Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Общая характеристика возбудителя бруцеллеза 9
1.2. Изменчивость возбудителя и ее значение в патологии 15
1.3. Биологические свойства L-форм бруцелл 23
1.4. Методы индикации и идентификации бруцелл 30
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 35
2.1. Материалы и методы исследований 35
2.2. Условия и закономерности образования L-форм бруцелл видов В. abortus и 4-го биотипа В. suis (В. rangiferi) in vitro 44
2.3. L-трансформация бруцелл видов В. abortus и 4-го биотипа В. suis (В. rangiferi) in vivo 48
2.3.1. Образование L-форм В. abortus 48
2.3.2. Образование L-форм 4 биотипа В. suis-В. rangiferi 54
2.4. Морфологические, культуральные, тинкториальные, биохимические, антигенные, агглютинабельные и вирулентные свойства L-фенотипов бруцелл, полученных in vitro 66
2.5. Морфологические, культуральные, тинкториальные, биохимические, антигенные, агглютинабельные и вирулентные свойства L-фенотипов бруцелл, выделенных от животных 76
2.6. Электронно-микроскопическое исследование L-вариантов бруцелл 84
2.7. Морфометрический метод оценки патогенности L-вариантов бруцелл различного происхождения и культур-ревертантов, полученных от них 87
2.8. Сравнительная оценка методов индикации и идентификации бруцелл с учетом изменчивости возбудителя 93
2.8.1. Многократные пересевы L-форм бруцелл на искусственных питательных средах 93
2.8.2. Пассирование L-форм бруцелл через организм лабораторных животных 96
2.8.3. Индикация L-форм бруцелл с применением L-антисыворотки 98
2.8.4. Метод комплексной идентификации L-форм бруцелл 103
3. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 109
4. ВЫВОДЫ 128
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 130
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 131
ПРИЛОЖЕНИЕ 156
- Биологические свойства L-форм бруцелл
- Морфологические, культуральные, тинкториальные, биохимические, антигенные, агглютинабельные и вирулентные свойства L-фенотипов бруцелл, полученных in vitro
- Многократные пересевы L-форм бруцелл на искусственных питательных средах
Введение к работе
Актуальность темы. Бруцеллез животных до настоящего времени имеет довольно широкое распространение в мире. По данным Объединенного комитета экспертов ФАО / ВОЗ по бруцеллезу (шестой доклад, 1986 г.), это заболевание среди крупного рогатого скота, овец, коз, свиней и северных оленей регистрируется в 155 странах.
В России, несмотря на имеющиеся достижения науки и передового опыта по оздоровлению хозяйств от бруцеллеза, эта хроническая инфекция среди сельскохозяйственных животных все еще представляет весьма сложную проблему как с точки зрения экономической, так и социальной значимости.
При бруцеллезе успех ликвидации болезни и предупреждения распространения инфекции во многом зависит от своевременности и точности поставленного диагноза. Повышенную актуальность этой проблеме придает изменчивость возбудителя. Среди животных довольно часто циркулируют измененные формы возбудителя бруцеллеза.
По данным ВНИИБТЖ и ИЭВСиДВ (И.А. Косилов с соавт., 1976, 1992; В.Г. Ощепков с соавт., 1983, 1990; Л.Н. Гордиенко с соавт., 1989, 2001), за последние десятилетия доля измененных форм выросла с 12,9% до 70-80%, от общего количества бруцелл, выделенных от животных в стадах с естественным течением эпизоотии. У полевых L-вариантов авторы отмечали существенные изменения основных биологических свойств, определяющих характер специфических взаимоотношений макро- и микроорганизмов: трансформацию антигенной структуры в сторону S - SR - RS - R - RL - LR - L и значительное понижение вирулентности.
Эти изменения определенным образом влияют на проявление патогенеза и в свою очередь обуславливают особенности диагностики бруцеллеза.
