Введение к работе
Актуальность проблемы. Бруцеллез сельскохозяйственных животных, являясь одной из наиболее распространенных инфекций, причиняет не только большой экономический ущерб животноводству, но имеет и определенное социальное значение. Сложная эпи-зоотодого-эпидемиологическая обстановка поданной инфекции сохраняется в Республике Казахстан, особенно в его северном регионе. Одним из основных звеньев в системе протнвобруцеллезных мероприятии является диагностика заболевания. Однако недостаточная эффективность бактериологического метода и официальных серологических реакций не всегда позволяет своевременно выявлять всех животных, зараженных бруцеллезом.
Разработка диагностикумов нового поколения стала возможной на основе использования достижений одного из направлений современной биотехнологии—гибрндомной техники (G. Kohler and С. Milstein, 1975), позволившей получить антитела, идентичные по всем параметрам, взаимодействующие с уникальной детерми-наптной возбудителя и доступные в неограниченном количестве. Гибридные клетки (гибридомы), полученные путем слияния анти-телообразующнх и миеломных (раковых) клеток, наследовали способность к неограниченному росту в культуре и в то же время к синтезу гомогенных, т. е. моноклональных антител. Последние, как правило, продуцируются изолированным клоном и, следовательно, представляют собой однородное химическое вещество, а не гетерогенную смесь сывороточных иммуноглобулинов, которая изменяется с каждым иммунизированным животным или с каждой порцией крови одного и того же организма. Указанные свойства моноклональных антител являются хорошей предпосылкой для .создания высокоспецпфичных и чувствительных методов диагностики инфекционных болезней, в том числе бруцеллеза.
Цель исследования. Повысить эффективность серологической диагностики бруцеллеза на основе использования моноклональных антител.
В соответствии с целью, были поставлены следующие задачи:
— определить антигены бруцелл, которые могут служить пм-мупогеиом в гибрндомной технике;
— получить штаммы гибридом, вырабатывающие моноклинальные антитела против полисахаридных и белковых эпитопов бактерий рода Brucella; ,
— разработать и испытать методы экспресс-обнаружения бру .целлезных антигенов в патматернале, характеризующиеся высокой специфичностью и чувствительностью;
— разработать диагностическую тест-систему, предназначенную для выявления специфичных к бруцеллам антител в сыворотке крови животных и определить ее объективность в сравнении с общепринятыми серологическими реакциями;
— изучить иммунобиологический статус новорожденных неблагополучных и благополучных по бруцеллезу ферм (отар) и на основе полученных результатов разработать способ диагностики внутриутробного инфицирования особей бруцеллезом.
Научная новизна. Установлена эффективность Поли-Б антигена и белков внешней мембраны бруцелл в стимулировании лимфоцитов (спленоцитов) иммунизированных животных на синтез антител, специфичных к Brucella.
Впервые получены штаммы гибридных культивируемых клеток-продуцентов моноклональных антител к детерминантам «кор» участка полисахаридной цепи и белка внешней мембраны бруцелл, что подтверждено авторскими свидетельствами ШХ° 1604848, 1604849 и 1752764.
С помощью моноклональных антител установлена локализация в «кор» регионе ЛПСи Поли-Б как уникальных для бруцелл, так и общих с Yersinia enterocolitica 09 мульти- и унивалентных эпитопов. Белок внешней мембраны бруцелл с молекулярной массой 14 КД не участвует в агглютинации клеток в случае использования как моноклональных антител, так и полнклональной сыворотки, по обладает антигенным свойством.
Разработан способ идентификации бруцелл (Положительное решение Национального патентного ведомства Республики Казахстан от 11.11.92).
Разработаны экспресс-методы обнаружения антигенов бруцелл в иммуноферментном анализе, реакциях латекс-агглютинации и пассивной гемагглютинацни, а также нммуноферментный диаг-ностпкум, позволяющий выявить инфицированных телок и ярок, нереагирующих на бруцеллез по результатам классических серологических тестов. «Набор для диагностики бруцеллеза методом ИФА на основе моноклональных антител» был удостоен серебряной медали ВДНХ СССР.
Получены новые данные, характеризующие иммунную взаимосвязь в функциональной системе «мать—плод—новорожденный» при бруцеллезной инфекции. Показано, что у некоторых новорожденных телят п ягпят неблагополучной фермы (отары) до приема "молозива в сыворотке крови могут быть обнаружены противобру целлезные антитела.
Разработан способ диагностики внутриутробного инфициро- ваиия ягпят бруцеллезом (Авт. свид-во JV 18І3450).
