Содержание к диссертации
Введение
2.Обзор литературы 10
2.1. Вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней 10
2.1.1. Классификация вируса РРСС 10
2.1.2.0рганизация генома вируса РРСС, структурные и неструктурные белки 11
2.1.3.Вариабельность вируса РРСС 14
2.2. Особенн Классификация вируса РРСС сти иммунитета при РРСС 18
2.2.1.Клеточный иммунитет 18
2.2.2.Гуморальный иммунитет 19
2.3. Диагностика заболевания РРСС 23
2.3.1.Обнаружение антигена вируса РРСС 24
2.3.2. Обнаружение антител, специфичных к вирусу РРСС 25
2.4. Критерии для стандартизации методов исследования в применении к диагностическим тестам по обнаружению антител 28
2.5. Заключение по обзору литературы 31
3. Собственные исследования 33
3.1.Матери алы 33
3.1.1.Вирус и вируссодержащие материалы 33
3.1.2.Культуры клеток 33
3.1.3. Рекомбинантный антиген вируса РРСС 34
3.1.4.Сыворотки 34
3.1.5.Моноклональные антитела 34
3.1.6.Растворы и реактивы, использованные в работе 35
3.1.7.0борудование 37
3.2.Методы исследования 37
3.2.1. Иммуноферментный анализ 37
3.2.2. Прямой сэндвич-вариант ИФА 37
3.2.3. Прямой блокирующий вариант ИФА 38
3.2.4. Непрямой вариант ИФА 39
3.2.5.Статистический анализ полученных результатов 39
4.Результаты собственных исследований 40
4.1.Определение активности рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rNC) на основе прямого сэндвич-варианта ИФА 40
4.2 Оптимизация условий постановки прямого блокирующего варианта ИФА для выявления антител к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней 44
4.3.Разработка тест-системы на основе непрямого варианта ИФА с использованием рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rNC) для выявления антител к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней 48
4.4.0птимизация условий постановки непрямого варианта ИФА с использованием рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rNC) для определения антител к вирусу РРСС в одном разведении сыворотки крови 55
4.5.Сравнение результатов тестирования сывороток крови, полученных в Н-ИФА с результатами, полученными с применением IDEXX-ИФА и HIPRA-ИФА 62
4.6. Применение тест-системы на основе непрямого варианта ИФА с использованием рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rNC) для исследования сывороток крови от инфицированных или вакцинированных животных 66
4.7.Применение разработанной тест-системы на основе непрямого варианта ИФА с использованием рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rNC) для ретроспективной диагностики РРСС
5.Обсуждение результатов исследования 81
6.Выводы 92
7.Практические предложения 93
8.Список использованной литературы
- Классификация вируса РРСС
- Рекомбинантный антиген вируса РРСС
- Оптимизация условий постановки прямого блокирующего варианта ИФА для выявления антител к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней
- Применение тест-системы на основе непрямого варианта ИФА с использованием рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rNC) для исследования сывороток крови от инфицированных или вакцинированных животных
Введение к работе
Актуальность темы. Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС) -вирусное заболевание, которое характеризуется главным образом серьезными расстройствами функции репродуктивной системы у свиноматок и поражением органов дыхания у поросят (Dea S.,1999).
В качестве этиологического агента заболевания идентифицирован вирус, который классифицирован как представитель семейства Arteriviridae (Cavananqh D.,1997). Проведение молекулярно-биологических исследований вируса РРСС показало, что он представлен двумя генетически различными группами: североамериканской и западноевропейской (Katz J.B., 1995).
Репродуктивно-респираторный синдром свиней впервые был установлен в США в 1987 году (Keffaber К.К.,1989), а затем в Европе в 1990 году (Wensvoort G.,1991). С тех пор данное заболевание регистрировалось в большинстве стран мира (Benfield DA,1992; Blaha Т.,2000; СА Кукушкин,2003). По приблизительным оценкам, в США и Европе инфицировано свинопоголовье 50% ферм. Свиноводческим хозяйствам это заболевание приносит большой ущерб, потери продукции достигают 20% (Christianson W.T.,1994).
В связи с этим остаются актуальными проблемы своевременной диагностики заболевания РРСС. Быстрая постановка диагноза в случае возникновения болезни обеспечивает проведение в сжатые сроки соответствующих мероприятий по ликвидации и предотвращению дальнейшего распространения инфекции.
