Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Современные представления о строении микобактерий туберкулеза 8
1.2. Бактериологическая диагностика туберкулеза 9
1.3. Методы обработки биологического материала для выделения микобактерий туберкулеза ...11
1.4. Питательные среды для культивирования микобактерий туберкулеза 13
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ...; 26
2.1. Материалы и методы 26
2.2. Результаты исследований ..31
2.2.1. Приготовление питательных сред с использованием биологических добавок и минерального комплекса... 31
2.2.1.1. Среды с использованием дрожжевой суспензии ...31
2.2.1.2. Среды с использованием оксидата торфа 32
2.2.1.3. Среды с использованием вытяжек из золы древесины березы ...34
2.2.1.4. Среды с использованием соевого молока, оксидата торфа и вытяжек из золы древесины березы...37
2.2.1.5. Среды с использованием вытяжек из золы древесины березы и оксидата торфа... , ...39
2.2.2. Изучение скорости роста различных видов микобактерий на коммерческих и опытных питательных средах .41
2.2.2.1. Скорость и интенсивность роста M.bovis (шт. 8, ВИЭВ) на различных питательных средах 42
2.2.2.2. Скорость и интенсивность роста M.tuberculosis (шт. H37Rv) на различных питательных средах 51
2.2.2.3. Скорость и интенсивность роста М.avium (шт. 780, ВИЭВ) на различных питательных средах... ..62
2.2.2.4. Скорость и интенсивность роста M.smegmatis (культура ГНУ ИЭВСиДВ) на различных питательных средах .69
2.2.3. Изменение ростовых свойств питательных сред (опытных и коммерческих) при различных сроках и условиях их хранения 70
2.2.4. Сравнительный анализ диагностической ценности питательной среды ИЭВСиДВ и коммерческих сред при посеве биоматериала лабораторных животных, зараженных патогенными микобактериями туберкулеза. ..79
2.2.5. Диагностическая эффективность плотных питательных сред при изоляции микобактерий из биоматериала больных туберкулезом сельскохозяйственных животных... ..82
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ... ...87
4. ВЫВОДЫ ...95
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ ...97
6. ЛИТЕРАТУРА ...98
7. ПРИЛОЖЕНИЕ ...ИЗ
- Бактериологическая диагностика туберкулеза
- Изучение скорости роста различных видов микобактерий на коммерческих и опытных питательных средах
- Сравнительный анализ диагностической ценности питательной среды ИЭВСиДВ и коммерческих сред при посеве биоматериала лабораторных животных, зараженных патогенными микобактериями туберкулеза.
Введение к работе
Актуальность темы
Туберкулез крупного рогатого скота -инфекционное, хронически протекающее заболевание человека и животных, представляющее одну из первостепенных проблем здравоохранения и приводящее к большим потерям среди поголовья сельскохозяйственных животных (MIL Зыков, 1976, 1978; В.П. Шишков, В.П. Урбан, 1991, 1998; А.С. Донченко, 1998; Н.А. Шкиль, 1998).
В настоящее время существует обширный комплекс бактериологических технологий для обнаружения «бактерий Коха» в биологическом материале животных. Однако, микробиологическая диагностика, методической основой которой является выявление культуры возбудителя, занимает одно из главных мест, так как их выделение очень важно для проведения дальнейших специальных ветеринарных мероприятий, и включает в себя различные аспекты: микроскопический, культуральный и биологический. Каждый из указанных методов имеет свои преимущества и недостатки (А.И. Каграманов, 1967; В.И. Голышев-ская, Н.И. Фадеева, 1987; Г.Ф. Коромыслов, 1998).
Считается, что одним из наиболее чувствительных методов индикации возбудителя туберкулеза из биологического материала животных является культуральный, так как позволяет получать положительные результаты при наличии малого количества микобактерий в исследуемом материале. Его эффективность во многом зависит от методов предварительной обработки биологического материала, так как обнаружение микобактерий в нем является одним из наиболее достоверных и информативных показателей, которому принадлежит решающая роль в диагностике туберкулеза. Непосредственно после открытия возбудителя туберкулеза было распространено мнение Р. Коха, согласно которому этот возбудитель является строгим паразитом и размножение его возможно только в животном организме. Г.Д. Павловский (1888) показал, что для этой цели можно использовать растительный субстрат - глицериновый кар-
5.
