Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Общие сведения о ящуре 10
1.2. Экономический ущерб при ящуре 12
1.3. Источник инфекции при ящуре 13
1.3.1. Продукты убоя как источник распространения ящура 13
1.3.2. Роль вирусоносительства в эпизоотологии ящура 14
1.3.3. Вирусоносительство у вакцинированных животных 16
1.4. Наличие и сохраняемость вируса ящура в продуктах убоя животных 19
1.4.1. Патоморфологические изменения при ящуре 19
1.4.2. Наличие вируса ящура в продуктах убоя в различные периоды заболевания 22
1.4.3. Сохраняемость вируса ящура в продуктах убоя животных 25
1.5. Обнаружение вируса ящура в продуктах убоя 27
1.5.1. Подготовка проб к исследованиям! 28
1.5.2. Методы лабораторной диагностики ящура 35
1.6. Заключение по обзору литературы 41
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 43
2.1. Материалы и методы 43
2.1.1. Штаммы вируса ящура 43
2.1.2. Лабораторные и сельскохозяйственные животные 43
2.1.3. Клеточные культуры и питательные среды 43
2.1.4. Подготовка материала к исследованию 44
2.1.5. Методы исследования патологического материала 48
2.1.5.1. Полимеразная цепная реакция 48
2.1.5.2. Иммуноферментный анализ 52
а) выявление специфических противоящурных антител 52
б) определение постинфекционных противоящурных антител к неструктурным полипротеинам вируса ящура 53
в) выявление антигена вируса ящура в ИФА 53
2.1.5.3. Реакция микронейтрализации 54
2.1.5.4. Вирусовыделение с последующей идентификацией типовой принадлежности вируса 54
2.1.5.5 Постановка РСК для определения антигенного родства вируса ящура 55
2.1.6. Статистическая обработка данных 56
2.2. Результаты собственных исследований 57
2.2.1. Отбор проб патологического материала и продуктов убоя 57
2.2.2. Подбор оптимального метода вирусовыделения 58
2.2.3. Подготовка проб для осуществления прямой индикации антигена вируса ящура в ИФА 59
2.2.3.1. Изучение эффективности методов очистки тканевой суспензии 59
2.2.3.2. Изучение эффективности методов концентрирования 61
2.2.3. Обнаружение возбудителя в различных тканях и органах с применением ПЦР 63
2.2.4. Сравнительные исследования продуктов убоя до и после их "созревания" ...65
2.2.5. Исследование продуктов убоя после экспериментального заражения животных вирусом ящура типа О №1964/Монголия/2004 68
2.2.5.1. Иммунобиологические исследования эпизоотического штамма типа О №1964/Монголия/2004 69
2.2.5.2. Исследование продуктов убоя в различные сроки после заражения 74
2.2.6. Сравнительная оценка методов обнаружения возбудителя ящура в продуктах убоя 80
2.2.7. Выявление противоящурных антител в органах и тканях вакцинированных и невакцинированных животных после экспериментального заражения 82
2.2.7.1. Обнаружение антител к неструктурным полипротеинам вируса ящура 87
2.2.8. Сравнение показателей обнаружения возбудителя ящура и противоящурных антител 89
2.2.9. Результаты исследования продуктов убоя от зараженных вирусом ящура животных с различным иммунным статусом 90
2.2.10. Индикация возбудителя в продуктах убоя свиней 94
2.2.10.1. Изменение величины рН в процессе созревания мяса свинины 98
2.2.11. Исследование пищеводно-глоточной жидкости на наличие генома вируса ящура, антигена и противоящурных антител 101
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 105
4. ВЫВОДЫ 117
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 119
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 120
ПРИЛОЖЕНИЯ 144-147
- Общие сведения о ящуре
- Подготовка материала к исследованию
- Иммунобиологические исследования эпизоотического штамма типа О №1964/Монголия/2004
Введение к работе
Ящур - это высококонтагиозное вирусное заболевание парнокопытных животных. Для него характерна тенденция к широкому распространению и эпизоотическому течению. Жесткие карантинные меры по ликвидации ящура нарушают нормальную деятельность хозяйств и предприятий, затрагивают общественные, экономические и межгосударственные связи. Эпизоотии ящура не знают географических и климатических границ и наносят огромный экономический ущерб.