Таким образом, в очагах инфекции, где циркулируют L-формы возбудителя, значительно реже отмечаются аборты. Реверсия же возбудителя в интакт-
ное состояние, как правило, может приводить к рецидивам в оздоровленных стадах.
Для L-форм характерно резкое изменение морфологии бактериальной клетки и снижение уровня метаболизма. L-формы бруцелл могут находиться в организме животных в стабильном и нестабильном состояниях, то есть реверсировать в исходный микробный вид с восстановлением вирулентности.
В хозяйствах на фоне бесконтрольного использования химиотерапии и специфических биопрепаратов создаются благоприятные условия для образования L-форм бруцелл в организме животных. L-формы искажают и сглаживают клинические проявления болезни.
Основываясь на опубликованных данных (П.А. Вершилова, 1972; В.Д. Тимаков, 1973; П.А. Триленко, 1976; И.А. Бакулов, 1980; СВ. Прозоровский, 1981; В.Г. Ощепков, 1983 и др.), можно полагать, что одной из причин длительного сохранения очагов бруцеллеза и возникновения случаев повторных эпизоотических вспышек этой инфекции являются глубоко измененные (L-) формы бруцелл, которые по своим биологическим свойствам существенно отличаются от типичных культур возбудителя и не выявляются имеющимися в настоящее время средствами диагностики.
Сложность диагностирования бруцеллеза вызываемого L-формами бруцелл с помощью традиционных бактериологических и иммунологических методов, в свою очередь, определяет актуальность разработки способов быстрой и четкой идентификации и дифференциации измененных форм бруцелл, доступных как для научно-исследовательских, так и для производственных ветеринарных лабораторий.
Цель и задачи исследования. Целью исследований является разработка нового метода индикации и идентификации L-форм бруцелл, а также изучение условий и закономерностей образования L-вариантов бруцелл 4-го биотипа В. suis (В. rangiferi) и изучение биологических свойств полученных L-форм.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
Получить in vitro L-варианты бруцелл различного происхождения.
Выделить L-варианты бруцелл из организма основных хозяев (крупный рогатый скот, северные олени).
Изучить условия образования и биологические свойства, полученных L-форм бруцелл видов В. abortus и В. rangiferi.
Получить стабильную L-форму бруцелл, пригодную для изготовления L-диагностикумов.
Разработать эффективный метод индикации и идентификации бруцелл с учетом изменчивости возбудителя.
Научная новизна. Поданную на изобретение заявку «Способ получения диагностической L-сыворотки» получено уведомление о положительном результате формальной экспертизы (№ 2003121773/13(023123) от 15.07.2003 г.).
Получен стабильный L-вариант бруцелл, обладающий строгой специфичностью и широким диапазоном антигенной активности, пригодный для изготовления L-диагностикумов: L-антиген и L-антисыворотка.
Разработан, апробирован и предложен к применению метод "Комплексной идентификации L-форм бруцелл".
Изучены особенности L-трансформации и биологические свойства L-вариантов бруцелл 4-го биотипа В. suis (В. rangiferi), in vitro и в организме северных оленей.
Практическая значимость. Разработаны методические рекомендации «Методы индикации и идентификации L-форм бруцелл», утверждены методической комиссией ВНИИБТЖ, протокол № 3, от 26.09.2003 г.
Предложенный метод комплексной идентификации L-форм бруцелл позволит повысить достоверность лабораторной диагностики бруцеллеза, а значит объективно оценивать эпизоотическое состояние по бруцеллезу стад и, следо-
вательно, своевременно и обоснованно грамотно проводить противобруцеллез-ные мероприятия.
Полученные результаты исследований являются новыми научными сведениями, которые необходимо учитывать при работе в научно-исследовательских ветеринарных учреждениях, занимающихся проблемами бруцеллеза животных, а также можно использовать в учебном процессе при подготовке ветеринарных специалистов.