тофель с 0,5%-ным раствором соды. Тем самым было доказано, что поиски искусственных питательных сред для выращивания микобактерий туберкулеза являются перспективными (Н.М. Рудой, 1975; Т.Ф. Оттен и др., 1987).
В.И. Голышевская, Н.И. Фадеева (1987) высказали гипотезу, что скорость роста микобактерий туберкулеза определена генотипом данного возбудителя и ускорение их роста возможно только при искусственном его изменении, что является малоосуществимым. Но перспективным направлением, в данном случае, может быть конструирование питательных сред, направленных на сокращение сроков роста микобактерий туберкулеза.
Основные направления поиска путей усовершенствования бактериологической диагностики туберкулеза сводятся, в настоящее время, к следующим этапам: подбору наиболее эффективного способа обработки биоматериала, способствующего максимальному высвобождению микобактерий туберкулеза, созданию более эффективных питательных сред и разработке оптимальных физических режимов культивирования микобактерий туберкулеза (Т.Ф. Оттен и др.,1987).
Скорость роста различных видов микобактерий туберкулеза на питательных средах составляет 8-12 недель. Поэтому создание новых питательных сред, позволяющих сокращать сроки появления первых генераций микобактерий, является актуальной задачей, так как ускоряет окончательную постановку диагноза путем изоляции микобактерий, что важно для разработки дальнейших мероприятий профилактики и ликвидации туберкулеза сельскохозяйственных животных.
Цель и задачи исследований
Цель исследований - повысить диагностическую эффективность питательных сред для культивирования микобактерий туберкулеза и разработать новую, экономичную плотную питательную среду, позволяющую в более короткие сроки получить рост микобактерий туберкулеза.
б Задачи исследований:
приготовить различные варианты питательных сред с использованием биодобавок и растительного минерального комплекса;
сравнить скорость роста различных видов микобактерий на сконструированных опытных питательных средах в сравнении с коммерческими питательными средами (контрольные);
изучить влияние различных условий и сроков хранения на ростовые свойства сконструированных опытных питательных сред в сравнении с коммерческими питательными средами;
оценить диагностическую эффективность (информативность) опытных и коммерческих сред при посеве на них биологического материала от лабораторных животных и крупного рогатого скота.
Научная новизна
Разработана новая яичная питательная среда (ИЭВСиДВ) с использованием биологической добавки, стимулирующей рост микобактерий как референтных штаммов, так и патогенных культур возбудителя туберкулеза, выделенных из биологического материала животных.
Впервые в качестве заменителя солевого раствора, применяемого во всех плотных яичных питательных средах, использован сложный минеральный комплекс растительного происхождения. На питательную среду подана заявка на патент «Среда для культивирования микобактерий туберкулеза» (№2000126439,2000).
Практическая ценность
В результате подбора состава различных питательных сред и изучения их диагностической эффективности в сравнении с коммерческими питательными средами (Финн-2, Левенштейна-Йенсена, Гельберга, и Фаст-ЗЛ) разработана
новая плотная яичная питательная среда - ИЭВСиДВ. При посеве на такую среду биологического материала от лабораторных и сельскохозяйственных животных достигнуты высокая чистота посева, ускорение интенсивности роста мико-бактерий туберкулеза.
Питательная среда ИЭВСиДВ предложена для бактериологической диагностики туберкулеза в научно-исследовательских и практических учреждениях ветеринарного и медицинского профиля.
Бактериологическая диагностика туберкулеза
Для успешной борьбы с туберкулезом важное значение имеет своевременное выявление инфицированных и зараженных возбудителем туберкулеза животных при помощи прижизненной и посмертной бактериологической диагностики.
Диагноз на туберкулез устанавливают на основании результатов аллергического, патологоанатомического и бактериологического исследований с учетом эпизоотологических данных (А.Н. Шаров, 1982; Ю.Я. Кассич и др.Д990; И.И.Румачик, 1990; Т.М. Shinnik, 1996).