Диагноз на заболевание РРСС ставят на основании комплекса показателей с использованием эпизоотологических, клинических, патологоанатомических и лабораторных методов. Диагностическое значение этих методов различно и зависит от характера течения болезни. При этом клинический диагноз необходимо подтвердить лабораторными методами, так как заболевание имеет широкий спектр проявлений и обычно осложняется различными секундарными инфекциями.
Существующие методы лабораторной диагностики, такие как непрямая реакция иммунофлуоресценции (НРИФ), реакция нейтрализации (РН), иммуноферментный анализ (ИФА), реакция пассивной гемаггаютинации (РПЕА) (Abina Е.,1992; Clio HJ.,1997; Dea S.,2000), используются в практике, однако у
каждого из этих_ методов есть свои недост[вд-Ии.гшвдым.[<и.ш х является
БИБЛИОТЕКА
СПете
« О»
стет
2 необходимость использования нативного вирусного антигена. Получение вируса РРСС связано с определенными трудностями из-за малого его накопления в культуральных системах и в силу своих биологических особенностей он разрушается при очистке. В связи с этим представляется актуальным и целесообразным использовать в реакциях в качестве стандартного антигена рекомбинантный белок, к преимуществам которого относится безвредность, стабильность, известный химический состав, отсутствие посторонних белков и нуклеиновых кислот.
Для использования в ИФА самым подходящим рекомбинантным белком является нуклеокапсидный протеин (rNC), так как, во-первых, наибольшее количество вырабатываемых антител в организме при заражении вирусом РРСС образуется на нуклеокапсидный белок (Dea S.,2000). Во-вторых, нуклеокапсидный белок имеет общие эпитопы для антител, полученных на штаммы вируса РРСС как европейской, так и американской геногрупп (Morrison R.B., 1992; Dea S., 1999). И, в-третьих, исследования ряда авторов показали перспективность использования иммуноферментных тест-систем на основе этого рекомбинантного белка для диагностики РРСС (Denac Н., 1997; Dea S.,2000). С учетом всего этого, разработка метода диагностики заболевания с использованием рекомбинантного нуклеокапсидного белка вируса РРСС является актуальной задачей для практической ветеринарии.
Цели и задачи исследования. Основная цель наших исследований заключалась в разработке непрямого варианта иммуноферментного анализа с использованием в качестве антигена рекомбинантного белка (rNC) для выявления антител к вирусу РРСС.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
разработать тест-систему для оценки активности рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rNC) на основе прямого сэндвич-варианта ИФА;
оптимизировать условия постановки прямого блокирующего варианта ИФА для выявления антител к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней;
разработать тест-систему на основе непрямого варианта ИФА для выявления антител к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней с использованием
рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rNC) методом последовательных разведений и оптимизировать условия постановки реакции для выявления антител методом одного разведения;
- определить коэффициент корреляции, чувствительность и специфичность разработанной тест-системы на основе непрямого варианта ИФА с использованием рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rNC) по сравнению с результатами ИФА наборов фирмы IDEXX (США) и фирмы HIPRA (Испания);
- применить разработанную тест-систему на основе непрямого варианта ИФА с использованием рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rNC) для исследования сывороток крови на наличие антител к вирусу РРСС после заражения или иммунизации животных разными вакцинами.
Научная новизна исследований. Впервые в России разработана тест-система на основе непрямого варианта ИФА с применением рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rNC) для обнаружения антител к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней.
Предложена тест-система на основе прямого сэндвич-варианта ИФА для оценки активности рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rNC) и выявления антигена вируса РРСС.
Оптимизирован блокирующий вариант ИФА для выявления антител к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней.
Показана корреляция между результатами выявления антител с помощью тест-системы на основе непрямого варианта ИФА с применением рекомбинантного белка rNC и коммерческих наборов ИФА фирмы ШЕХХ (США) и фирмы HIPRA (Испания).
Проведен анализ данных, полученных при иммунологическом мониторинге свинопоголовья на наличие антител к вирусу РРСС с использованием разработанной тест-системы ИФА на основе рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rNC).
Практическая значимость исследований. На основании проведенных исследований разработаны иммуноферментные тест-системы для обнаружения антигена или антител к вирусу РРСС.
