Татарстан достигнуты значительные успехи. В целях стабилизации эпизоотической ситуации по туберкулезу было принято дополнительное Постановление КМ РТ № 441 от 10.07.1995 г. «О мерах по борьбе с туберкулезом крупного рогатого скота в хозяйствах Республике Татарстан».
В соответствии с указанным Постановлением усилены профилактические мероприятия по охране благополучных хозяйств от заноса в них возбудителя туберкулезной инфекции, осуществлено широкомасштабное внедрение метод по своевременному и полному выявлению в стадах латентно больных и инфицированных животных, а также приняты меры по дополнительной санации животноводческих помещений, территорий оздаравливаемых ферм и летних лагерей. Путем проведения систематических уплотненных аллергических исследований поголовья крупного рогатого скота в неблагополучных хозяйствах с последующей сдачей выявленных больных животных в течение 1-2 недель на убой, сравнительно за короткий срок с 1999 по 2001 годы были оздоровлены 34 оставшиеся неблагополучные пункты в 9 районах республики: Альметьевский район - КП «Ерсубайкино»; Буинский - КП «Волга»; Дрожжановский - КП «Авангард», «Ирек», «Тан», им. Чапаева, им. Горького, «Заря»; К.- Устинский - КП «Красный Маяк»; Лениногорский - СХПК «Уран», «Победа», им. Тукая, «Карагай»; Мус-люмовский - с-з «Шуганский», КП «Нов. Путь», им. Вахитова, «Маяк»; Нижнекамский - с-з «Рассвет»; Черемшанский - КП «К.Маркса», «Нов. Путь», «Черем-шан», «Победа», им. Ильича, им. Ородженикидзе, им. Кирова, «Большевик», «Восход», «Ватан», «Маяк», им. Тукая, «Тан»; Чистопольский - с-з «Луч», под. хоз-во «Речник», совхоз - техникум.
Накопленной наукой и апробированный практикой опыт проведения противотуберкулезных мероприятий указывает на то, что в системе мер борьбы с туберкулезом животных особое внимание необходимо уделять, помимо организационно-хозяйственных и зоотехнических вопросов, широкому комплексу специальным ветеринарным мероприятиям. Основным ведущим звеном в этом комплексе мероприятий, является ежегодное плановые аллергические исследования всего поголовья крупного рогатого скота, начиная с 2-ых месячного возраста, на туберкулез внутрикожным методом введения туберкулина и своевременное уточнение диагноза в случаях выявления реагирующих животных.
