Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 15
2.1. Историческая справка о РРСС 15
2.2. Характеристика вируса РРСС и его биологические свойства 18
2.2.1. Строение, физико-химические и иммунобиологические свойства 18
2.2.2. Генетические различия штаммов вируса РРСС 21
2.3. Эпизоотология РРСС 25
2.3.1. Распространение РРСС в мире 25
2.3.2. Распространение РРСС в Российской Федерации и других странах СНГ 27
2.3.3. Пути распространения вируса РРСС 29
2.3.4. Вирусоносительство при РРСС 32
2.3.5. Экономический ущерб, причиняемый РРСС 32
2.4. Клиническое проявление болезни 33
2.4.1. Острое течение РРСС 35
2.4.2. Хроническая форма болезни 35
2.4.3. Атипичный (высокопатогенный) РРСС 37
2.4.4. Ассоциативное течение с другими заболеваниями 39
2.5. Средства и методы диагностики РРСС 45
2.5.1. Выделение вируса РРСС 46
2.5.2. Серологические методы диагностики РРСС 47
2.5.3. Молекулярно-биологические методы диагностики РРСС 49
2.6. Культивирование вируса РРСС 50
2.6.1. Экспериментальное заражение свиней 50
2.6.2. Выделение полевых изолятов с использованием альвеолярных макрофагов свиней 51
2.6.3. Выделение вируса с использованием перевиваемых культур клеток 52
2.7. Средства специфической профилактики заболевания 53
2.7.1. Живые вакцины для специфической профилактики РРСС
и схемы их применения 53
2.7.2. Инактивированные вакцины при РРСС и схемы их применения 61
2.7.3. Другие вакцины против РРСС и перспективы их использования 66
2.8. Иммунитет при РРСС 68
2.8.1. Клеточный иммунитет 68
2.8.2. Гуморальный иммунитет 69
2.9. Методы контроля антигенной активности вакцин против РРСС 71
2.10. Меры борьбы и профилактики РРСС 72
2.11. Заключение по обзору литературы 75
3. Собственные исследования 78
3.1. Материалы и методы 78
3.1.1. Материалы для анализа эпизоотической ситуации по РРСС в мире и Российской Федерации 78
3.1.2. Вирусы, животные, культуры клеток, питательные среды 79
3.1.3. Оборудование и инструменты 80
3.1.4. Культивирование вируса РРСС 81
3.1.5. Определение титра инфекционное вируса РРСС 82
3.1.6. Выделение вируса РРСС на культуре клеток 83
3.1.7. Заражение животных вирусом РРСС 84
3.1.8. Серологические и вирусологические исследования 85
3.1.9. Инактивация вирусного антигена и составление вакцин 86
3.1.10. Контроль вакцин 87
3.1.11. Эпизоотологическое обследование свиноводческих хозяйств 87
3.1.12. Обработка полученных результатов 88
3.2. Результаты собственных исследований 89
3.2.1. Анализ эпизоотической ситуации по РРСС в мире и Российской Федерации 89
3.2.1.1. Эпизоотическая ситуация по РРСС в мире 89
3.2.1.2. Анализ эпизоотической ситуации по РРСС среди домашних свиней и диких кабанов в Российской Федерации 97
3.2.1.3. Изучение путей распространения вируса РРСС 102
3.2.2. Особенности течения РРСС в Российской Федерации 107
3.2.2.1. Течение РРСС в небольших фермах 108
3.2.2.2. Течение РРСС в крупных свиноводческих комплексах 110
3.2.2.3. Острая форма РРСС 115
3.2.2.4. Проявление атипичного (высокопатогенного) РРСС в Иркутской области 119
3.2.2.5. Хроническая форма РРСС 125
3.2.2.6. Смешанное течение РРСС с другими заболеваниями 126
3.2.3. Выделение и изучение иммунобиологических свойств изолятов вируса РРСС с целью отбора их для изготовления и контроля вакцинных и диагностических препаратов 134
3.2.3.1. Иммунобиологические свойства некоторых известных штаммов вируса РРСС 134
3.2.3.2. Разработка методов выделения вируса РРСС 137
3.2.3.3. Культуральные свойства полевых изолятов вируса РРСС 139
3.2.3.4. Сравнительное изучение иммунобиологических свойств полевых изолятов вируса РРСС на свиньях 142
3.2.3.5. Изучение иммунобиологических свойств высоковирулентного изолята «Иркутский-2007» вируса РРСС американского генотипа 150
3.2.4. Оценка иммунобиологических свойств штаммов вируса РРСС, отобранных в качестве вакцинных 154
3.2.4.1. Оценка иммунобиологических свойств штамма «БД» 154
3.2.4.2. Изучение иммунобиологических свойств изолята «Кемеровский-96» вируса РРСС 162
3.2.5. Разработка сухой культуральной вирусвакцины против РРСС из штамма «БД» 174
3.2.5.1. Крупномасштабное культивирование штамма «БД» вируса РРСС 175
3.2.5.2. Разработка методов контроля культуральной вирусвакцины 178
3.2.5.3. Изучение эффективности сухой культуральной вирусвакцины против РРСС из штамма «БД» 182
3.2.5.4. Сравнительная оценка иммуногенной активности живых вирусвакции против РРСС на подсвинках 188