Полученные результаты использованы при подготовке следующих методик, которые комиссионно испытаны, одобрены ученым советом и утверждены директором института:
«Методика выявления и титрования антигена вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней в прямом сэндвич варианте ИФА» (утверждена
5.11.2000г.);
«Методика выявления антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней в прямом блокирующем варианте иммуноферментного анализа» (утверждена 5.11.2000г.);
«Методика выявления антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней в непрямом варианте иммуноферментного анализа с использованием в качестве антигена рекомбинантного нуклеокапсидного протеина (rNC)» (утверждена 5.11.2000г.);
«Методические рекомендации по выделению вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) с использованием альвеолярных макрофагов свиней» (утверждены 5.11.2000г.);
«Методика выявления антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней по одному разведению в непрямом варианте иммуноферментного анализа с использованием рекомбинантного нуклеокапсидного протеина (rNC)» (утверждена 5.12.2001г.).
Публикации научных исследований. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научной конференции «Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику» (Владимир,2000г.), на заседаниях ученого совета ВНИИЗЖ в 1997-2002гг.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 123 страницах, иллюстрирована 19 таблицами и 13 рисунками. Список используемой литературы включает 139 источников, из которых 121 иностранных
Классификация вируса РРСС
РНК-зависимая РНК полимераза кодируется ОРС 1а и 1Ь, которые составляют 80% генома. Также ОРС 1а и 1Ь кодируют полилротеины, участвующие в процессе образования малых белковых продуктов, обозначенных как неструктурные протеины (85). Вирус РРСС характеризуется наличием следующих структурных белков: - нуклеокапсидный белок (N) с молекулярной массой 15 kDa, кодируемый ОРС 7; -мембранный белок (М) с молекулярной массой 18 kDa, кодируемый ОРС 6; - N-гликозилированный белок (GP5) с молекулярной массой 25 kDa, кодируемый ОРС 5; - N-гликозилированный белок (GP4) с молекулярной массой 31-35 kDa, кодируемый ОРС 4; - N-гликозилированный белок (GP3) с молекулярной массой 45-50 kDa, кодируемый ОРС 3; - N-гликозилированный белок (GP2) с молекулярной массой 29-30 kDa, кодируемый ОРС 2 (88,90).
Основным белком вируса РРСС является нуклеокапсидный белок. Он в больших количествах экспрессируется в инфицированных клетках и составляет около 20-40% белкового объема вириона (73,85,89). Белковые продукты ОРС 7 европейских и американского генотипов вируса отличаются не только по структуре, но и по молекулярной массе, что обусловлено различным количеством аминокислотных остатков (98).
Основываясь на иммунореактивности делеционного мутанта N протеина с панелью N-специфичных моноклональных антител, идентифицированы пять антигенных регионов в структуре N белка референтного североамериканского штамма. Три из них локализованы в районе 30-52, 69-123, 37-52 аминокислотных остатков. Другие моноклональные антитела обнаруживают общие конформационные антигенные сайты, локализованные в центральной области N протеина (аминокислоты с 52 по 69) (85,91,111,128,131). Область с 37 по 52 аминокислоту является консервативной среди изолятов, циркулирующих на территории обоих континентов, и имеет эпитопы, которые позволяют детектировать их с помощью одних и тех же моноклональных антител (41). Нуклеокапсидный белок европейского референтного штамма содержит четыре антигенных региона (сайты A,B,C,D). Эпитопы А, В и С - линейные, тогда как эпитоп D -конформационный. Сайты А и В содержат эпитопы, специфичные для европейских изолятов, сайт С содержит эпитоп, характерный для обоих генотипов, и сайт D представляет эпитоп, специфичность которого может варьировать у изолятов из различных геногрупп (42,91). Большинство антител, вырабатывающихся в организме животных в процессе инфекции вирусом РРСС, специфичны для N протеина. Следовательно, нуклеокапсидный протеин (N) является наиболее подходящим кандидатом для выявления вирусспецифичных антител в сыворотках крови свиней (44,68,97,111,132). N-специфичные моноклональные антитела, взаимодействуя с вирусом РРСС, не демонстрируют нейтрализующей активности.
Негликозилированный М протеин является наиболее консервативным структурным протеином вируса РРСС. Его структура похожа на коронавирусныи М протеин (85). Аналогично М протеину коронавируса, М протеин вируса РРСС предположительно играет важную роль в сборке вируса (42).
Оболочечный и мембранный протеины представляют поверхностные структуры вириона, существенные для взаимодействия «вирус-хозяин» (54).