Актуальность темы
Успех организационных мер борьбы с ящуром во многом зависит от знания условий выживаемости вируса в продуктах убоя или в патологическом материале павших и вынужденно убитых животных, времени нахождения вируса в крови и тканях животных в различные стадии болезни. Кроме того, немаловажное значение имеет наличие и сохраняемость вируса у вакцинированных животных, контактировавших с больными.
Импортируемые продукты убоя животных, как правило, поступают в реализацию в замороженном состоянии, и если животное было убито в период болезни или вирусоносительства, то вирус ящура может сохраняться в органах и тканях в течение длительного времени и представлять эпизоотическую опасность [26, 82, 86,119,128,162].
С 2000 года в лабораторию ящура и везикулярных болезней для исследования на наличие вируса ящура или его антигена поступило более 1000 проб мясопродуктов (свинины и говядины), импортируемых в Россию в виде полутуш, субпродуктов, мяса на костях, шейки, ребер, мяса в блоках из стран, неблагополучных по ящуру. Одним из экспортеров мяса в Россию является Монголия, с 2000 года неблагополучная по ящуру типа О.
Ранее проблемой индикации вируса ящура в продуктах убоя животных занимался ряд исследователей. В частности, С.А. Цветковой (1972) был предложен метод биопробы на культуре клеток, основным недостатком которого является длительность получения конечного результата. При ретроспективной диагностике Л.Б. Мезвришвили (1988) была использована непрямая реакция иммунофлюоресценции для выявления постинфекционных антител в тканях и органах животных. Кроме того, для проведения индикации антигена вируса ящура в органах и тканях Т.В. Тюриной (1994) был предложен метод флюоресцентных зондов, требующий последующей идентификации инфекционного агента в реакции нейтрализации.
В настоящее время при лабораторной диагностике ящура в объектах ветеринарного надзора наибольшее признание получили такие методы, как быстрая и высокочувствительная полимеразная цепная реакция (ПЦР), иммуноферментный анализ (ИФА), позволяющие проводить прямую индикацию и специфическую идентификацию вирусного агента, реакция микронейтрализации (РМН) [54, 55, 56, 93,195].
Таким образом, изучение эффективности различных методов, позволяющих проводить индикацию и идентификацию возбудителя ящура в продуктах убоя и патологическом материале животных, а также изучение иммунобиологических свойств штаммов, циркулирующих в последнее время в неблагополучных по ящуру странах, остается актуальной и насущной проблемой в диагностике заболевания.
Цели и задачи исследований
Целью нашей работы явилась разработка схемы исследований для прямой индикации возбудителя ящура и противоящурных антител в продуктах убоя и патологическом материале от зараженных ящуром животных методами, которые позволили бы использовать наиболее вероятные с точки зрения обнаружения возбудителя ткани и органы и проводить диагностику в минимальные сроки.
Для выполнения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи: - испытать различные методы очистки и концентрирования суспензии патологического материала для осуществления прямой индикации и специфической идентификации антигена вируса ящура в ИФА после экспериментального заражения животных; изучить возможность обнаружения генома вируса ящура в ПЦР в пробах тканей и органов и сравнить с прямой индикацей антигена в ИФА и вирусовыделением в культуре клеток; провести сравнительные исследования продуктов убоя до и после их созревания; исследовать продукты убоя после заражения животных эпизоотическим штаммом вируса ящура типа О №1964/Монголия/2004 и изучить его свойства; изучить возможность обнаружения противоящурных антител в продуктах убоя с помощью ИФА и РМН; исследовать продукты убоя, полученные от вакцинированных и затем зараженных ящуром животных, которые могут являться вирусоносителями; изучить и сравнить возможность обнаружения вирусного генома прямой индикацией антигена вируса ящура и противоящурных антител в пищеводно-глоточной жидкости (ПГЖ).
Научная новизна
Проведены исследования по обнаружению генома вируса ящура в продуктах убоя с помощью ПЦР.
Разработана схема очистки и концентрирования суспензии патологического материала для прямой индикации антигена вируса ящура.