Апробация полученных материалов. Материалы диссертации доложены и обсуждены: на ученых советах ВНИИБТЖ, г. Омск, 1999, 2000, 2001, 2002 гг.; шестой научной конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов института ветеринарной медицины ОмГАУ, 2000 г.; на конференции молодых ученых, ВНИИБТЖ, г. Омск, 2000 г.; седьмой научной конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов института ветеринарной медицины ОмГАУ, 2001 г.; Всероссийской научной конференции по проблемам хронических инфекций, ВНИИБТЖ, г. Омск, 2001 г.; научно-практической конференции факультета ветеринарной медицины НГАУ, г. Новосибирск, 2001 г.; \л международном конгрессе по проблемам инфекционной патологии, г. Новосибирск, 2002 г.
Публикация материалов исследований. По материалам диссертации опубликовано 7 научных статей и подана 1 заявка на изобретение.
Внедрение результатов исследований. Получено уведомление о положительном результате формальной экспертизы на изобретение « Способ получения диагностической L-сыворотки» (№2003121773/13(023123) от 15.07.2003 г.).
Полученные результаты научных исследований вошли составной частью в методические рекомендации «Методы индикации и идентификации L-форм бруцелл», утверждены методической комиссией ВНИИБТЖ, протокол № 3 от 26.09.2003 г.
Основные теоретические положения и экспериментальные данные, изложенные в диссертационной работе, используются в научно-исследовательских лабораториях ИЭВСиДВ, ЯНИИСХ, НИИВВС, ИркНИВС, ВНИВИ, ВНИИБТЖ; в учебном процессе на кафедрах микробиологии и эпизоотологии ОмГАУ, НГАУ, АГАУ, КГАУ, ДонГАУ и ТСХА.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 156 страницах компьютерного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список литературы, включающий 239 источника, в том числе 70 -иностранных и приложение.
Материалы диссертации иллюстрированы 34 таблицами, 15 рисунками, 2 диаграммами.
Биологические свойства L-форм бруцелл
Всесторонним изучением возбудителя бруцеллеза неоспоримо доказано многообразие форм его существования, чрезвычайно большая вариабельность морфологии и широкий диапазон изменчивости биологических свойств.
Своеобразие морфологической структуры, характера роста на питательных средах, способность воспринимать окраску, особенности размножения, биохимизм обмена веществ, антигенной структуры и патогенности, склонность к стабилизации и реверсии составляют биологические особенности L-форм бруцелл. Измененные формы бактерий, имеющие дефекты клеточной стенки, заслуживают особого внимания и изучение L-трансформации возбудителя бруцеллеза. Это весьма актуально не только в теоретическом отношении, но и для решения ряда практических задач, в частности, диагностики этого заболевания (В.П. Урбан, 1991; В.Г. Ощепков, 1998).
Первоначальные сведения о L-формах бруцелл приведены в работе J. Nelson и R. Pickett (1951), выделивших их из крови больного человека. L-культуры давали положительную реакцию с антибруцеллезной сывороткой и позднее в лабораторных условиях реверсировали в S-формы бруцелл.
Дальнейшие исследования L-форм бруцелл были направлены на изучение возможности L-трансформации у разных видов, на подбор питательных сред, изучение ультраструктуры и биологических свойств L-вариантов, полученных экспериментально и выделенных от больных животных, а также на изыскание способов дифференциации и идентификации (T.N. Todorov et al., 1980; Т.В. White et al., 1980; A.W. Martin Phyllis et al., 1981).
Достаточно подробно изучены морфологические и другие биологические свойства L-форм бруцелл, полученных под действием пенициллина М.А. Мир-заевой, Н.Н. Островской (1977), Л.Н. Гордиенко (1981, 1982), Д.А. Хузиным, A.M. Фоминым (1983) Р.Ж. Ищановой с соавт. (1986), А.А. Абуталиповым (1987, 1972, 1977), B.A.Hatten et al. (1973), M.R.Stinebring, I.R.Kunber (1982), M.D.Hienesetal.(1987).