3.2.5.5. Разработка нормативной документации на сухую культуральную вирусвакцину против РРСС 192
3.2.6. Разработка эмульсионной инактивированной вакцины против РРСС
3.2.6.1. Разработка технологии получения вирусного сырья
3.2.6.2. Разработка режимов инактивации вируса РРСС
3.2.6.3. Оценка различных адъюваптов в составе моно- и ассоциированных инактивированных вакцин против РРСС и ПВИС
3.2.6.4. Разработка методов контроля эмульсионной инактивированной вакцины против РРСС
3.2.6.5. Изучение эффективности эмульсионной инактивированной вакцины против РРСС в экспериментальных и полевых условиях
3.2.6.6. Разработка нормативной документации на эмульсионную инактивированную вакцину против РРСС
3.2.7. Разработка эмульсионной инактивированной ассоциированной вакцины против РРСС и ПВИС
3.2.7.1. Разработка методов контроля эмульсионной инактивированной ассоциированной вакцины против РРСС и ПВИС
3.2.7.2. Оценка антигенной активности инактивированных вакцин против РРСС в процессе хранения
3.2.7.3. Оценка эффективности эмульсионной инактивированной ассоциированной вакцины против РРСС и ПВИС в хозяйствах
3.2.7.4. Разработка и усовершенствование схем иммунизации против РРСС
3.2.7.5. Разработка нормативной документации на эмульсионную инактивированную ассоциированную вакцину против РРСС и ПВИС
3.2.8. Характеристика производственных серий моно- и
ассоциированных вакцин против РРСС
4. Обсуждение результатов исследований
5. Выводы
6. Практические предложения
7. Список литературы
- Строение, физико-химические и иммунобиологические свойства
- Выделение полевых изолятов с использованием альвеолярных макрофагов свиней
- Материалы для анализа эпизоотической ситуации по РРСС в мире и Российской Федерации
- Выделение и изучение иммунобиологических свойств изолятов вируса РРСС с целью отбора их для изготовления и контроля вакцинных и диагностических препаратов
Введение к работе
Актуальность темы. Успешному развитию свиноводства во многом препятствуют различные инфекционные болезни, которые наносят большой экономический ущерб, обуславливая снижение продуктивности животных и низкую рентабельность отрасли. В начале 90-х годов прошлого столетия к их числу добавилось новое заболевание - репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС), которое в последние годы наносит значительный ущерб индустриальному свиноводству во всем мире.
Впервые это заболевание было зарегистрировано в свиноводческих хозяйствах США и Канады в 1986-1987 гг. и быстро распространилось по всему миру (Keffaber, К.К.,1989; Bilodeau R.,1991; Mardassi Н.,1994). В 1990 году РРСС установлен в Германии, а к середине 90-х годов им была охвачена почти вся Европа (Christianson W.T., Joo H.S.,1994; Albina E.,1998). С 1993 года он регистрируется в России и в других странах СНГ (А.Л. Семенихин и др., 1992; В.А. Мищенко и др., 1994; В.О. Бусол и др., 1994 и др.).
Заболевание характеризуется поздними абортами (90-109 дней супоросности), преждевременными родами (110-112 дней), прохолостами свиноматок, рождением мертвых, мумифицированных, нежизнеспособных поросят, гибелью новорожденных поросят и поражением органов дыхания у поросят-отъемышей, групп доращивания и откорма (В.А. Мищенко и др., 1994; Т.З. Байбиков и др., 1998; Albina Е.,1997).
Возбудителем болезни является РНК-содержащий вирус, относящийся к роду Аг-terivims, семейство Arteriviridae, порядок Nidovirales. В мире существует два генотипа вируса РРСС: американский и европейский (Murphy F.A.,1995; Dea S. et al.,1999). Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей российских изолятов вируса РРСС показал, что все они относятся к европейской геногруппе (А.В. Щербаков и др.,2003; Andreyev V.G. et al.,1999). Однако в последние годы в некоторых отечественных хозяйствах был выделен вирус РРСС американской геногруппы (К.Н. Груздев и др.,2006; Т.З. Байбиков,2008).
РРСС наносит ощутимый экономический ущерб свиноводству многих стран мира, который только в США ежегодно составляет 560 миллионов долларов. Убытки при РРСС исчисляются в 100-236 долларов США на свиноматку при острой вспышке болезни и до 502 долларов при хроническом течении.
Основным методом профилактики, контроля и борьбы с РРСС в странах с промышленным свиноводством остается специфическая профилактика с использованием живых и инактивированных вакцин (Т.З. Байбиков и др., 1998,2000; Б.Г. Орлянкин и др.,2000; Kang Y.B. et al.,1996; Mengeling W.L. et al.,2003; Gambade P. et al.,2007).