Практическая ценность работы. Штаммы гибридных кудьтн v вируемых клеток с авторскими названиями БАМА, БИМА ігіСЗ, продуцирующие моноклональпые антитела против .бактерий рода Brucella, депонированы во Всесоюзной (ныне Всероссийской) специализированной коллекции перевиваемых клеточных культур (г- Санкт-Петербург) и могут быть основой для создания высокоэффективных диагностических реагентов и производства моноклинальных антител в промышленных условиях. На основании материалов диссертации разработаны:
— Технические условия «Набор для диагностики бруцеллеза методом ИФА на основе моноклональных антител» (ТУ 10.05.4000. 326-92), утвержденные ГУВ МСХ Республики Казахстан 8.12. 1992 г;
— Временная инструкция по изготовлению и контролю «Набора для диагностики бруцеллеза методом ИФА на основе моноклональных антител», утвержденная ГУВ МСХ Республики Казахстан 8.12.1992 г;
— Наставление по постановке ц учету ИФА для экспресс-обна-ружения- бруцелл в патматериале, утвержденное ГУВ МСХ Республики Казахстан 8.12.1992 г.
Способ идентификации бруцелл может найти свое применение в определении принадлежности культур микроорганизмов к роду Brucella.
Использование способа диагностики внутриутробного инфицирования в неблагополучных, а также благополучных по бруцеллезу хозяйствах, где сохраняется опасность заноса инфекции и.заражения животных, позволит предотвратить распространение инфекции и сократить сроки оздоровления.
Отдельные фрагменты результатов исследований были использованы автором при подготовке раздела «Инфекция жэне иммунитет» учебного пособия «Микробиология жзне иммунология» для студентов высших учебных заведении по специальности «Ветеринария».
Апробация работы. Результаты исследований доложены на итоговых конференциях ветеринарного факультета Акмолинского сельскохозяйственного института (1988—1992); координационном совете по ветеринарии ВО ВАСХНИЛ, г. Алма-Ата, 1988 г; научной конференции Троицкого ветеринарного института «Актуальные проблемы интенсификации животноводства в исследованиях молодых ученых», г. Троицк, Л989; научно-производственной конференции Ставропольского сельскохозяйственного института, г. Ставрополь, 1990; межвузовской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Вклад молодых ученых и специалистов в научно-технический прогресс сельскохозяйственного производства», г. Ставрополь, 1991; выставках «От фундаментальных исследований до практического внедрения» ВДНХ СССР, г. Моск па, 1991 г. п «Достижения народного хозяйства Казахстана», СУАР КНР, 1991 г; научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Научные достижения молодых ученых ц специалистов — животноводству», г. Семипалатинск, 1991; научно-практической конференции молодых ученых Целиноградского, государственного медицинского института, г. Целиноград, 1991; 5 объединенном съезде гигиенистов, эпидемиологов, микробиологов, паразитологов и инфекционистов Министерства здравоохраие ния Казахстана, г. Алма-Ата, 1991; Всесоюзной конференции по сельскохозяйственной биотехнологии, г. Целиноград, 1991; Всесоюзной научно-теоретинеской конференции «Использование достижений биотехнологии в животноводстве и ветеринарии», г. Новосибирск, 1991; 44 Национальной конференции США по проблеме бруцеллеза, Иллинойс, штат Чикаго, 1991; Всесоюзных координационных совещаниях по. итогам научных исследований учреждений, занимающихся проблемой бруцеллеза за отчетный год и задачам на будущий период (Новочеркасск, 1989; Махачкала, 1990; Омск, 199.1); заседании секции ветеринарии ИТС МСХ Республики Казахстан, г. Алма-Ата, 1992.
Публикации. Основные результаты по теме диссертации отражены в 25 статьях и 4 авторских свидетельствах.
На защиту выносятся:
1. Поли-Б и белки внешней мембраны бруцелл как эффективные антигены в стимулировании спленоцитов иммунизируемых животных на выработку антител, специфичных к Brucella.
2. Штаммы гибридных культивируемых клеток-продуценты моноклоналышх антител против бруцелл, полученные методом гибрпдомной техники путем слияния иммунных спленоцитов мышей с мпеломой ХбЗ. Ag8. б. 5.
3. Антигенные свойства «кор» участка полисах аридной цепи и белка внешней мембраны бруцелл с молекулярной массой 14 КД.
4. Иммуноферментные, латексные и эритроцитарные диапюс тнкумы для обнаружения антигенов бруцелл и специфичных к ним антител.
5. Особенности иммунной взаимосвязи между организмами коров или овцематок и их плодов (новорожденных) при бруцеллезной инфекции.
6. Способ диагностики внутриутробного инфицирования особен бруцеллезом.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 319 страницах машинописи, содержит 38 таблиц и б рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложения. Библиография включает 387 наименований источников литературы.
Похожие диссертации на Моноклональные антитела в разработке и совершенствовании методов диагностики бруцеллеза животных