Бактериологическое исследование необходимо, в частности, для подтверждения результатов аллергического и патоморфологических методов диагностики туберкулеза и состоит из бактериоскопического, культурального и биологического методов обнаружения возбудителя (Ю.Ю. Данко, 1984; D. Del-lago, 1994).
Бактериоскопический метод включает бактериоскопию мазков, флотацию и люминесцентную микроскопию. В мазках, окрашенных по Циль-Нильсену, микобактерии туберкулеза могут быть обнаружены при наличии не менее 100000 бактериальных клеток в 1мл патологического материала.
В зависимости от результатов бактериоскопии на присутствие микобактерии и наличие посторонних микроорганизмов, выбирают метод обработки материала для культурального исследования и концентрацию раствора кислот для уничтожения сопутствующей микрофлоры (В.П. Шишков, В.П. Урбан, 1991).
Культуральный метод диагностики возбудителя туберкулеза дает положительные результаты при наличии в 1мл исследуемого биологического материала от 20 до 100 микобактерий. В основе его лежит способность микобактерий туберкулеза размножаться in vitro на соответствующих питательных средах. В результате размножения из отдельных микобактерий формируются микроколонии, которые, сливаясь между собой, образуют культуру (О.Р. Драб-кина, 1963).
Культуральный метод считается эффективным не только в отношении его диагностической ценности, он позволяет с большей достоверностью дифференцировать кислотоустойчивые сапрофиты от микобактерий туберкулеза, а также определять с большей точностью одно из важных свойств микобактерий - их вирулентность. Это открывает перспективы в области специфической профилактики и терапии.
Культуральный метод дает возможность выделить чистую культуру микобактерий и определить видовую принадлежность, что имеет большое значение в эпизоотологии туберкулеза, позволяет своевременно точно поставить диагноз, установить биохимические и биологические особенности и лекарственг ную чувствительность возбудителя (Н.М. Макаревич, И.В Дорожкова, 1983; И.И.Румачик, 1987;Ю.Я.Кассичидр., 1990; D.V. Cousins etal., 1989).
Культуральный метод является наиболее информативным в сравнении с прямой и с люминесцентной микроскопией, а диагностическая ценность микробиологических методов выявления возбудителя туберкулеза зависит от характера патологического материала (О.Р. Драбкина, 1963; В.М. Должанский, Е.В.Милованова, 1979).
Наличие характерных для туберкулеза изменений в биологическом материале свидетельствует чаще всего о заражении животных M.bovis. Но, отсутствие макроскопически характерных туберкулезных изменений, не исключает инфицирование животных этим видом микобактерий, обладающими понижен и ной жизнеспособностью (СМ. Буль и др., 1967; В.А. Колокшанский, Л.Б. Ко-локшанская, 1974; Г.Г. Мордовской, 1975; Э.Д. Лакман и др., 1983; PJ. Coletsos, 1960; J.G. Weiszfeiler, 1969).
Поэтому наряду с культуральным исследованием, необходимо также проводить биологическую пробу, так как данное исследование обладает Некоторым преимуществом при туберкулезе и позволяет дифференцировать мико-бактерии разных видов. При этом методе диагностики лабораторные животные заражаются даже при введении в их организм от 1 до 5 бактериальных клеток возбудителя туберкулеза (A.M. Кадочкин, 1984; М.Т. Клименко, ТС Гинзбург, 1987; L. Joubert, М. Prave, 1975).
Успех в проведении посева на питательных средах для выявления мико-бактерий туберкулеза зависит от рациональной обработки биологического материала и правильно подобранной питательной среды. Различная предпосевная обработка биоматериала показывает возможность использования многих питательных сред, применяемых для диагностики туберкулеза (Н.М. Макаревич и др., 1985; С.Г. Сафонова, В.И. Голышевская, 1990; В.И. Голышевская и Др., 1996).