Трансформация бруцелл под влиянием антибиотиков выражается повышением устойчивости микроорганизмов к ним, изменением морфологии, ферментативных и антигенных свойств (Е.И. Кайтмазова, Н.Н. Островская, 1967; П.А. Триленко, 1980; Е.М. Simon, D.T. Berman, 1962).
На основании результатов исследований (В.Д. Тимаков, Т.Я. Каган, 1961, 1973; СВ. Прозоровский, 1981) доказана общность структур L-форм разных видов бактерий, а также выявлены специфические особенности L-форм бруцелл. Динамика морфологических и структурных изменений в процессе L-трансформации показана Т.А. Толмачевой с соавт (1979). При этом условно выделены этапы: начальный (1-5 пассажей), средний (5-10 пассажей), поздний (10 и более пассажей). На начальном этапе образуются формы несбалансированного роста, сферопласты, имеющие тенденцию к слиянию. На среднем этапе появляются крупные шаровидные клетки и большие тела, варьирующие по форме, оптической плотности, размерам, на позднем - форма клеток неправильная, появляются бесструктурные массы. На всех этапах L-трансформации отмечается наличие двух мембран (сферопластный тип). Особенности субмикроскопической организации L-форм бруцелл изучены этими же авторами, а также Л. Пешковым, В. Федоровым (1978), Л.Н. Кац (1989), Д.А. Хузиным с соавт. (1980); В.Г. Ощепковым (1990).
Методом электронной микроскопии выявлены особенности ультраструктуры клеток на всех этапах L-трансформации - развитая система внутрицито-плазматических мембран, разнообразие способов репродукции (равновеликое и неравновеликое деление, фрагментация цитоплазмы, образование элементарных тел внутри и на поверхности клетки).
Структурные изменения, имеющие место в процессе L - трансформации, затрагивают в первую очередь клеточную стенку бактериальной клетки, нарушая целостность ее отдельных компонентов, или вызывают ее полную редукцию. Поэтому функции поверхностной структуры полностью переходят к ци-топлазматической мембране, что определяет своеобразие структурной организации и биологической характеристики L-форм бруцелл (СВ. Прозоровский с соавт., 1981; I. Parnas, 1976).
Таким образом, на основании данных световой и электронной микроскопии для L-форм, независимо от видового происхождения, характерны морфологические признаки: своеобразная структура колоний, полиморфизм микроструктур, составляющих их, полное или частичное отсутствие клеточной стенки, наличие особой цитоплазматической мембраны, утрата лизосом. Однако эти признаки не являются специфическими для L-форм бруцелл. Они отмечаются и у других видов бактерий при L - трансформации.
Бруцеллы, как и другие микроорганизмы, имеют определенный химический состав, который обусловливает их видовую принадлежность.
Впервые наиболее полную химическую структуру бруцелл дал М. Romachandran (1964).
В состав клетки бруцелл входит вода, белки, углеводы, липиды и минеральные соли.
Ригидность и структурную целостность клеточной стенки у бруцелл определяет пептидогликан, прочно связанный с матриксным белком и липопро-теидом наружной мембраны (Ф.И. Усманова, М.М. Ременцова, 1979).
Многие работы посвящены изучению полисахаридов, липополисахаридов и липополисахаридно-белковых комплексов бруцелл (Н.И. Александров с со-авт., 1970; Н.Г. Шин с соавт., 1970; Е.А. Драновская, 1971; С.А. Аскерова, 1987; C.Puburan, 1983). Это связано с тем, что липополисахарид является главным антигеном, участвующим в стандартных, общепринятых серологических тестах, а в комплексе с белком он определяет иммуногенные свойства и некоторые стороны взаимодействия бактерий с организмом, а также устойчивость микроорганизмов (Ф. Герхардт и др., 1984; Н.П. Елинов, 1989).
При изучении химического состава L-форм бруцелл рядом авторов выявлены изменения углеводного, белкового состава, уменьшение высокомолекулярных компонентов (Е.А. Драновская с соавт., 1972, 1977; Е.О.Мозесюк, 1981, 1987; W.D. Hienes et al., 1987; I. Roux, 1976). Культуры L-форм отличаются от бруцелл в S-форме более широкой амплитудой метаболизма (Е.О.Мозесюк с соавт., 1983).