ОРС 5 вируса РРСС кодирует оболочечный гликопротеин GP5 (73,74,87). Протеин GP5 вируса РРСС образует дисульфидно-связанные гетеродимеры с М протеином, поэтому моноспецифичные сыворотки, полученные на протеин GP5 и протеин М, преципитируют оба белка (48,73). Моноклональные антитела, которые узнают протеин GP5 вируса РРСС, обладают нейтрализующей активностью. По крайней мере, два нейтрализующих эпитопа ассоциированы с GP5 продуктом вируса РРСС. Всего выявлено 6 регионов, которые потенциально могут являться антигенными сайтами (17). Предполагается, что белок GP5 вируса РРСС может играть важную роль в инфекционности вируса. Однако, участие его в прикреплении к рецепторам клеток и/или в проникновении вируса в цитоплазму клеток-мишеней еще не доказано.
Белки GP4 и GP2 вируса РРСС идентифицированы как составные части вирусной частицы и являются типичными протеинами мембраны класса 1 (88,122,123). При инфицировании животных вирусом РРСС, установлена причастность протеина GP4 к индуцированию нейтрализующих антител (42),
Первоначально, белок GP3 обнаружили в структуре европейского изолята вируса РРСС, а затем подтвердили наличие этого протеина у некоторых североамериканских изолятов (123). Роль этого протеина в жизненном цикле артеривирусов остается неизвестной. Данный белок существует в двух формах: растворимой и нерастворимой. Доказана структурная природа белка GP3 вируса РРСС штамма «Lelystad» (42). В случае североамериканских изолятов таких доказательств не существует. Недавние отчеты показывают, что продукт ОРС 3 обладает ярко выраженными антигенными свойствами (72).
Анализ результатов секвенирования различных штаммов вируса РРСС показал, что он имеет сходную организацию с другими артеривирусами (104,115). Предполагается, что вирус РРСС является дальним родственником коронавирусов и торовирусов (90,104).
Хотя заболевание, вызванное вирусом РРСС, появилось в Европе и Северной Америке приблизительно в одно и тоже время, тем не менее выделенный вирус продемонстрировал неожиданно высокую степень структурных различий между европейскими и североамериканскими изолятами. Для определения количества генетических вариаций и понимания молекулярных механизмов вирусной эволюции была определена нуклеотидная последовательность ряда штаммов. В результате пришли к выводу, что европейские и американские изоляты представляют собой генетически отдаленные группы одного вируса (60,96). Такие же выводы сделали и другие исследователи данного вопроса (80,85,120). Причем C.J. Nelsen с соавторами и Plagemann P.G. считают, что одновременное появление заболевания свиней вирусом РРСС на двух континентах не является результатом недавней рекомбинации, поскольку геномные и биохимические различия были бы менее значительны (98,105). По мнению Кариг V. с соавторами (60) существенные различия в структуре ОРС приводят к предположению, что вирус вовлечен в процесс, отличный от простого аккумулирования случайных нейтральных мутаций, хотя анализ и демонстрирует структурную стабильность продуктов различных ОРС. В совокупности эти данные указывают, что, несмотря на явление внутригенной рекомбинации, селективный процесс содействует сохранению первичной структуры индивидуальных ОРС.
В рамках одной из наиболее распространенных гипотез происхождения два генотипа вируса РРСС развивались от одного вирусного предка (возможно от LDV-подобного) на разных континентах независимо друг от друга (10,105).
Meng X.J. с соавторами после проведенного филогенетического анализа ОРС 2-7 пришли к выводу, что внутри американской геногруппы существует по меньшей мере три минорных генотипа и низковирулентные изоляты образуют отдельную ветвь, удаленную от других американских изолятов{81).
Рекомбинантный антиген вируса РРСС
Следующим этапом работы было сравнение результатов, полученных с помощью блокирующего варианта ИФА с результатами, полученными с помощью IDEXX-ИФА при тестировании сывороток крови животных различных групп, подозреваемых в заболевании РРСС и вакцинированных против РРСС вакцинами производства ВНИИЗЖ. Для этого тестировали 71 сыворотку крови свиней в обоих вариантах ИФА и рассчитали чувствительность и специфичность блокирующего варианта ИФА относительно IDEXX-ИФА. Результаты представлены в таблице 5.
Подставив, данные из таблицы 5 в формулы для вычисления чувствительности и специфичности получили, что чувствительность блокирующего варианта ИФА составила 95,3%, а специфичность - 96,4%.
Таким образом, оптимизированный прямой блокирующий вариант ИФА для выявления антител к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней обладал высокой чувствительностью и специфичностью.