Метод для подавления роста посторонней микрофлоры и выделения чистой культуры возбудителя туберкулеза из биологического материала был впервые применен в 1924 году Левенштейном и Сумиоши. Они опубликовали способ получения чистых культур, согласно которому для освобождения от посторонней микрофлоры биологический материал обрабатывался не щелочью, а кислотой, менее препятствующей росту микобактерий. Когда Гон в последующем предложил использовать более слабые растворы кислот и отказался промывать осадок дистиллированной водой при центрифугировании, метод был значительно упрощен и получил признание в модификации Гона-Левенштейна (О.Р. Драбкина, 1963).
Получение чистых культур микобактерий из биологического материала имеет ряд трудностей. Поэтому очень важно подобрать такой способ подавления сопутствующей микрофлоры в биологическом материале перед посевом, который был бы щадящим для выращивания микобактерий, то есть не угнетал их жизнеспособность. Вследствие этого для обработки биологического материала необходимо использовать такие вещества и в таких концентрациях, которые оказывали бы минимальное избирательное, повреждающее действие на микобактерий и максимальное уничтожающее - на сопутствующую микрофлору. К таким веществам относятся 3-6%-ные растворы серной кислоты, 5-15%-ные растворы соляной и щавелевой кислот и 4%-ный раствор едкого натра (В.В. Кузьмин, М.Ф. Иванчиков, 1953; АЛ. Аликаева, 1979; Ю.Я. Кассич, 1990).
Анализируя литературные данные, касающиеся различных методов предварительной обработки исследуемого биологического материала на туберкулез, становится ясным, что сведения о сравнительной ценности применяемых химических веществ довольно разноречивы.
На основании исследований В.Е. Косенко и др. (1987), В.Е. Щуревского и др. (1987) было установлено, что возбудители туберкулеза бычьего и человеческого видов устойчивы к воздействию 5-15-20%-ных концентраций серной, соляной и щавелевой кислот, при экспозиции 2 и 2,5 часа. Однако интенсивность роста культур снижается при обработке биологического материала (кусочки органов, лимфатические узлы) 5-10%-ными растворами серной кислоты при экспозиции 20-40 минут. Рост данных культур микобактерий при этом отмечен в пределах 32-38,4%. Ю.Я. Кассич и др.(1990) рекомендовали для использования в лабораторной практике 2-4%-ные растворы едкого натра.
Н.М. Тажгалиев (1983) предлагал после обработки биологического материала кислотами и щелочами двух-трехкратное промывание его физиологическим раствором. Для концентрирования микобактерий туберкулеза применяют метод флотации или центрифугирования, который основан на адсорбции углеводородами (ксилолом, бензином) микобактерий туберкулеза и всплывании последних вместе с ними. Этот метод чаще используют при исследовании молока, мокроты и другого биологического материала (П.А. Емельяненко и др., 1982).
Для предпосевной обработки биологического материала также можно эффективно использовать 1%-ные растворы этония и катамина, 0,05-0,1%-ные растворы хлоргексидинбиглюконата (К.А. Тургенбаев, 1991).
В.Д. Свиридов (1996), для повышения результативности бактериологической диагностики туберкулеза, предлагал обрабатывать биологический материал способом, исключающим вредное влияние каких-либо агрессивных химических веществ при выделении микобактерий, используя гомогенизирование биоматериала с добавлением раствора «Одессоль», в основу которого входит неионогенное поверхностно-активное вещество.
В ветеринарии общепринятыми способами обработки биологического материала являются методы Гона и А.П. Аликаевой (ГОСТ 26072 - 89, СТ СЭВ 3457-81).
Изучение скорости роста различных видов микобактерий на коммерческих и опытных питательных средах
В первой серии опытов была приготовлена среда с дрожжевой суспензией. На этой среде первичный рост M.bovis отметили на 19-е сутки, на протяжении всего срока наблюдения рост данной культуры возбудителя туберкулеза был скудным.
Проведенные исследования позволяют сделать заключение, что дрожжевая суспензия не может служить стимулятором роста M.bovis и не способствует нарастанию ее бактериальной массы. Поэтому дрожжевую суспензию в дальнейшей работе не использовали.