По данным Г.Я. Каган (1963), L-формы утрачивают основные компоненты клеточной стенки: L-диаминопимелиновую и мурамовую кислоты, в клетках нарушается синтез глюкозамина и полисахаридов, возрастает количество липи-дов, нуклеиновых кислот. И.И. Дубровская и Н.Н. Островская (1961) при изучении химического состава и антигенной структуры бруцелл, подвергнутых воздействию фага, отмечают нарушение липоидно-жирового и нуклеинового обмена. Но, что касается ДНК, то качественный состав у бактериальных и L-форм остается одинаковым (В.Д. Тимаков, Г .Я. Каган, 1961).
В результате исследований В.И. Мельниченко с соавт. (1987) нуклеотид-ного состава клеток бруцелл с различными биологическими свойствами было отмечено, что содержание гуанина и цитозина находится примерно на одном уровне. Однако степень подобия нуклеотидных последовательностей может отличаться.
В состав бруцелл входит большое количество антигенных компонентов, среди которых поверхностные антигены, локализующиеся в клеточных оболочках, играют, вероятно, основную роль в патологической и протективной активности (А.А. Ваева, И.Ф. Таран, 1975).
Изменение структуры и химического состава, претерпеваемые бруцелла-ми в процессе L-трансформации, нашли отражение и в изменении их антигенной структуры.
Отличительной особенностью антигенной структуры L-форм бактерий является содержание главным образом детерминантов цитоплазматической мембраны, которые у родительских бактериальных форм не всегда выявляются из-за преобладания у них антигенных компонентов клеточной стенки (В.Д. Тимаков, Г.Я.Каган, 1973; Е.И. Коптелова, 1974).
Данные об антигенной характеристике L-форм бруцелл разноречивы. Большинство исследователей отмечают сохранение антигенного родства у L-форм и исходных культур бруцелл (Е. Nelson, R. Pickett, 1951; B.D. Hienes et al., 1964; R.E. Bangh, B.A. Freeman, 1966; I. Peschkov, 1971, 1979; Л.Н. Гордиенко, 1981). Это в значительной степени объясняется сохранением фрагментов клеточной стенки. Противоположные результаты получены I. Schmitt-Slomska et al.(1982). П.А. Триленко с соавт.(1984) параллельно с реверсивными L-вариантами от больных животных выделили и другие формы, отличительной особенностью которых являлось отсутствие антигенной связи с типичными бруцеллами.
По данным Е.О.Мозесюк (1987), L-формы бруцелл разных видов по антигенной структуре однородны, обладают групповым специфическим антигеном.
Методом люминесцентной микроскопии отмечена потеря строгой специфичности свечения L-форм в сравнении с S-формами (Л.В. Дегтяренко, 1986). При этом характер распределения антигенов у L-форм менялся в зависимости от стадии L-трансформации: увеличенные в размере клетки сохраняли равномерное периферическое свечение; крупные клетки - неравномерное, точечное, периферическое или диффузное свечение при обработке S- и R-люминисцентной сывороткой, что указывает на наличие остатков клеточной стенки.
По данным А.Л. Воробьева (1983) у бруцелл наиболее подвержена изменчивости при L-трансформации антигенная структура, о чем свидетельствуют показатели РА и проба с фагом Тб.
Изменение антигенной структуры L-форм бруцелл сопровождается утратой иммуногенных свойств и снижением вирулентности. И.И. Дубровская и Н.Н. Островская (1960) отмечают резкое понижение (в 3-5 раз) содержания гек-созамина, который влияет на снижение вирулентности культуры, что подтверждается исследованиями ряда авторов (В.А. Hatton, S.E. Sulkin, 1971; Н.Н. Островская, Т.А. Толмачева, 1974; А.П. Шувалов с соавт., 1976; Н.А. Грекова с со-авт., 1979; М.А. Мирзаева, 1981; В.Г. Ощепков, 1983; Д.А. Хузин, 1984; И.А. Базиков с соавт., 1991;).