В связи с этим разработка, усовершенствование и оценка эффективности применяемых средств специфической профилактики РРСС является актуальной задачей для развития отечественного свиноводства.
Цель и задачи научных исследований. Главной целью исследований являлась разработка и внедрение в ветеринарную практику эффективных средств специфической профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
оценить эпизоотическую ситуацию по РРСС в Российской Федерации в 1997-2007гг. и изучить клинико-эпизоотологическое проявление репродуктивной, респираторной и атипичной форм РРСС при остром, хроническом и ассоциированном течении заболевания в хозяйствах различного типа и направления;
изучить иммунобиологические свойства отечественных изолятов вируса РРСС, отобрать штаммы, обладающие стабильными антигенными свойствами, для использования их в качестве производственных;
разработать технологию крупномасштабного культивирования производственных штаммов вируса РРСС;
разработать режимы инактивации вируса РРСС;
- подобрать адъюванты для изготовления инактивированных вакцин против
РРСС;
разработать технологию приготовления вакцинных препаратов против РРСС и методы их контроля;
провести испытания и дать оценку эффективности разработанных препаратов в экспериментальных и производственных условиях;
разработать инструкции по применению вакцин против РРСС;
освоить промышленное производство живой и инактивированных вакцин против РРСС и внедрить их в ветеринарную практику;
разработать и проверить в производственных условиях схему вакцинопрофилак-тики РРСС;
оценить эффективность средств и методов борьбы с РРСС в свиноводческих хозяйствах России;
подготовить и утвердить нормативно-техническую документацию на разработанные биопрепараты.
Научная новизна исследований. Дана оценка эпизоотической ситуации по РРСС в Российской Федерации в 1997-2007гг. Изучены особенности клинико-эпизоотологического проявления репродуктивной, респираторной и атипичной форм РРСС при остром, хроническом и ассоциированном течении заболевания в хозяйствах различного типа и направления. Впервые в результате клинико-эпизоотологического мониторинга РРСС показана степень его распространения на территории Российской Федерации.
Изучены иммунобиологические свойства полевых изолятов вируса РРСС, отобраны штаммы, обладающие стабильными антигенными свойствами, для использования их в качестве производственных.
Отобраны в качестве вакцинных и депонированы в коллекции микроорганизмов ФГУ «ВГНКИ» производственные штаммы «БД-ДЕП» и «КПР-96»-ДЕП вируса РРСС, отработана технология их крупномасштабного культивирования в перевиваемой культуре клеток Маге-145.
Разработаны технологии изготовления и наставления по применению вирусвак-цины против РРСС, эмульсионной инактивированной вакцины против РРСС и эмульсионной инактивированной ассоциированной вакцины против РРСС и парвовирусной инфекции свиней на основе отобранных штаммов.
Освоено промышленное производство живой и инактивированных вакцин против РРСС, которые успешно внедрены в ветеринарную практику.
Научная новизна исследований подтверждена 7 патентами Российской Федерации:
- Патент на изобретение №2220202 «Штамм «БД» вируса репродуктивно-
респираторного синдрома свиней для изготовления диагностических и вакцинных пре
паратов» (2003г.);
Патент на изобретение №2232596 «Способ изготовления вирус-вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней» (2004г.);
Патент на изобретение №2236253 «Вакцина эмульсионная инактивированная против репродуктивно-респираторного синдрома свиней» (2004г.);
Патент на изобретение №2236254 «Способ изготовления вакцины эмульсионной инактивированной против репродуктивно-респираторного синдрома свиней» (2004г.)
Патент на изобретение №2269361 «Вакцина ассоциированная эмульсионная инактивированная против репродуктивно-респираторного синдрома и парвовирусной инфекции свиней» (2006г.).
Патент на изобретение №2295567 «Штамм «КПР-96» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней для изготовления диагностических и/или вакцинных препаратов» (2007г.);
- Патент на изобретение №2316346 «Вакцина против репродуктивно-
респираторного синдрома свиней эмульсионная инактивированная» (2008г.).
Практическая значимость исследований. Установлена степень распространения РРСС на территории Российской Федерации и Республики Беларусь, определены особенности клинического проявления репродуктивной, респираторной и атипичной форм РРСС при остром, хроническом и ассоциированном течении заболевания в хозяйствах различного типа и направления.
Разработаны технологии изготовления и инструкции по применению вирусвакци-ны против РРСС, эмульсионных инактивированных моно- и ассоциированных вакцин против РРСС и обоснована их эффективность. Внедрена в ветеринарную практику и широко используется для борьбы и профилактики РРСС комплексная схема вакцино-профилактики РРСС, применение которой в свиноводческих хозяйствах Российской Федерации и Республики Беларусь показало ее высокую профилактическую эффективность.