Во второй серии опытов оксидат торфа использовали для орошения поверхности среды Финн-2. Получены следующие данные: первичный рост M.bovis в вариантах с первого по четвертый зафиксировали на 10-е, в пятом варианте - на 7-е сутки. Высокая интенсивность роста данной культуры возбудителя туберкулеза в первом варианте появилась на 16-е сутки, во втором і третьем вариантах - на 18-е сутки, в четвертом варианте - на 14-е и в пятом ва рианте на 10-е сутки.
В третьей серии опытов первичный рост M.bovis в первом варианте поя вился на 15-е сутки; во втором - на 9-е, в третьем вариант - на 5-е сутки, где питательную среду добавляли минимальную концентрацию оксидата торфг Высокой интенсивности роста M.bovis в первом варианте достиг на 20-е сутк во втором и третьем вариантах - на 14-е сутки.
В четвертой серии появление роста M.bovis в первом, втором, третьем пятом вариантах зафиксировали на 6-е сутки, в четвертом варианте - на 5-е с; тки. Высокой интенсивности роста указанный штамм достиг на 18-е сутки і всех пяти вариантах.
Результаты проведенных исследований представлены в таблице 14.
Из результатов данных серий опытов следует, что добавление растворов оксидата торфа в различных концентрациях в качестве конденсационной жидкости, а также внесение данного вещества непосредственно в состав среды Финн-2, являются эффективными способами ускорения роста M.bovis. Кроме того, при проведении опыта установили, что для увеличения скорости появления как первичного, так и интенсивного роста данной культуры возбудителя туберкулеза, наиболее оптимальной концентрацией растворов оксидата торфа является минимальное его количество.
Результаты исследований скорости появления первичного и интенсивного роста M.bovis на средах с вытяжками из золы древесины березы, представленные в таблице 15, были следующие: в пятой серии первичный рост M.bovis в первом варианте появился на 20-е, во втором - на 11-е, в третьем - на 10-е, в четвертом - на 14-е сутки. Высокая интенсивность роста в первом варианте появилась на 28-е, во втором и третьем - на 18-е, в четвертом - на 24-е сутки.
В шестой серии появление первичного роста M.bovis в первом варианте зафиксировали на 16-е, во втором - на 6-е, в третьем - на 7-е, в четвертом - на 12-е сутки. Высокая интенсивность роста в первом варианте появилась на 22-е, во втором - на 12-е, в третьем - на 14-е и в четвертом - на 18-е сутки.
1 вариант Вытяжка золы (солевая основа), 100; Глицерин, 2 0,5 16 .22.
2 вариант Вытяжка золы (солевая основа), 100; глицерин, 2 1,5 6 12
3 вариант Вытяжка золы (солевая основа), 100; Глицерин, 2 3 7 14
4 вариант Вытяжка золы (солевая основа), 100; Глицерин, 2 4 12 18
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что использование 0,5%-ной вытяжки из золы древесины березы в составе питательных сред не дает ускорения роста M.bovis.
Для получения первичного роста в более короткие сроки и оптимального накопления бактериальной массы данной культуры возбудителя туберкулеза наиболее эффективными являются варианты с использованием 1,5 и 3%-ных вытяжек золы.
При посеве M.bovis на опытные варианты с соевым молоком, оксидатом торфа и вытяжкой из золы древесины березы были получены следующие результаты (табл. 16): в седьмой серии появление роста M.bovis в первом варианте отметили на 18е, во втором варианте - на 12-е сутки. Высокая интенсивность роста M.bovis в первом варианте достигла на 26-е, во втором варианте -на 16—е сутки. В восьмой серии первичный рост данной культуры возбудителя туберкулеза в первом, втором и третьем вариантах появился на 18-е, в четвертом варианте - на 10-е сутки. Высокая интенсивность роста в первом и втором вариантах появилась на 26-е, в третьем варианте - на 32-е; в четвертом варианте -на 18-е сутки.
Данные, приведенные в таблице 16 показывают, что испытанные впервые- в комплексе соевое молоко и вытяжки из золы древесины березы в составе среды, приготовленной по технологии среды Гельберга, могут заменить коровье молоко и солевой раствор данной среды. Однако по ростовым свойствам опытные среды уступают коммерческой среде Гельберга, поэтому дальнейшая работа с ней не проводилась.