Г. Roux, I. Sassine (1971) из вирулентной культуры В. melitensis 204 под действием пенициллина получили непатогенную для мышей и морских свинок t L-формы, быстро элиминирующиеся из организма. Однако Т.А. Толмачева с соавт. (1979) отмечали персистирование L-форм вирулентного штамма В. abortus 870 в костном мозге и лимфоидной ткани морских свинок в течение 180 дней.
П.А. Вершилова с соавт. (1982),Р.Ж. Ищанова с соавт. (1986) наблюдали длительную приживаемость L-форм у экспериментально зараженных морских свинок.
Б.П. Цыбин, И.Ф. Таран (1978, 1979) отмечали значительные патологические изменения в органах при заражении животных L-формами бруцелл. Выделенные от крупного рогатого скота L-варианты бруцелл (Л.Н. Гордиенко, О.Г. Гертман, 1989) отличались от типичных бруцелл по морфологическим, культу-ральным и биохимическим свойствам, но в значительной степени сохраняли патогенность и способность вызывать инфекционный процесс с характерными для бруцеллеза патологическими изменениями.
По данным Н.А. Грековой с соавт. (1979), L-формы бруцелл являются слабопатогенными для морских свинок, вызывают незначительное раздражение ретикулоэндотелиальной системы лимфоузлов и органов, т.е. L-формы способны длительно персистировать в организме, а также размножаться и выделяться из организма животных (В.А. Freeman. В.Н. Rumach, 1964; I. Roux, 1977; Т.А. Толмачева и др., 1977; А.В. Кононов, 1979; Б.П. Цыбин, 1981).
Г.З. Идрисов, О.П. Ионова (1990), выявляя с помощью коммерческой противобруцеллезной люминесцирующей сыворотки в тканях инфицированного организма как исходные, так и L-формы штаммов бруцелл, отмечают, что характер распределения антигена L-форм, его накопление в лимфоидной ткани и последующее распространение в другие органы соответствует периоду обострения патологического процесса.
Ряд проведенных исследований (B.C. Левашов, СВ. Прозоровский, 1960; П.А. Вершилова с соавт., 1979; И.Ф. Таран с соавт., 1981; И.А. Базиков, И.Ф. Таран, 1989; В.А. Hatton, S.E.Sulkin, 1968) предполагают, что нестабильные L зо
формы реверсируют in vitro и в организме восприимчивых животных в вирулентные микроорганизмы.
И.Ф. Таран с соавт. (1981), И.А. Драновская с соавт. (1981), Е.О. Мозесюк с соавт. (1983) полного восстановления всех биологических свойств у культур-ревертантов не получили. При этом ревертанты, полученные in vivo, по вирулентности и агглютиногенности более близки к исходной культуре. Ревертанты, полученные in vitro, отличаются по антигенной структуре и химическому составу и более близки к L-культурам.
Т.А. Толмачева (1975), изучая способность реверсии L-форм, отмечала ее зависимость от степени стабилизации культур.
По мнению П.А. Триленко (1976), СВ. Прозоровского (1985), В.Г. Ощеп-кова (1990), факт длительной персистенции бактерий, сохранивших участки клеточной стенки, агглютинирующихся сывороткой интактных микробов, представляют серьезную опасность с позиции возможности их реверсии и роли в патогенезе многих инфекционных заболеваний.
Морфологические, культуральные, тинкториальные, биохимические, антигенные, агглютинабельные и вирулентные свойства L-фенотипов бруцелл, полученных in vitro
В результате воздействия различных концентраций пенициллина получены L-варианты из трех штаммов (В. abortus 19 и 544; В. rangiferi 181), первоначально состоящих из S-форм бруцелл.