На основании проведенных исследований была предложена «Методика для выявления антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней в блокирующем варианте иммуноферментного анализа» {см. приложение №3).
Однако данная тест-система имела ряд недостатков. Одним из них было использование культурального вируса РРСС, который плохо накапливался в культуре клеток. С другой стороны мы были ограничены в количестве моноклональных антител, полученных в рамках совместной работы с Институтом зоопрофилактики (г. Брешия, Италия). Поэтому нам необходим был тест, который был бы лишен подобных недостатков. Для этой цели была разработана тест-система на основе непрямого варианта ИФА с использованием рекомбинантного белка rNC.
Разработка тест-системы на основе непрямого варианта ИФА с использованием рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rNC) для выявления антител к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней
В связи с тем, что в качестве антигена был использован новый препарат с неизвестными нам свойствами, необходимо было при разработке тест-системы на основе непрямого варианта ИФА с использованием рекомбинантного белка провести ряд исследований. Во-первых, определить условия адсорбции антигена на планшет, которые включали в себя определение концентрации рекомбинантного белка, времени сенсибилизации и состава сенсибилизирующего буфера, условия отмывания не связавшихся компонентов, подбора блокирующего буфера. Во-вторых, определить режим инкубации сывороток.
Исходную концентрацию белка определяли методом Бредфорда, а активность антигена - с помощью тест-системы на основе прямого сэндвич-варианта ИФА, как было описано выше. С помощью этих методов было установлено, что средняя концентрация наносимого антигена на планшет должна быть от 2.0 мкг/мл до 5.0 мкг/мл. Эта концентрация антигена соответствует диапазону оптических плотностей от 1.1 до 2.5 единиц (при определении с помощью моноклональных антител 4D5) или от 0.3 до 0.85 оптических единиц в непрямом варианте ИФА при титровании антигена с помощью референтной положительной сыворотки в непрямом варианте ИФА (рисунок 3).
Для определения оптимального режима адсорбции рекомбинантного нуклеокапсидного белка rNC на планшет были испытаны следующие буферные растворы: 0.05М кар бон атно-б и карбонатный буфер (рН 9.6-9.7) (КББ), 0.05М карбонатный буфер (рН 11.3-11.5) (КБ), 0.02М фосфатный буфер (рН 7.4-7.6) (ФБР) и 0.02М К-фосфатный буфер (рН 5.0-5.3).
Рекомбинантный белок rNC разводили в сравниваемых буферах, начиная с разведения 1:5 с двукратным шагом, вносили в лунки планшета и выдерживали при различном температурно-временном режиме {в течение 0.5, 1, 2, 3 часов при температуре 37±1С; в течение 2, 16-18, 24 часов при температуре 4-8С и 20-25С). Затем вносили положительную и отрицательную контрольные сыворотки в разведении 1:40, инкубировали в течение 1 часа, несвязавшиеся компоненты реакции отмывали промывочным буфером и затем в рабочем разведении вносили конъюгат антивидовых антител, инкубировали в течение часа и повторяли этап отмывания не связавшихся компонентов реакции. Для выявления реакции использовали пероксидазный субстрат АБТС. По титру антител положительной контрольной сыворотки судили о пригодности применяемых буферных систем. Полученные результаты суммированы в таблице
Как видно из таблицы 6, наибольший титр нуклеокапсидного белка (1:320) получили, используя карбонатно-бикарбонатный буфер при инкубации в течение 16-18 часов при температуре 4-8С. При необходимости можно использовать инкубацию планшетов при температуре 37С в течение 2 часов.
Затем нами было проверено влияние на активность рекомбинантного белка rNC процесса отмывания лунок планшета от несвязавшихся компонентов. Отмывание десорбированного (избыточного) антигена проводили 3-кратно промывочным буфером, затем лунки планшета осушали. Результаты реакции учитывали по титру положительной сыворотки и отсутствию неспецифической реакции отрицательных сывороток крови. Результаты представлены в таблице 7.
Оптимизация условий постановки прямого блокирующего варианта ИФА для выявления антител к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней
В результате проведенных исследований показано, что аналитическая чувствительность разработанной тест-системы на основе непрямого варианта ИФА при исследовании сывороток крови животных, зараженных вирусом РРСС, относящегося к американскому генотипу, зависела от используемого антигена. При использовании гетерогенного антигена антитела к вирусу РРСС штамма «БД» в сыворотке крови свиней выявляли позже, чем при использовании рекомбинантного антигена той же геногруппы.