Результаты научных исследований вошли в нормативную документацию (НД), утвержденную Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России и Россельхознад-зором МСХ РФ:
1. НД на «Вирусвакцину сухую культуральную против репродуктивно-
респираторного синдрома свиней» (ТУ 9384-027-00008064-99 и «Наставление по при
менению вирусвакцины ...»), 10.06.1999г.;
-
Изменения в ТУ 9384-027-00008064-99 «Вирусвакцина сухая культуральная против РРСС» (изменение методов контроля антигенной активности и определение биологической активности вирусвакцины), извещение №1 от 01.04.2005г.;
-
«Инструкция по применению вирусвакцины сухой культуральной против РРСС» (вместо «Наставления по применению ...» с изменением схемы иммунизации и биологических свойств вирусвакцины), 15.02.2006г.
-
НД на «Вакцину эмульсионную инактивированную против репродуктивно-респираторного синдрома и парвовирусной инфекции свиней» (ТУ 9384-026-00008064-99 и «Наставление по применению вакцины ...»), 30.06.1999г.;
-
Изменения в ТУ 9384-026-00008064-99 «Вакцина эмульсионная инактивированная против РРСС и ПВИС» (изменение методов контроля вакцины), извещение №1 от 04.04.2005г.;
-
Изменения в ТУ 9384-026-00008064-99 «Вакцина эмульсионная инактивированная против РРСС и ПВИС» (замена штамма «БД-ДЕП» на штамм «КПР-96»-ДЕП), извещение №2 от 04.04.2005г.;
-
«Инструкция по применению вакцины эмульсионной инактивированной против РРСС и ПВИС» (вместо «Наставления по применению ...» с изменением схемы иммунизации и биологических свойств вакцины), 15.02.2006г.;
8. НД на «Вакцину эмульсионную инактивированную против репродуктивно-
респираторного синдрома свиней» (ТУ 9384-153-00495527-2005 и «Инструкция по при
менению вакцины ...»), 30.06.2006г.
Публикация научных исследований. По теме диссертации опубликовано 78 научных работ, в том числе 12 работ в изданиях по перечню ВАК РФ.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены, обсуждены и одобрены на Международных и всероссийских научных, научно-практических конференциях (Владимир, 1998;2000;2004;2005; Щелково,2000;2002;2005; Омск,2000; Витебск, 2001; Иваново, 2005; Казань, 2005; Воронеж, 2005; Харьков, 2003;2005; Минск, 2005; Киев, 2006; Киров,2007), на 6-м и 7-м Международных симпозиумах по кабанам (Киккос, Кипр, 2006; Шопрон, Венгрия, 2008), XIV и XV Московских международных ветеринарных конгрессах (Москва, 2006;2007), 5-ом Международном симпозиуме по эмерд-жентным и ре-эмерджентным болезням свиней (Краков, Полына,2007), Международных симпозиумах по РРСС (Чикаго, США, 2007;2008), 4-ом Международном симпозиуме Россия-Евросоюз (Суздаль, 2007), 20-ом Международном ветеринарном конгрессе по свиноводству (Дурбан, ЮАР, 2008), зональных и межрегиональных научно-практических семинарах ветеринарных специалистов (Ярославль, Белгород, Казань, Киров, Иркутск, Краснодар, Новосибирск, Саранск, Москва, Кустанай, Минск, 2002-2008), заседании секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (Москва, 2008), а также на заседаниях ученого совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 1998-2008гг.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 370 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения и приложения. Список литературы включает 475 источников, в том числе 99 работ на русском языке. Работа иллюстрирована 28 рисунками и 93 таблицами.
Строение, физико-химические и иммунобиологические свойства
Среди ученых существует две основные гипотезы появления РРСС: 1. Вирус перешел от другого вида животных. 2. Вирус присутствовал в свинопоголовье в течение долгого времени, во время которого он приобретал высокую степень генетического разнообразия. В настоящее время нет никаких данных, чтобы полностью обосновать или опровергнуть любую из этих гипотез.
Например, из-за высокой степени генетического родства между вирусом лактатдегидрогеназы мышей (LDV) и вирусом РРСС, вполне вероятно допустить, что вирус РРСС мог адаптироваться к организму свиньи через поедание свиньями LDV-инфицированных мышей, путем мутации. Однако если бы вирус РРСС был результатом межвидовой передачи, тогда изоляты его должны быть генетически сходны с общим вирусным предком. Вместо этого, обширное генет ическое разнообразие уже имело место в пределах Европы и в пределах Северной Америки, а также между Европой и Северной Америкой со времени обнаружения вируса РРСС [445].
Forsberg R. с соавт. [445] считают, что изначально существовало несколько разновидностей вируса РРСС, которые были распространены в течение неопределенного периода времени в различных частях света, и это привело к их генетическому различию.