В процессе L-трансформации при воздействии пенициллина в дозах 15-20 тыс. ЕД/мл на 18-20 генерации были получены относительно стабильные L-варианты бруцелл овоидного типа.
Полученные варианты заметно отличались от исходных штаммов по своим культуральным свойствам (табл. 10).
Полученные L-варианты заметно отличались от исходных культур по энергии роста. L-варианты референтного (В. abortus 544) и полевого (В. rangiferi 181) штаммов отличались слабым ростом. Лишь на 14-е сутки отмечался их слабый рост. Колонии становились плоскими, мелкими (размером менее 1,0 мм), со значительным матовым оттенком.
Относительно энергии и характера роста исключение составлял L-вариант, полученный из вакцинного штамма В. abortus 19. Он проявлял хорошие ростовые свойства уже на 2-4 сутки. Колонии его были крупными (3,0-4,0), уплощенными, бело-матового цвета.
Все полученные L-варианты, культивируемые на мясо-пептонном бульоне, также не образовывали характерного для типичных бруцелл пристеночного кольца, образуя рыхлый осадок на дне пробирки матового и матово-белого цвета, при этом просветление среды происходило не всегда. У L-варианта референтного штамма В. abortus 544 значительно уменьши лась способность образования сероводорода, а у вакцинного штамма В. abortus 19 вообще исчезла. Все полученные in vitro L-фенотипы бруцелл стали менее восприимчивы к действию анилиновых красителей при посевах на среды с их содержанием. О глубоких изменениях в клетках L-вариантов, произошедших в процессе L-трансформации, свидетельствуют и положительные результаты реакции термоагглютинации и пробы с трипафлавином.
При изучении агглютинабельных свойств L-вариантов, образованных in vitro, получены следующие результаты (табл. 13).
На данной стадии L-варианты штаммов В. abortus 544 и В. rangiferi 181 в значительной степени сохраняли исходные антигенные структуры.
Вместе с этим было отмечено, что у L-вариантов появился новый дополнительный L-антиген.
У всех L-вариантов не отмечалось антигенного родства с R-антисывороткой, как и у исходных штаммов.
Отдельно стоит подчеркнуть агглютинабельные свойства L-варианта вакцинного штамма В. abortus 19. Полученный L-вариант полностью утратил S-детерминант исходного штамма, давал отрицательные результаты с R-антисывороткой и при этом проявлял достаточно высокую активность с L-антисывороткой (диагностический титр 1:320).
Таким образом, полученные in vitro L-варианты существенно отличаются по морфологическим, культуральным, тинкториальным и агглютинабельным свойствам.
Они дают атипичный рост на питательных средах, их клетки в 3-5 и более раз увеличены в размерах, не характерно окрашиваются анилиновыми красителями и приобрели цитоплазматический L-антиген. При этом они имеют достаточно сходные свойства между собой.
Для изучения биологических свойств L-варианта вакцинного штамма В. abortus 19, индуцированного in vitro под действием пенициллина, использовали две группы лабораторных животных (морские свинки).
Многократные пересевы L-форм бруцелл на искусственных питательных средах
Принадлежность к роду Brucella может быть достоверно установлена путем реверсии L-вариантов в типичную бактериальную форму.
Поэтому для подтверждения принадлежности изучаемых культур к бру-целлам, предварительно отнесенных к L-формам, их подвергали последовательным пересевам на свежих питательных средах без индуцирующего фактора.
Для изучения реверсибельных свойств были выбраны L-варианты различного происхождения, а именно: экспериментально полученные - В. abortus 19, 544 и В. rangiferi 181 и выделенные от животных - № 834, 853, 1715,1726 от северных оленей и 1313 от коровы.
В качестве питательной среды для реверсии L-форм бруцелл использовали мясо-пептонный печеночный глюкозо-глицериновый агар с добавлением 15-20% нормальной сыворотки лошади.
Через каждые 2-3 пересева, сделанных с интервалом 2-3 или 7-10 суток, у культур изучали морфологические, тинкториальные, агглютинабельные и другие свойства и сравнивали их с первоначальными.