Осуществлена прямая индикация и специфическая идентификация антигена вируса ящура в тканях животных методом ИФА без предварительной инокуляции чувствительных биосистем.
Проведены сравнительные исследования по обнаружению вирусного генома в ПЦР и антигена в ИФА в продуктах убоя до и после "созревания".
Представлена возможность выявления специфических противоящурных антител в продуктах убоя животных с применением ИФА и РМН.
Изучена возможность обнаружения возбудителя ящура и антител в продуктах убоя после экспериментального заражения вакцинированных животных.
Проведено исследование продуктов убоя в ПЦР, ИФА и РМН на разных стадиях заболевания, после экспериментального заражения животных эпизоотическим штаммом вируса ящура типа О №1964/Монголия/2004, и изучены его иммунобиологические свойства.
Проведена сравнительная оценка возможности обнаружения генома вируса ящура в ПЦР, антигена в ИФА и антител в ИФА и РМН в различных органах и тканях на разных стадиях заболевания после экспериментального заражения.
Установлена возможность обнаружения вирусного генома, прямой индикацией антигена вируса ящура и противоящурных антител в ПГЖ.
Практическая значимость работы
Полученные результаты исследований использованы при подготовке следующих документов: "Методические указания по отбору, консервированию и транспортировке проб патологического материала и продуктов убоя для лабораторной диагностики ящура", утвержденные директором ФГУ "ВНИИЗЖ" 29.09.2005 г.; "Методические указания по исследованию продуктов убоя животных при подозрении на ящур", утвержденные директором ФГУ "ВНИИЗЖ" 02.06.2005 г; штамм вируса ящура типа О №1964/Монголия/2004 депонирован в ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (2004г.). проект "Правил профилактики и ликвидации ящура животных", который находится на рассмотрении в МСХ РФ; - проект "Программы совместных действий государств- участников СНГ по профилактике и борьбе с ящуром в государствах Содружества" (2006- 2008гг.), который находится на рассмотрении в Россельхознадзоре МСХ РФ.
Апробация работы
Материалы диссертации были доложены и опубликованы в сборнике Международной научной конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии животных», посвященной 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2003г.; Международной научной конференции молодых ученых «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных» в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г.Владимир, 2004г.; также докладывались на заседании Межправительственного совета по сотрудничеству в области ветеринарии СНГ (Республика Узбекистан) в 2006г. и на ученых советах ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» в 2001-2005 гг.
Публикация научных работ
По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.
Основные положения, выносимые на защиту: усовершенствованные методы очистки и концентрирования вируссодержащих суспензий из проб патологического материала; способы прямой индикации антигена вируса ящура в продуктах убоя животных; методы исследования продуктов убоя для обнаружения генома вируса ящура; обоснование наиболее вероятных органов и тканей зараженных ящуром животных для обнаружения возбудителя при лабораторной диагностике ящура; иммунобиологические свойства эпизоотического штамма вируса ящура типа О №1964/Монголия/2004; определение противоящурных антител в тканях и органах животных методами ИФА и РМН; исследование пищеводно-глоточной жидкости с применением ПЦР, ИФА и РМН.
Общие сведения о ящуре
Источником инфекции при ящуре являются больные животные и их выделения, а также получаемые от них продукты убоя. Таким же источником являются переболевшие животные—вирусоносители [70, 71, 161]. Оценивая эпизоотологическое значение разных источников инфекции, следует иметь в виду, что животное с клиникой ящура представляет значительно меньшую опасность по сравнению с бессимптомными вирус оносителями. Это объясняется тем, что больные животные по условиям карантина надежно изолируются от факторов передачи инфекции восприимчивым животным и полностью уничтожаются. В то же время невыявленные бессимптомные вирусоносители могут транспортироваться на значительные расстояния и инфицировать восприимчивых животных, корма, а также животноводческую продукцию [36, 213,234].
Эпизоотологический анализ причин возникновения очагов ящура в животноводческих хозяйствах различных стран мира показал немаловажную роль в этом импортируемых животных, мясопродуктов и других объектов ветеринарного надзора.