Первоначально считали, что основным источником распространения и объектом адаптации вируса к новому хозяину является дикий кабан. Согласно теории Plagemann P.P. [362], вирус РРСС является мутантом близкородственного ар-теривируса - лактатдегидрогеназы мышей. После завоза в 1912 году в штат Северная Каролина США из центральной Европы диких кабанов, инфицированных вирусом лактатдегидрогеназы мышей, он циркулировал среди них около 70 лет и после этого попал в популяцию домашних свиней. Аналогичный процесс независимо проходил на европейском континенте, чем автор гипотезы и объясняет существование существенных отличий (около 40%) между американским 11 европейским генотипами вируса РРСС. Однако, в результате серологического обследования диких кабанов в разных странах было установлено, что из сотен исследованных проб сывороток крови диких кабанов положительными к РРСС являются лишь единичные образцы [105,118,133,309,385,386,387,396,412,423,462]. Согласно этим данным, дикие свиньи не являлись источником распространения вируса РРСС, а скорее всего. наоборот, приобрели инфекцию от домашних свиней [475].
Оригинальную гипотезу происхождения европейского генотипа вируса РРСС предложил Stadejek Т. [322]. Согласно ей время появления вирусного предка европейского генотипа - период 1946-1967гг. После 11 мировой воины из разных стран Западной Европы племенные свиньи массово завозились в различные географические регионы СССР. В это время, скорее всего, возник новый вирус, т.е. вирус РРСС, способный самостоятельно распространяться среди свиней. Эту теорию подтверждают результаты секвеніїрования изолятов из стран бывшего СССР (Россия, Белоруссия, прибалтийские страны), которые значительно отличаются от западноевропейских. Однако до сих пор не ясно, как вирус РРСС мог распространиться в западную часть Европы. Одна из версий, что вирус РРСС мог быть занесен в Западную Европу из ГДР, т.к. эта страна впоследствии использовала для разведения племенных свиней из СССР.
По мнению А.В. Щербакова [93] вирус РРСС возник в результате межвидового перехода от грызунов к домашним свиньям на территории Восточной Азии. Расширение ареала и обособленная эволюция вируса па европейской и азиатской территориях привели к дивергенции вируса, и образованию двух генотипов. Из Азии вирус РРСС попал на американский континент. Во многих странах мира с развитым свиноводством, включая Россию, вирус был эндемичен задолго до его открытия. До 1987 года вирус РРСС не попадал в сферу внимания ветеринарных специалистов, поскольку в стадах свиней со сформировавшимся популяционным иммунитетом он вызывает лишь бессимптомную инфекцию. В конце 1980-х - начале 1990-х годов вирус распространился на неиммунные по отношению к нему стада свиней в Северной Америке и Западной Европе и вызвал эпизоотию заболевания, проявляющегося репродуктивной патологией [93].
Возможно, более раннему открытию вируса РРСС также помешало то, что сходные репродуктивные нарушения встречаются при многих других заболеваниях, с которыми РРСС часто протекает в ассоциации, и на их фоне не удавалось выявить РРСС. К тому же, как оказалось, вирус РРСС обладает весьма избирательной чувствительностью к культурам клеток [17,56,88,208,378], что также явилось причиной. затруднившей его выделение.
Официальное название этой болезни «репродуктивно-респираторный синдром свиней» было принято в 1992 году на I Международном симпозиуме по РРСС (Миннесота, США) [165,308].
Вирус РРСС относится к роду Arterivirus, семейство Arteriviridae. порядок Nidovirales. Кроме вируса РРСС, в род Arterivirus входят вирусы артериита лошадей, геморрагической лихорадки обезьян и повышающий уровень лактатдегидро-геназы мышей [41,43,145,329,371,467].
Выделение полевых изолятов с использованием альвеолярных макрофагов свиней
Для выделения вируса обычно используют АМС [14,17,64,331] или одну из двух перевиваемых линий клеток: CL 2621 [284] или Магс-145 [56,208]. Некоторые изоляты репродуцируются исключительно в АМС, а другие изоляты исключительно в одной из этих линий клеток, но в основном использование макрофагов является самой чувствительной системой для выделения вируса [149,162.173].
Bautista и соавт. [173] из 98 тканевых и 73 сывороточных проб, отобранных в стадах с подозрением на РРСС, удалось выделить 15 изолятов вируса РРСС. Причем, из полученных 15 изолятов вируса РРСС 4 изолята репродуцировались в АМС и культуре CL 2621, 4 изолята только в клетках CL 2621 и 7 изолятов исключительно в АМС. Дальнейшие исследования в этой области показали, что из 82 изолятов, выделенных ранее с использованием культуры клеток CL 2621, 25 изолятов не размножались в АМС. Из 18 изолятов, полученных с использованием АМС, 5 изолятов не репродуцировались в CL 2621. Из 57 изолятов, которые репродуцировались в АМС, только у 28 наблюдался цитопатический эффект.
В Европе АМС до сих пор считают наиболее восприимчивой системой для выделения вируса РРСС. АМС должны собираться от поросят, желательно SPF (свободных от специфических патогенов), не старше 6-8-недельного возраста [64,149,370]. Способы получения альвеолярных макрофагов свиньи, описанные в литературе, не рассчитаны на получение от одного донора большого количества культуры, что создает существенные ограничения для их применения. С увеличением возраста доноров выход макрофагов на 1 г ткани заметно снижается, а общий их сбор повышается, что связано с ростом массы органа [98]. Каждая партия макрофагов перед использованием должна тестироваться, так как их чувствительность к вирусу РРСС различна [149].