Результаты роста M.bovis (шт. 8, ВИЭВ) на средах с использованием вытяжек из золы древесины березы и оксидата торфа представлены в таблице 17. В девятой серии первичный рост M.bovis в первом варианте появился на 14-е, во втором - на 6-е; в третьем, четвертом и пятом вариантах - на 10-е, в шестом -на 21-е, в седьмом - на 19-е, в восьмом - на 14-е; в девятом и десятом вариантах -на 13-е, в одиннадцатом и двенадцатом-на 21-е, в тринадцатом и четырнадцатом - на 14-е, в пятнадцатом - на 13-е сутки. Рост культуры возбудителя туберкулеза достиг высокой интенсивности в первом варианте - на 18-е, во втором - на 10-е; в третьем, четвертом и пятом - на 17-е; в восьмом, девятом и десятом - на 18-е; в тринадцатом - на 18-е, в четырнадцатом и пятнадцатом - на 21-е сутки.
В десятой серии рост M.bovis в первом варианте зафиксировали на 6-е, во втором - на 18-е сутки. Высокую интенсивность в первом варианте отметили на 10-е, во втором - на 24-е сутки.
В одиннадцатой серии первичный рост M.bovis появился в первом варианте на 6-е, во втором - на 10-е, в третьем - на 21-е сутки. Высокую интенсивность роста в первом варианте отметили на 14-е, во втором варианте - на 16-е сутки.
Сравнительный анализ диагностической ценности питательной среды ИЭВСиДВ и коммерческих сред при посеве биоматериала лабораторных животных, зараженных патогенными микобактериями туберкулеза
Для изучения диагностической эффективности были взяты плотные питательные среды Финн-2, Фаст-3 Л, ИЭВСиДВ, на которые засевали биоматериал полученный от морских свинок (15 проб), экспериментально зараженных M.bovis (шт. 8, ВИЭВ).Результаты проведенного опыта показали, что на опытной среде ИЭВСиДВ рост культур возбудителя туберкулеза бычьего вида (шт.8, ВИЭВ) при посеве биоматериала от морских свинок появлялся на 8-11-е сутки. Высокую интенсивность роста отмечали в пробах на 11-16-е сутки.
На питательной среде Финн-2 первичный рост колоний из биоматериала морских свинок зафиксировали на 13-16-е дни, что в среднем на четверо суток позже, чем на среде ИЭВСиДВ. Интенсивный рост M.bovis на этой среде отмечали на 21-26-е сутки или на 10 суток (в среднем) позже, чем на среде ИЭВСиДВ.
На питательной среде Фаст-ЗЛ первичный рост M.bovis при посеве биоматериала от морских свинок: появлялся на 16-19-е сутки, а высокая интенсивности - на 22-26-е сутки. Следовательно, на указанной среде первичный рост колоний M.bovis появлялся на 7 суток (в среднем) позже, чем на среде ИЭВСиДВ, а интенсивный - на 11 суток.
Таким образом, скорость появления первичного и интенсивного роста M.bovis (шт. 8, ВИЭВ) на опытной среде ИЭВСиДВ составляла 10,5±0,34 и 13,2±0,53, на среде Финн-2 - 14,б±0,25 и 23,7±0,48, на среде Фаст-ЗЛ соответственно - 17,2±1,12 и 24,4±1,60 суток. Различия показателей первичного и интенсивного роста достоверны - Р 0,01. Это подтверждает, что питательная среда ИЭВСиДВ, за счет минерально-биологического комплекса обладает большей диагностической эффективностью по сравнению с коммерческими питательными средами Финн-2 и Фаст-ЗЛ.
Для сравнения диагностической эффективности плотных питательных сред исследовали лимфатические узлы, полученные от 16 голов крупного рогатого скота, в которых при вскрытии были обнаружены изменения, характерные для туберкулеза.
Для посева использовали контрольные среды Финн-2, Фаст-ЗЛ и опытную среду ИЭВСиДВ (по 5 пробирок каждой из сред).
