Введение к работе
Актуальность теш. Обеспечение населения страны качественными продуктами животноводства является важной народнохозяйственной задачей. Определенные трудности для ее решения создает заболевание крупного рогатого скота туберкулезом.
Современный уровень изученности туберкулеза животных, передовой опыт борьбы с гош, а также материальная оснащенность колхозов и совхозов позволяют обеспечить защиту стад от заноса возбудителя в благополучные хозяйства и ликвидацию заболевания на неблагополучных фермах. Однако недостатки в реализации планов организационно-хозяйственных и специальных мероприятий по профилактике и ликвидации этого заболевания нередк< служат причиной осложнения эпизоотической ситуации по туберхулезу животных.
Проводимые в настоящее время меры борьбы с отим заболеванием в некоторых случаях не всегда приводят к желаемым результатам.
Однил из препятствий на пути к искоренению туберкулеза является недостаточная чувствительность используемых мег дов лабораторной диагностики или их непригодность для широкомасштаб-ных оздоровительных мероприятий.
Разнообразие видов, большой диапазон фенотипической изменчивости микобактерий создают значительнее затруднения в их дифференциации и идентификации. В связи с этим в последние годы разрабатьтрігатся новые, более совершенные метода иден"чфикации микроорганизмов на основе современных достижений биотехнологии. Они отличаются высокой специфичностью, чувствительностью, разрешающей способностью, благодаря чему позволяют идь.ггифициро-вать микроорганизмы с измененной -нтигенной структурой и обладающих с антигенной общностью с другими видами. К такті методам относятся молекулярная гибрид зация нуклеиновых кислот, геномная "дактилоскопия", иммуноблотинг.
Имеющиеся сведения по идентификации отдельных бактерий Afrite G.b. , Affront! L.F. , 1968; Hidden P. «t al > I984; Jeffreys A.J. et al » !Э65; Рысков А.П. и др., 1988/, по сте-
пеки сходства ДНК, рестрикционного анализа да, электрофорети-ческих характеристик белков свидетельствуют о перспективности и больао-t информативности этих методов. Однако исследования в этом аспекте еще только развертываются и представляют большой научный и практический интерес, ибо они открывают новые возможности в идентификации и дифференциации возбудителей инфекционных болезней.
Цель к задачи исследование. Целью нашей работы была индикация и дифференциация микобактерий туберкулеза методом молекулярной гибридизации. Для разрешения.ее были намечены следующие задачи:
получить очищенные препараты хромосомалыюй ДНК разных видов микобактерий;
провести сравнительную характеристику гиперхромного эффекта Д*К бактериальных клеток;
получить ДНК-зонд из м. Ъо-via и определить пригодность его для дифференциации микобактерий;
изучить ДКК генома разных микобактерий методом геномной "дактилоскопии".
Научная новизна. Разработан способ дифференциации различных видов бактерий, основанный на расщеплении ДНК рестриктаза-ми, разгонке гель-электрофорезом в горизонтальном блоке с последующим переносом фрагментов ДНК на нитроцеллюлозные мембраны и определении гипервариабельных; участков ДНК при помощи зонда из ДНК фага ИІЗ, отличающейся тем, что применение рестрикта-зы Есо 91 I дает возможность получить генетический паспорт, специфичный для каждого вида микобактерий, что позволяет дифференцировать патогенные микобактерий от атипичных.
Усовершенствована методика выделения ДНК, которая позволяет получить препараты ДНК из кислото- щелочеустоЯчивых микобактерий с наименьшими затратами времени, реактивов' и бактериальных культур. Разработан метод выделения ДНК из М. avium , используя для разрушения клеточной стенки ультразвуковой дезинтегратор при частоте 22 кГц в течение 30-60 секунд.
Созван тотальный ДШ-зонд из ы. Ъопв , с помощью которого удается дифференцировать-патогенные микобактерий в патологическом материале.
«
Практическое значение. Усовершенствованы методы выделения ДНІ-С из микобактерий.
'.'етод ДНК-ДНК гибридизации позволяет провести индикацию патогенных форм и дифференциацию атипичных и патогенные микобактерий.
Метод геномной "дактилоскопии" появоляет идентифицировать все виды микобактерий туберкулез).
Апробация работа. Основные положения работы доло.т.ены и обсуждены на республиканской научно-производственной конференции Казанского ветеринарного института /I9QI-I992 гг./, мсгвузов-ской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 60-летию Ставропольского сельс ^хозяйственного института /1991/, Всероссийской научной ко :ференции в городе Троицк /1992/ и научной конференции ВНИИВНа;,'' в городе Покров /1992/.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано б научных работ.
Внедрение. Результаты работы используются в практике лабораторных исследований Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института и Казанского ветеринарного кь.титута.
Получено положительное решение по заявке на изобретение К? 4942381/13 047174 "Способ дифференциации различных видов микобактерий туберкулеза". Казанским ветеринарна:.! институтом к Всероссийским научно-исследовательским ветеринарным институтом оформлены рационализаторские предложения под ;? 318-91 от 3 апреля 1991 г. и 13 17 от 19 июня 1991 г. соответствен j.
На защиту выносятся. Способ дифференциации микобактерий туберкулеза, основанный на выявлении гипервариабельных последовательностей геномов, методом молекулярной гибридизации; индикация и идентификация ДНК мк обактерий методом дот-блот гибридизации.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов, иллюстрирована 2 таблицами к 50 рисунками. Список использованной литературы включает 26а иг ^очникоз, в том числе 127 иностранных работ.