При выделении АМС велик риск микробной контаминации, так как трахея, бронхи, бронхиолы и альвеолы постнатальных легких вследствие свободного сообщения с внешней средой сильно обсеменены различной микрофлорой [98]. Все это делает выделение вируса РРСС на АМС весьма трудоемким процессом.
В литературе опубликовано много сообщений различных авторов о попытках адаптации вируса РРСС к различным первичным и перевиваемым клеточным культурам.
Вирус РРСС не удалось культивировать в первичных культурах легкого, трахеального эпителия, почек, семенников, сердца, эндотелия, костного мозга и щитовидной железы свиньи, эпителия крупного рогатого скота, фибробласгов, эндотелия и печени кур и в куриных эмбрионах. Изоляция вируса оказалась безуспешной на перевиваемых клеточных линиях свиной носовой раковины, свиной почки (РК-15, РК-2, SK-6), носовой раковины крупного рогатого скота, почки обезьяны (Vero, CV-1), почки сирийского хомячка (ВНК-21), почки собаки (MDCK), фаллопиевой трубы свиньи (PFT) и почки кошки (CRFK) [283,331,378,457].
Из перевиваемой линии клеток МА-104 методом клеточного клонирования впервые Kim и соавт. [208] получили 2 новые линии клеток, восприимчивых к вирусу РРСС: высокочувствительную Маге-145 и низкочувствительную L-1. В культурах МА-104, Маге-145 и L-1 вирус РРСС накапливался в титрах 103 5, 108 5 и 102 5 ТЦД5о/0,1мл, соответственно.
Park и соавт. [349] отмечали патогенный эффект вируса РРСС в первичной культуре трахеального кольца свиньи. Поражение ресничек мерцательного эпителия и эпителиальных клеток трахеального кольца зависели от патогенное ги изоля-та. Патогенные изоляты вызывали изменения вплоть до потери ресничек и дегенерации эпителиальных клеток.
Meulenberg и соавт. [115,277] удалось реплицировать вирус РРСС штамм Lelystad в клеточной культуре ВНК-21 путем внедрения плазмиды с к-ДНК копией генома вируса РРСС в клетки этой культуры.
К клеточным линиям, в которых, как сообщалось, происходит репликация вируса РРСС, относят также FL [37,52], ST (семенников свиньи) [365] и PS-EK [405]. Однако эти сообщения весьма ограниченны и требуют дальнейшего подтверждения.
Умеренная репликация вируса РРСС была установлена в первичной культуре клеток легкого хлопковой крысы. Однако при последующем пнтраназальном и пе ритонеальном введении вируса РРСС крысам репликацию не наблюдали. После интратрахеального введения репликацию регистрировали только в течение 1 суток после инокуляции [407].
Таким образом, наиболее чувствительными к вирусу РРСС оказались первичная культура альвеолярных макрофагов свиней (АМС) и два клоновых варианта перевиваемой линии клеток МА-104: CL-2621 и Маге-145 [14,17,88,149,208,378].
На североамериканском континенте (США п Канада), а также в ряде с гран Юго-Восточной Азии (Южная Корея и др.) и Европы (Дания, Германия и др.) широко применяют живую вирусвакцину против РРСС Ingelvac RespPRRS MLV (американское отделение фирмы Boehringer Ingelheim, США), эффективность которой установлена в экспериментальных и полевых условиях [201.239,327,391,415]. Эта первая живая коммерческая вакцина против РРСС появилась на рынке в 1994 году под названиями RespPRRS (в США) и Ingelvac PRRS MLV (в Европе). Сначала эта вакцина была рекомендована к применению только для поросят в возрасте 3-18 недель. Однако, как выяснилось позднее, для предотвращения трансплацентарной инфекции у свиноматок она оказалась даже более эффективной, чем респираторной формы у поросят. С 1996 года (под новым наименованием RespPRRS / Re-pro) она была рекомендована для иммунизации холостых свиноматок [144]. Защша животных наступала через 7 дней после вакцинации, этот препарат предохранял от заражения как американскими, так и европейскими штаммами вируса РРСС. Однако использованный вакцинный вирус мог выделяться через сперму иммунизированных хряков [463]. В связи с этим производитель запрещает вакцинацию супоросных свинок, свиноматок и хряков.