Целью третьего опыта было изучение напряженности поствакцинального иммунитета после введения животным сухой культуральной вирусвакцины и эмульсионной инактивированной вакцины, а также колострального иммунитета у поросят, полученных от вакцинированных свиноматок и сравнение результатов Н-ИФА, с результатами ЮЕХХ-ИФА. В опыт были взяты 4 супоросные свиноматки крупной белой породы в возрасте 1.5-2 года. Животных разделили на 2 группы. Свиноматок первой группы иммунизировали сухой культуральной вирусвакциной против РРСС штамма «БД», изготовленной во ВНИИЗЖ, в соответствии с наставлением по применению вакцины в объеме 2,0 мл на голову с титром 4.0 Ід ТЦД5о/мл. Свиноматок второй группы иммунизировали эмульсионной инактивированной вакциной против РРСС штамма «БД», изготовленной во ВНИИЗЖ в объеме 2.0 мл на голову с исходным титром вируса до инактивации 6.5 !д ТЦЦ5о/ші. Спустя 42 дня после иммунизации свиноматок второй группы заразили интраназально в объеме 20 мл на голову вирусом РРСС штамма «Lelystad» с титром вируса 5.5 Ід ТЦД50/МЛ. Время заражения совпало с 93 и 90 днем супоросности свиноматок, соответственно.
Сыворотку крови от свиноматок исследовали на 21, 35 дни после иммунизации и после опороса в Н-ИФА и ЮЕХХ-ИФА. У поросят кровь брали в первый день после рождения до дачи первой порции молозива и затем с интервалом в 7 дней - до конца периода наблюдения, который составил 53 дня. Динамика образования антител у свиноматок показана на рисунках 7,
Тестирование сывороток крови свиноматок в Н-ИФА и ЮЕХХ-ИФА, показало, что уровень антител у свиноматок первой группы к 121 ДПИ, т.е. через 1 неделю после опороса, снижался, тогда, как у свиноматок второй группы уровень антител повышался и начинал снижаться только к 149 дню. При исследовании уровня антител у свиноматок второй группы в непрямом варианте ИФА получили сопоставимые с ЮЕХХ-ИФА результаты. Определяли уровень антител, и после иммунизации, и после заражения вирусом РРСС штамма «Leiystad». При тестировании сывороток крови от свиноматок первой группы в непрямом варианте ИФА антитела обнаруживали только до 35 ДПИ, на 121 день в Н-ИФА были получены отрицательные результаты, тогда как при анализе в IDEXX-ИФА в эти сроки исследуемые сыворотки были положительными. Такие же результаты получили при исследовании сывороток крови от поросят, рожденных этими свиноматками, т.е. при исследовании сывороток крови в непрямом варианте ИФА результаты были отрицательными, а при исследовании в ЮЕХХ-ИФА - положительными. При исследовании сывороток от поросят, рожденных свиноматками второй группы, получили результаты, которые представлены на рисунках 9, 10. У поросят от свиноматки №4, иммунизированной инактивированной вакциной, а затем инфицированной вирусом РРСС штамма «Lelystad», выявляли антитела в сыворотке крови до 49 дня после рождения, тогда как у поросят, полученных от свиноматки №3 этой же группы, антитела обнаруживали до 21 дня и не регистрировали на 28 день после рождения. Результаты, полученные в реакциях Н-ИФА и ЮЕХХ-ИФА, были аналогичными.
В этом опыте наглядно показана разница в иммуногенности живой и инактивированной вакцин (рисунок 7,8). Для сравнения мы выбрали значения S/P на 21 и 35 дни после введения вируса, так как свиноматок, вакцинированных инактивированной вакциной против РРСС штамма «БД», изготовленной во ВНИИЗЖ на 42 день заразили вирусом РРСС штамма «Lelystad». После вакцинации свиноматок инактивированной вакциной исследование сывороток крови на 21 день показало сомнительные результаты в обеих реакциях (Н-ИФА и ЮЕХХ-ИФА), соответственно 0.25±0.02 и 0.34+0.08 (значение S/P отношения), на 35 день эти показатели стали положительными - значение S/P отношения 0.3±0.05 и 0.66+0.07, соответственно.
