Введение к работе
1. 1.1. Актуальность темы. Листериоз зарегистрирован во многих странах мира. У животных он проявляется как в единичных случаях, так и эпизоотией. Листериоз чаще всего регистрируют у овец, реже у крупного рогатого скота и свиней. На территории России за период 1956 - 1996 гг. было зарегистрировано 6153 неблагополучных по листериозу хозяйств, из них: 4970 - овцеводческие, 338 - скотоводческие, 845 - свиноводческие. В 2000 г. в России было выявлено 47 неблагополучных хозяйств, в которых заболело 1207 животных; из них пало - 444. Аналогичная ситуация наблюдалась и в последние годы.
В РФ сведения о заболевании людей листериозом как пищевой инфекции начали учитывать с 1992 года. В 1992-1999 гг. зарегистрировано 447 случаев листериоза людей, в том числе 119 - в Москве, 120 - в Ивановской области, 71 - в Тульской, 37 - в Волгоградской. В конце 20-го столетия в Канаде, Франции, Мексике, Великобритании, Швейцарии, США зафиксирован ряд крупных вспышек листериоза с высоким уровнем смертности при употреблении пищевых продуктов животного происхождения (молоко, молочные продукты, мясо, мясные продукты, яйца птиц), контаминированных листериями.
Для ранней диагностики заболеваний, вызванных разными микроорганизмами, первостепенное значение имеет обнаружение возбудителя в патологическом материале и специфических антител в сыворотке крови. Основное значение при этом приобретают экспресс-методы.
Род Listeria представлен семью видами листерий, однако патогенными являются только два: L. monocytogenes и L. ivanovii. Согласно СанПиН при выделении листерий необходимо идентифицировать L. monocytogenes.
Биологические свойства различных видов листерий близки и поэтому идентификация L. monocytogenes в исследуемом материале часто затруднена вследствие морфологических и биохимических особенностей возбудителя листериоза.
Предлагаемые ранее серологические методы не удовлетворяют полностью запросам практических врачей из-за необходимости приобретения дорогостоящего оборудования, сложности постановки реакций и многочисленных контролей к ним, а иногда и недостаточной специфичности получаемых результатов.
Учитывая возрастающую потребность практики в диагностических препаратах и необходимость выполнения микробиологического анализа с целью индикации листерий в пищевых продуктах и биоматериалах, целесообразность разработки и усовершенствования экспресс-метода является актуальной.
Простота реакции латекс агглютинации (РЛА) с латексными диагностикумами позволит решить данную пр^л^му. что'и-тоттоеделило выбор темы и направление исследований. I библиотека і
1.2. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась разработка чувствительного, быстрого и несложного в вьшолнении и учете результатов метода индикации листерий и обнаружения антител к ним на основе полимерных микросфер (латексов).
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Получить антигены листерий как в виде очищенных живых и инактивированных бактерий, так и цитоплазменных после разрушения бактерий ультразвуком.
-
Получить из гипериммунных сывороток разных видов животных специфические к листериям антитела.
-
Провести подбор микросфер и выбрать образец для приготовления латексных диагностикумов.
-
Отработать технологические параметры иммобилизации листерийных антигенов и антител на полимерных микросферах и изготовить экспериментальные образцы латексных диагностикумов.
-
Провести сравнительную оценку чувствительности, специфической активности, стабильности полученных серий иммунохимических латексных диагностикумов в реакции латекс агглютинации и тест-систем для реакции непрямой гемагглютинации (РИГА).
-
Оценить новые латексные диагностикумы для экспресс индикации листерий, а также для выявления листерийных антител в сыворотках крови животных.
1.3. Научная новизна. В результате проведенных исследований
впервые разработана методика получения латексных диагностикумов на
полимерных микросферах с реакционноспособными альдегидными
группами для экспресс метода индикации листерий и обнаружения антител
к ним.
Проведена сравнительная характеристика экспресс метода индикации листерий и обнаружения антител к ним в РЛА и РИГА.
Усовершенствован иммуноферментный метод индикации листерий.
1.4. Практическая значимость. Результаты проведенных
исследований позволили разработать антигенные латексные диагностикумы
для выявления листерийных антител в сыворотках крови больных или
переболевших животных и антительные латексные диагностикумы для
экспресс индикации листерий в различных биоматериалах.
Разработаны инструкции по изготовлению антигенных и антительных латексных диагностикумов и методические рекомендации по их применению с целью экспресс индикации листерий и обнаружения антител к ним.
Внедрение в практику разработанных средств и методов индикации листерий и обнаружения листерийных антител позволит сократить время проведения экспертизы и повысить результативность диагностики.
1.5. Положения выносимые на защиту.
-
Технологические принципы изготовления латексных диагностикумов на основе листерийных антигенов и антител.
-
Экспресс-метод на основе полимерных микросфер (латексов) для индикации листерий и обнаружения антител к ним.
3. Результаты изучения чувствительности, специфичности,
стабильности полученных серий иммунохимических латексных
диагностикумов в реакции латекс агглютинации в сравнении с
аналогичными тест-системами для РИГА.
1.6 Апробация результатов работы. Результаты, представленные в диссертации, доложены на научно-практических конференциях ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (г. Покров) 2001-2004гг.; совещании научных сотрудников ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии 23.12.2004 г.; на заседании ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии 20.01.2005г.
Проведены комиссионные испытания диагностикумов для постановки реакции латекс агглютинации и иммуноферментного анализа (ИФА) для экспресс-индикации листерий и листерийных антител.
1.7 Публикация результатов. По материалам диссертации
опубликовано 16 печатных работ, в том числе в центральных научных
журналах, материалах международных научно-практических конференций,
а также в материалах XV Международного симпозиума по проблемам
листериоза (ISOPOL XV, Уппсала, Швеция, 2004 г.).
-
Участие соискателя в получении научных результатов. Основные разделы диссертационной работы были выполнены лично автором. Разработки антительных и антигенных латексных диагностикумов осуществляли совместно с сотрудниками лаборатории "Прионных болезней".
-
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 124 стр. машинописного текста, иллюстрирована 21 таблицей, 6 схемами, 1 фотографией и дополнена приложениями. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования (материалы и методы, результаты исследований, обсуждение результатов исследований), выводы, практические предложения, список литературы, приложения, содержащие документы, подтверждающие практическую значимость работы. В списке литературы 150 источников, в том числе 73 иностранных.