Материалы для анализа эпизоотической ситуации по РРСС в мире и Российской Федерации
Материалами для исследования являлись: - ежегодные материалы Генеральной Сессии МЭБ [125,126,336-339,341-343]; - ежегодники о здоровье животных ФАО-ВОЗ-МЭБ [128-132]; - ежегодные отчеты ветеринарных служб стран по болезням животных [119-124,127,442,443]; - еженедельные и ежегодные отчеты ветеринарных служб стран, размещенные на официальном сайте МЭБ в сети Интернет [260,261]; материалы различных конгрессов, симпозиумов и конференций [3,7,31,35,73.75,106,146,147,234,409,468 и др.]; - материалы отчетов и оперативных сведений по болезням свиней Департамента ветеринарии МСХиП РФ, Россельхознадзора, республиканских, краевых и областных ветеринарных отделов, а также других ветеринарных учреждений; - оперативная информация о работе свиноводческих комплексов ассоциации «Россвинпром»; - отчеты сотрудников ФГУ «ВНИИЗЖ», принимавших участие в обследовании свиноводческих хозяйств в различных регионах страны; - собственные материалы, собранные в течение 1997-2008гг., в том числе в результате командировок, когда пришлось принимать непосредственное участие в обследовании хозяйств и оказании консультативной помощи в планировании и осуществлении противоэпизоотичсскнх мероприятий. Такие командировки состоялись в свиноводческие хозяйства Архангельской, Белгородской, Владимирской. Вологодской, Воронежской, Ивановской, Иркутской, Костромской, Ленинградской, Московской, Нижегородской, Новгородской, Новосибирской, Омской, Оренбургской, Пермской, Псковской, Ростовской, Тверской, Тульской, Ульяновской, Ярославской областей, Краснодарского, Красноярского, Хабаровского краев России, а также Республики Беларусь; - результаты вирусологических, микробиологических и серологических исследований, проведенных в ФГУ «ВНИИЗЖ» в 1994-2008гг: - журналы регистрации движения поголовья, опоросов, сохранности поголо вья и другие документы различных свиноводческих хозяйств. Вирусы. В работе использованы следующие штаммы вируса РРСС: - прототипный штамм Lelystad (Нидерланды) европейского генотипа; - штамм NVSL (США) американского генотипа; - штамм № 2156 (Италия) европейского генотипа; - штамм BIS-046 (Испания) европейского генотипа; - вакцинный штамм «БД» (ФГУ «ВНИИЗЖ»); - вакцинный штамм «КПР-96» (ФГУ «ВНИИЗЖ»).
В экспериментальных опытах также были использованы российские изоляты вируса РРСС, выделенные и идентифицированные в ФГУ «ВНИИЗЖ» в 1996-2007гг.
Животные. В опытах использовали естественно восприимчивых к вирусу РРСС животных - свиней разных возрастных групп пород крупная белая, ландрас и дюрок из благополучных по РРСС и другим инфекционным заболеваниям хозяйств.
Культуры клеток. В работе использовали культуры клеток: - перевиваемую культуру клеток Маге-145 (клоновый вариант клеток почки эмбриона макаки - резус МА-104), полученную из США (National Animal Disease Center USDA, Agricultural Research Service, Ames, Iowa, 50010, USA); - альвеолярные макрофаги свиньи (АМС).
На различных этапах работы были также использованы следующие культуры клеток: - первичные культуры клеток куриных фпбробластов, почки свиньи и почки крупного рогатого скота; - перевиваемые клеточные культуры Vero, почки сирийского хомячка (ВНК-21), почки сибирского горного козерога (ПСГК-30). почки кролика (RK-13). почки теленка (MDBK), эмбриона норки, почки эмбриона свиньи (СПЭВ), почки поросенка (ППК), почки свиньи (РК-15), гибридомы почки эмбриона со спленоцитами свиньи (А4С2). Кроме того, в работе были использованы 10-суточные куриные эмбрионы, полученные от SPF-кур.
Питательные среды. При культивировании первичных и перевиваемых культур клеток использовали питательную среду Игла по стандартноп прописи (ВНИИЗЖ) с содержанием 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого ско-та, 50 мкг/см гентамицина, 2,5 мг/л амфотерицина В и 0,3 мг/см глютамина. Для промывания монослоя клеток использовали фосфатно-буферный раствор с рН 7,0-7,4. Кроме того, в работе были использованы бактериальные среды: МПА, МПБ, среда Китта-Тароцци.
Выделение и изучение иммунобиологических свойств изолятов вируса РРСС с целью отбора их для изготовления и контроля вакцинных и диагностических препаратов
При выяснении пути заноса инфекции в комплекс удалось установить, что заболевание в ЗАО «Надеево» возникло после закупки 12 хряков крупной черной породы из племенного хозяйства «Гибридный» Самарской области, являвшегося неблагополучным по РРСС.
После анализа сложившейся эпизоотической ситуации в свинокомплексе ЗАО «Надеево» нами была рекомендована вакцинация репродуктивного поголовья против РРСС и ПВИС, а также проведение мероприятий, предписанных инструкцией по борьбе с РРСС (дезинфекции, утилизация трупов и т.д.). В результате проведенных комплексных мероприятий патология репродукции сократилась с 70-80% до 2-3%. С середины марта резко сократился падеж среди поросят-сосунов. Если в феврале он составлял 100%, то в марте -3,41%, а в апреле - только 2,21%.