При вакцинации свиноматок живой вакциной против вируса РРСС штамма «БД» того же изготовителя, значение S/P отношения на 21 ДПИ было 0.25+0.05 и 1.13+0.2, на 35 день - 0.65±0.07 и 1.74+0.3. Особенно показательна разница в эффективности вакцин на 21 ДПИ в реакции IDEXX-ИФА. В этот срок при вакцинации живой вакциной уровень антител был выше в 3.3 раза уровня антител, обнаруженного после вакцинации инактивированной вакциной, на 35 день после введения вируса это значение соответствовало 2.6, а при использовании результатов разработанной тест-системы этот показатель был равен 2.2.
По результатам третьего опыта можно сделать заключение, что разработанная тест-система уступает по чувствительности IDEXX-ИФА при исследовании сывороток крови от свиней первой группы и их поросят и не уступает таковой в чувствительности при исследовании сывороток крови от свиноматок второй группы и их поросят. Кроме того, у поросят, рожденных от свиноматок, вакцинированных эмульсионной инактивированной вакциной против РРСС и зараженных на 42 день вирусом РРСС штамма «Lelystad», антитела к вирусу РРСС выявляли на 7 день после рождения и позже, как в IDEXX-ИФА, так и в Н-ИФА. Разработанный непрямой вариант ИФА с использованием в качестве антигена рекомбинантного нуклеокапсидного белка позволяет выявлять антитела к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней после введения живой и инактивированной вакцины не ранее 21 дня.
По результатам всех опытов можно сделать заключение о возможности передачи вируса РРСС незараженным животным при совместном содержании с инфицированными. Сроки выявления антител к вирусу РРСС в сыворотках крови животных с помощью Н-ИФА зависели от принадлежности вируса к той или иной геногруппе.
Применение разработанной тест-системы на основе непрямого варианта ИФА с использованием рекомбинатного нуклеокапсидного белка (rNC) для ретроспективной диагностики РРСС
Разработанный непрямой вариант ИФА на основе рекомбинантного белка rNC использовали для исследования сывороток крови, полученных непосредственно из хозяйств, т.к. основной задачей нашей работы было создание теста для ретроспективной диагностики заболевания.
С помощью разработанного варианта ИФА и ЮЕХХ-ИФА мы исследовали 205 сывороток крови свиней из 23 хозяйств, Хозяйства разделили на 3 группы. Первую группу составили благополучные по РРСС хозяйства, в которых не проводят вакцинацию поголовья свиней против РРСС (91 проба). Во вторую группу входят благополучные по РРСС хозяйства, в которых осуществляют профилактическую вакцинацию свиней против данного заболевания (53 пробы); в третью группу -неблагополучные по РРСС хозяйства (61 проба).
Применение тест-системы на основе непрямого варианта ИФА с использованием рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rNC) для исследования сывороток крови от инфицированных или вакцинированных животных
Мы учли результаты этих опытов и в последующем был получен рекомбинантный белок rNC на основе вируса РРСС, относящегося к американской геногруппе. При использовании этого белка в качестве антигена для непрямого варианта ИФА наличие антител к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней второго опыта выявлено на 14 день после введения вируса с титром 1:20 и выше как у иммунизированных животных, так и находящихся с ними в контакте.
Третий опыт подтверждает результаты предыдущих опытов о разной чувствительности теста к гомологичным и гетерологичным сывороткам, и показывает, что пассивный иммунитет у поросят может длиться от 30 дней до 2-х месяцев, что подтверждает ранее опубликованные данные (7,58,118). Кроме того, показана более высокая степень иммуногенности живой вакцины против РРСС по сравнению с инактивированной (S/P отношение на 21 день в 3,3 раза выше после вакцинации живой вакциной по сравнению с S/P отношением после вакцинации инактивированной вакциной и в 2,6 раза выше на 35 день, а при использовании результатов разработанной тест-системы этот показатель составил 2.2).
Разрабатываемая нами тест-система на основе непрямого варианта ИФА создавалась для практического применения в лабораторной диагностике заболевания, поэтому необходимо было проверить эффективность работы ее по выявлению антител к вирусу РРСС в сыворотках крови -животных, полученных из различных свиноводческих хозяйств.