Пробирки с посевами просматривали каждый день до появления роста, затем - 1-2 раза в неделю.
Последний учет результатов исследований проводили на 54 день после начала опыта.
Данные, полученные в процессе опыта, следующие: на среде ИЭВСиДВ первичный рост микобактерий появлялся на 14-20-е сутки. Интенсивный роет отмечали на 16-24-е сутки.
На питательной среде Финн-2 рост первых генераций колоний появлялся на 18-26-е сутки, что на 5 суток (в среднем) позже, чем на среде ИЭВСиДВ. Накопление бактериальной массы происходило на 21-30-е сутки, что на 6 суток (в среднем) позже, чем на среде ИЭВСиДВ.
На питательной среде Фаст-ЗЛ появление роста культур зафиксировали на 18-27-е сутки. Хорошей интенсивности рост достигал на 22-31-е сутки. Скорость появление первичного и интенсивного роста на указанной среде отставала от скорости роста колоний на среде ИЭВСиДВ (в среднем) на 7 дней.
Из 16 заведомо положительных биологических проб, полученных от больных туберкулезом животных, положительные результаты на опытной среде ИЭВСиДВ мы получили в 15 пробах (93, 7%), на средах Финн-2 и Фаст-ЗЛ - в 12 пробах (75%).
Колонии микобактерий (проба № 6) с опытной среды ИЭВСиДВ были пересеяны на среды Финн-2, Левенштейна-Йенсена, Фаст-ЗЛ и среду ИЭВСиДВ. Первые генерации культур были отмечены на 12-е сутки на среде Финн-2 и ИЭВСиДВ, на 15-е сутки - на среде Фаст-ЗЛ и на 17-е сутки - на среде Левенштейна-Йенсена. Следовательно, опытная среда не оказывает тормозящего действия на рост микобактерий, выросших их биологического материала, при дальнейших пассажах, что было доказано при аналогичном пересеве эталонных штаммов микобактерий.
Суспензия биологического материала (14 проба) в дозе 1см3 была введена двум морским свинкам подкожно в область паха и одному кролику внутривенно в. краевую вену уха. Через 24 дня животные пали. При вскрытии у животных была обнаружена генерализованная форма туберкулеза, что позволило идентифицировать выросшие культуры как M.bovis. Внутренние органы обрабатывали методами Аликаевой и седиментации. Посев полученной суспензии проводили на среды Фаст-ЗЛ, Финн-2 и ИЭВСиДВ (по 5 пробирок каждой среды). На среде ИЭВСиДВ рост культуры появлялся на 11-е сутки, на среде Финн-2 - на 16-е сутки и на среде Фаст-ЗЛ - на 17-е сутки.
На основание проведенных исследований установлено, что входящие в состав опытной среды ИЭВСиДВ 1,5%-ный минеральный комплекс и оксидат торфа оказывают стимулирующее действие на рост микобактерий туберкулеза, что было подтверждено ранее при посевах эталонных штаммов микобактерий. Сроки появления первичного и интенсивного роста микобактерий на опытной среде ИЭВСиДВ составляли 16,6±0,57 и 19,5±0,86 суток соответственно. На среде Финн-2 - 21,4±0,90 и 25,3±0,93, на среде Фаст-ЗЛ - 23,1±0,97 и 26,7±1 суток. Результаты, полученные при статистической обработке данных скорости роста на опытной и контрольных средах, различны. Уровень вероятности меньше 0,01, что свидетельствует о достоверности результатов.
Таким образом, на основание проведенных исследований следует, что среда ИЭВСиДВ по диагностической эффективности превосходит известные коммерческие среды Финн-2 и Фаст-ЗЛ. Рост первых генераций микобактерий из биологического материала выявлен на ней на 5,6±0,54 дней раньше, что является важным фактором в постановке диагноза на туберкулез. Данные динамики роста культуры возбудителя туберкулеза бычьего типа (шт. 8, ВИЭВ) из биоматериала лабораторных и сельскохозяйственных животных представлены на рисунке 2 (А) и 2 (В).