В декабре 1998 года на участке №3 среди поросят 65-110-дневного возраста был отмечен высокий уровень гибели со следующей клинической картиной: угнетение, повышение температуры тела, отсутствие аппетита, кашель, задержка в росте и развитии. Отдельные животные в конце периода доращивания имели живую массу всего лишь 15 кг (при средней массе 30-40 кг). При патологоанатомическом вскрытии таких павших поросят отмечали гиперплазию бронхиальных лимфоузлов, очаговую пневмонию, кровоизлияния в почках со стертой границей между слоями.
При обследовании этого хозяйства нами было установлено массовое заболевание поросят-отъемышей со следующей клинической картиной: повышение температура тела, кашель, ухудшение аппетита, у отдельных больных животных отмечали ярко фиолетовое окрашивание кожи ушей. Два таких поросенка с синюшными ушами были убиты и при патологоанатомическом вскрытии у них отмечали пневмонию, гиперплазию лимфоузлов, мелкоточечные кровоизлияния в почках. Or них были отобраны пробы внутренних органов для лабораторных исследовании во ВНИИЗЖ. При исследовании этого патматериала методом ПЦР был обнаружен геном эпизоотического вируса РРСС. Исследование на вирус КЧС дало отрицательный результат. При постановке биопробы с этим материалом был получен огрица-тельный результат на КЧС и положительный результат на РРСС.
С июня 1999г весь молодняк с 35-дневного возраста стали прививать сухой культуралыюн внрусвакциной против РРСС производства ВНИИЗЖ. В дальнейшем падеж поросят группы доращивания существенно сократился.
Таким образом, в ЗАО «Надеево» инфекция была занесена с племенными хряками из ранее неблагополучного по РРСС хозяйства. Вначале заболели свиноматки, затем поросята отъемного возраста и благодаря принятым мерам, основой которых являлась вакцинопрофилактика, удалось стабилизировать ситуацию по РРСС.
Проведенные исследования показывают, что острая форма РРСС протекает, как правило, в «манифестной» форме с преобладанием большинства клинических признаков заболевания и наносит серьезный экономический ущерб хозяйствам.
В конце августа 2007г. в Усть-Кутском районе РГркутской области были зарегистрированы 2 очага инфекционного заболевания среди свиней, сопровождавшегося высоким уровнем заболеваемости и гибели. Учитывая быстрое распространение заболевания, значительный уровень гибели свиней госветслужба Усть-Кутского района заподозрила КЧС.
Для уточнения диагноза на КЧС 20.09.2007г. нарочным в ФГУ «ВНИИЗЖ» были доставлены 6 проб сывороток крови от свиней МСП «Лена», 5 проб патологического материала, отобранные от свиней частного сектора села Казарки и пробы мяса из столовой ООО «Северная группа». В результате лабораторных исследований (экспертиза №01-13/4193 от 24.09.2007г.) был получен отрицательный результат на КЧС (антитела к вирусу КЧС в сыворотках крови не обнаружены (табл. 18). в пробах патматериала вирус КЧС не выделен).
Как видно из табл. 18, в сыворотках крови свиней МСП «Лена» были выявлены антитела во всех пробах только к вирусу РРСС американского генотипа и одна проба была позитивной к цирковирусу-2. Антитела к вирусам КЧС, РРСС европейского генотипа и Mycoplasma hyopneumoniae не обнаруживали.
Во всех исследованных органах павших и вынужденно убитых свиней методом ОТ-ПЦР был обнаружен вирус РРСС американского генотипа. У отдельных поросят в пробах легких и лимфоузлов также был обнаружен геном ЦВС-2 (в низкой концентрации) и Mycoplasma spp. (вид микоплазм не идентифицирован). В этих же пробах геномы вирусов КЧС, АЧС, болезни Ауески, гриппа, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, Haemophilus parasuis, Actinobacilhis pleu-ropneumoniae, Pasteurella multocida, сальмонелл не обнаруживали.
25.09.2007г. для дополнительных исследований в ФГУ «ВНИИЗЖ» были присланы пробы патологического материала от 2 подсвинков МСП «Лена». В результате дополнительных лабораторных исследований (экспертизы №01-13/4205 от 25.09.2007г. и №01-13/4286 от 01.10.2007г.) проб пагматериала от больных поросят и пробы мяса из столовой ООО «Северная группа» (кусочки мяса со свиных ребер) методом ОТ-ПЦР был обнаружен вирус РРСС американского генотипа. Секвени-рование и сравнительный анализ гена ORF 7 показали, что обнаруженный вирус имеет очень высокую степень гомологии с высоковирулентными штаммами вируса РРСС JXA 1, НЕВ 1 (рис. 5), вызвавшими в 2006-2007гг. крупную эпизоотию атипичного РРСС в Китае, сходного по течению и клиническому проявлению с КЧС (быстрое распространение, заболеваемость до 100%, смертность 25-50%) [395J. Кроме того, изолят «Иркутский-2007» имел делецию 90 нуклеотидных оснований (30 аминокислот) в гене Nsp 2, характерную для всех высоковирулентных китайских изолятов вируса РРСС.