В июне 1995 года на территории Российской Федерации в Люберецком районе Московской области на свиноферме племзавода "Петровское" был зарегистрирован очаг ящура. В ФГУ «ВНИИЗЖ» выделили изолят вируса ящура типа О и обозначили как штамм О №1685/Московский/1995. Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 штамма О №1685/Московский/1995. Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности показал, что изучаемый штамм принадлежит к китайскому топотипу, группе вирусов Гонконг/1993-1995, циркулирующим в Китае, Гонконге и на Филиппинах. Учитывая эпизоотологические данные и результаты лабораторных исследований, предполагалось, что вирус в племзавод мог быть занесен со свининой из Китая, так как рядом со свинофермой находится мясоперерабатывающее предприятие, на которое из этой страны в конце мая 1995 года поступали замороженные свиные полутуши [26,119,128].
На территории Российской Федерации, в 2000 году в Приморском крае и в 2004 году в Амурской области, зарегестрированы вспышки ящура типа О. При расследовании причин возникновения заболевания региональными представителями ветеринарной службы было определено, что наиболее вероятная причина заноса возбудителя - поступление мясных продуктов из неблагополучного (или ранее неблагополучного) пункта на территории Китая [86].
В марте 2005 года, в Гонконге, в провинции Чеунг Чуй, на мясокомбинате, в зоне предубойного содержания зарегестрировано заболевание крупного рогатого скота ящуром. При проведении диагностических исследований был выявлен вирус ящура типа Азия-1, наряду с этим также выяснилось, что в Гонконге серотип Азия-1 ранее не регистрировался [162].
Таким образом, анализ эпизоотической ситуации по ящуру за последние годы еще раз подтверждает опасность для благополучных стран продуктов и сырья животного происхождения, поступающих из неблагополучных по ящуру государств (регионов) [128].
Ряд авторов отмечают [11, 16 ,17], что занос возбудителя может произойти как вирусоносителями или полученными от них животноводческими продуктами, так и контаминированными их выделениями материалами и предметами. В последнем случае имеет место пассивная (контактная) передача вируса [210]. Из-за высокой контагиозности вируса инфекция может легко распространиться при минимальных количествах возбудителя [90].
Наиболее часто вспышки заболевания отмечали при введении и смешивании в стаде здоровых и переболевших животных. Так, по данным американской комиссии, изучавшей эпизоотологию ящура в Щвейцарии, с 1919 по 1923 гг. в результате ввода в благополучные стада вирусоносителей возникло 408 очагов [11, 81].
С.И.Джупина и А.А.Свиридов сообщили, что в 1962 г. в Новосибирской области из 24 неблагополучных по ящуру пунктов 22 возникли по той же причине [30]. Аналогичное наблюдение было сделано после ввода в благополучные стада животных - реконвалесцентов через 4-6 месяцев после их выздоровления [85].
Подготовка материала к исследованию
У крупного рогатого скота и свиней после убоя отбирали слизистые оболочки глотки и пищевода (pharynx), слизистые оболочки языка, поверхностные шейные (Inn. cervicales superficiales), надколенные (Inn. subiliaci), подколенные (Inn. poplitei), портальные (Inn. portae), заглоточные (Inn. retropharyngei laterales) лимфоузлы (рисунок 2), мышцы спины (m. longissimus dorsi) и бедра (m. biceps femoris), костный мозг (medulla ossium flava), подкожный жир (tela subcutanea), надпочечники (gl. suprarenalis), поджелудочную железу (pancreas), легкие (pulmones), миндалины (Inn. retropharyngei mediales). У КРС также отбирали подчелюстные лимфоузлы (Inn. mandibulares)n кровь.
Отбор проб патматериала производили совместно с профессором ФГУ «ВНИИЗЖ» A.M. Рахмановым.
Пищеводно-глоточную жидкость (ПГЖ) отбирали через 1, 5 и 8 суток после заражения животных.
Продукты убоя отбирали через 1, 4, 5 и 8 суток после экспериментального заражения при убое вакцинированных и невакцинированных животных.
Часть проб оставляли при температуре 2-4С в течение 24 часов для созревания мяса, затем замораживали при минус 20С [82]. Оставшиеся пробы были заморожены при минус 20С в течение 1 часа после убоя.