При последовательных пересевах на искусственных питательных средах изучаемые L-варианты бруцелл реверсировали в типичную бактериальную форму неодинаково (табл. 27).
У большинства L-культур (пять из восьми) реверсия происходила в результате 5-20 пересевов с полным восстановлением фенотипических и биологических свойств. Клетки ревертанты приобретали кокковидную форму, их размеры составляли 0,3 - 0,5 мкм, грамнегативность и характерную (красную) окраску по Козловскому, а также S-агглютинабельность (рис. 9).
Однако у остальных трех L-культур отмечали частичную реверсию с незначительным изменением исходных свойств. Их клетки сохраняли сферическую и эллипсоидную форму, цитоплазматический L-антиген и лишь в некоторых случаях приобретали характерную для типичных бруцелл окраску по Козловскому.
Таким образом, L-варианты бруцелл, изолированные из организма животных, также как и L-варианты, экспериментально полученные in vitro, обладают способностью к реверсии в результате последовательных пересевов на искусственных питательных средах.
В процессе изучения реверсибельных свойств L-вариантов установлено, что в условиях искусственной питательной среды при многократных пересевах в течение длительного времени (около 1-2 лет) полное восстановление всех признаков, характерных для типичных (S-) форм бруцелл, наблюдали у 63% изучаемых культур.
В заключении можно сделать вывод, что идентификацию с использованием метода последовательных пересевов на искусственных питательных средах, целесообразно проводить у L-форм бруцелл начального и среднего этапов L-трансформации.
Идентификацию бруцелл возможно осуществлять путем пассирования через организм лабораторных животных, с целью получения культур-ревертантов с последующим определением принадлежности их к бруцеллам.
С этой целью были выбраны L-варианты, изолированные от животных: 1313 от коровы, 834,853,1715,1726 от северных оленей и экспериментально полученные in vitro В. abortus 19.
Для этого из двух суточных агаровых культур изучаемых L-вариантов готовили взвесь, которой подкожно в область паха заражали морских свинок в дозе 1x106 м.к.
Через 30 суток после заражения производили контрольный убой и делали высевы на питательные среды.
Для повторных пассажей использовали культуры с признаками начавшейся реверсии.
Полное или значительное восстановление у L-вариантов свойств, характерных для типичных бруцелл наступало обычно при одном-трех пассажах (табл. 28).
Так при однократном пассировании через организм лабораторных животных полное восстановление свойств, характерных для типичных бактериальных форм произошло у одной культуры под № 1726L, выделенной от северного оленя.
После двукратного пассирования через организм морских свинок восстановление биологических свойств отмечали у четырех культур под № 834, 853, 1313 и 1715, выделенных от крупного рогатого скота и северного оленя.
От В. abortus 19L, полученной in vitro под действием антибиотиков, культура ревертант была получена после трехкратного пассирования через организм морских свинок (рис. 10).
В итоге от всех шести изучаемых L-вариантов бруцелл различной этиологии путем пассирования через организм лабораторных животных, были получены культуры ревертанты, имеющие признаки характерные для типичных (S-) форм бруцелл. Реверсировавшие культуры состояли из клеток кокковидной формы, по Граму и Козловскому они окрашивались в красный цвет и в антигенном составе несли исключительно S-детерминанты, улавливаемые в диагностических титрах с помощью пластинчатой РА.
Таким образом, при пассировании через организм лабораторных животных, реверсия L-форм бруцелл происходит более интенсивно чем на искусственных питательных средах. При этом удается получить культуры ревертанты от L-форм, находящихся на любой стадии изменчивости.
Однако культуры ревертанты плохо адаптировались к условиям искусственных питательных сред и при длительном культивировании нередко погибали.
Следует также отметить, что при введении в организм морских свинок, культуры-ревертанты были не стабильными и могли переходить обратно в L-форму, что усложняло их идентификацию.