С помощью разработанного теста протестировали 205 сывороток крови свиней из хозяйств, благополучных и неблагополучных по РРСС и сравнили эти результаты с результатами, полученными с помощью IDEXX-ИФА. Были получены сопоставимые результаты, что подтверждает высокую чувствительность и специфичность разработанного непрямого варианта ИФА относительно IDEXX-ИФА. Вычисленные значения чувствительности и специфичности по трем группам (группа вакцинированных против РРСС клинически здоровых животных, группа подозреваемых в заболевании РРСС и группа не вакцинированных против РРСС) представляют собой значения одного порядка, т.е. с уверенностью превышающей 95% можно говорить о не существенности различий по этим данным. Однако, значение чувствительности разработанной тест-системы на основе непрямого варианта ИФА с использованием рекомбинантного белка несколько выше значения специфичности. Это связано с тем, что диагностический порог (позитивно-негативный) высчитывали по результатам исследования проб, взятых только от неинфицированных животных. Принимая во внимание тот факт, что результаты исследования сывороток, особенно полученные от неинфицированных животных, редко демонстрируют нормальное распределение (часто имеют наклон вправо), то диагностический порог, рассчитанный с помощью стандартного отклонения, может привести к возрастанию ложно положительных результатов, а это ведет к снижению диагностической специфичности теста.
Кроме того, в нашем случае на значения диагностической чувствительности, диагностической специфичности, а также аналитической чувствительности влиял выбор антигена, сорбируемого на планшет. Общепринято, что в хозяйствах для предотвращения вспышек заболеваний проводят вакцинацию поголовья животных. То же практикуется и для предупреждения инфицирования вирусом РРСС. Как известно, есть две геногруппы вируса РРСС (33,39,41,42,61,75,85,89). В работах В.Г.Андреева с соавторами было показано, что на территории России циркулируют изоляты вируса РРСС, относящиеся к европейской группе вирусов, тогда как для изготовления вакцины используется вирус, относящийся к американской группе вирусов РРСС (штамм «БД»). Важное наблюдение было сделано при сравнении антигенных характеристик вирусов из разных групп. Установлено, сыворотки, полученные на европейские изоляты, значительно хуже реагировали с американскими изолятами вируса. Сыворотки, полученные на американские изоляты, в некоторых случаях вообще не реагировали с изолятами вируса европейской группы (30,126). При анализе уровня антител в сыворотках крови свиней, полученных из хозяйств, неблагополучных по заболеванию РРСС можно выделить условно 3 группы: группа с высоким уровнем антител (S/P значение выше 2.0), группа со средним уровнем антител {S/P значение около 1.0 до 2.0) и низким - менее 1.0. Все эти группы включают хозяйства, расположенные как на территории России, так и на территории Белоруссии, что говорит о циркуляции вируса с разной иммуногенностью на территории обеих стран. Клиническая картина у животных в этих хозяйствах была разной, варьируя от выраженной до стертой, независимо от того проводилась или нет вакцинация свинопоголовья. Так Blaha Th. (24) также отметила различную картину клинического проявления заболевания в стадах, инфицированных одновременно, независимо от вакцинации.
Необходимо отметить, что заболевание репродуктивно-респираторным синдромом часто возникает независимо от факта вакцинации свинопоголовья. Это может объясняться особенностями иммунного ответа в ответ на заражение.
Одной из особенностей РРСС является то, что в организме свиней наряду с антителами может циркулировать и вирус (9). В некоторых случаях живой вакцинный вирус передается неиммунным животным (82) и, также, способен преодолевать трансплацентарный барьер (83,102,113).
Кроме того, для вакцинации поголовья против РРСС чаще применяют инактивированную вакцину (Вакцина против ПВИС и РРСС жидкая эмульсионная инактивированная, выпускаемая ВНИИЗЖ), на которую вырабатывается менее напряженный и менее длительный иммунитет. В США отмечали случаи развития заболевания с острым течением в более или менее иммунной популяции свиней (24).
При анализе уровня антител в сыворотках крови свиней из хозяйств, проводящих вакцинацию, наблюдали наличие высокого уровня антител в сыворотке крови у свиней всех возрастных групп из неблагополучного хозяйства, тогда как в благополучном хозяйстве у поросят до 50-тидневного возраста антитела не выявляли или обнаруживали в низких титрах. Объяснить этот факт можно тем, что колостральные антитела к вирусу РРСС у поросят сохраняются до 2-х месячного возраста (7,11,58,118), к тому же передача колострального иммунитета поросятам от свиноматок, имеющих антитела к вирусу РРСС, не является 100%-ной (46).
Таким образом, в результате проведенных исследований были разработаны и тестированы иммуноферментные тест-системы по выявлению антигена и антител в сыворотке крови к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней.