Отбор проб ПГЖ у крупного рогатого скота производили с помощью пищеводно-глоточного зонда. Для этого животных выдерживали на 10 - 12 -часовой голодной диете. В отобранных пробах недопускали присутствия крови и пищевых масс.
Пищеводно-глоточную жидкость хранили в смеси из 0,08 М фосфатного буфера, содержащего 0,01% фетальной сыворотки КРС, 0,002% фенолрота и антибиотики (1000 Ед/мл бензилпенициллина натриевая соль, 100 Ед/мл неомицина сульфат, 50 Ед/мл полимиксина М сульфат), при рН 7,6, в замороженном состоянии при температуре минус 70С [194].
Образцы сыворотки крови без признаков гемолиза и без бактериальной контаминации замораживали в герметичных флаконах при температуре минус 20С до исследования.
Материал для исследований готовили в условиях, исключающих возможность контаминации вирусом ящура из других источников, либо его рассеивания в окружающую внешнюю среду.
Патологический материал измельчали, готовили 10% и 33% суспензию на STE-буфере и экстрагировали в течение 40 минут при 4С. Суспензию замораживали при минус 20С, затем оттаивали. После разморозки отбирали 0,5 см3 10% суспензии для исследований в ПЦР.
Для очистки испытуемый материал подвергали физико-химической обработке. Клеточный детрит и измельченную ткань удаляли путем осаждения при 2500 g при 4С в течение 15 минут. Надосадочную жидкость обрабатывали двумя способами: 1) путем добавления фреона-113 в количестве 20% от общего объема и 2) хлороформа - 8% от общего объема. Суспензию гомогенизировали при температуре 4С в течение 5-6 минут и центрифугировали при 2500 g, при 4С в течение 15 минут. Обработку фреоном-113 проводили двукратно. Пищеводно-глоточную жидкость обрабатывали однократно, добавляя фреон-113 в количестве 50% от общего объема [200]. Полученную надосадочную жидкость использовали для исследования.
Обработанную 10% суспензию концентрировали ультрафильтрацией, ПЭГ М-6000 и осаждением ПЭГ М-6000 на ткань Петрянова.
При концентрировании ПЭГ к вируссодержащей суспензии добавляли ПЭГ (8% от общего объема) с экспозицией 14 часов при температуре 4С. Затем смесь центрифугировали при 7000 g в течение 30 минут, при 4С. Осадок ресуспендировали в STE-буфере в объеме, в 100 раз меньшем, и обрабатывали фреоном-113.
Иммунобиологические исследования эпизоотического штамма типа О №1964/Монголия/2004
В феврале 2004 года в Монголии (Восточно-Гобийский аймак) была зарегистрирована вспышка, вызванная вирусом ящура типа О, которую не удалось ликвидировать в первичном очаге, несмотря на энергичные ветеринарно-санитарные мероприятия.
Это было обусловлено недостаточной эффективностью вакцин, применяемых в отношении эпизоотического вируса, вызывающего прорывы иммунитета даже у многократно вакцинированных животных. Поэтому назрела необходимость подготовить новый производственный штамм вновь выделенного вируса ящура типа О для успешной специфической профилактики сельскохозяйственных животных. В связи с этим актуальность изучения иммунобиологических свойств указанного штамма очевидна.
Для решения поставленной задачи из афтозного материала, полученного на территории Монголии от больного крупного рогатого скота, были приготовлены 33% и 10%-е суспензии, которые были исследованы в РСК, ИФА и ПЦР с последующим нуклеотидным секвенированием. Культуральные суспензии вируса также были исследованы на комплементсвязываюшую (КС) активность и специфичность в РСК. Результаты типизации изолята из Монголии в РСК представлены в таблице 7.
Анализируя данные таблицы 7, следует отметить, что выделенный изолят №1964 относится к вирусу ящура типа О.
Для изучения адаптационных свойств изолята и получения гипериммунной сыворотки на морских свинках были заражены первичные и перевиваемые линии культур клеток СП, ПСГК-30, IBRS-2 и сделано три последовательных пассажа. Результаты этих исследований представлены ниже в таблице 8.
Данные, приведенные в таблице 8, свидетельствуют о хорошей адаптационной активности вируса ящура типа О штамма №1964/Монголия/2004 к использованным клеточным культурам.
