Введение к работе
Актуальность темы. Возбудитель трансмиссивного гастроэнтери-. свиней (ТГС) вызывает высоко контагиозное заболевание свиней всех ізрастов, однако наиболее восприимчивыми являются поросята до 2-х дельного возраста. Заболевание характеризуется рвотой, изнуряющей гареей и дегидратацией организма. Уровень летальности среди поросят ) 10 суточного возраста может достигать 100% (Matishec et al., 1982). Бо-:знь регистрируют во многих странах мира, в первую очередь в странах с ІТСНСІІВПО развитым свиноводством - США, Канаде, Японии. Болезнь шосит большой экономический ущерб в связи с отсутствием эффектных средств профилактики. Данные статистики показывают, что в ША ущерб, причиняемый вирусом ТГС, превосходит убытки от всех, ііесте взятых инфекционных болезней свиней. Особую угрозу инфекция редставляет для крупных животноводческих комплексов, где на относи-:льно небольших площадях сконцентрировано большое количество вос-рнимчивых животных (Pensaert, 1984).
Вирус ТГС входит в состав рода Coronavirus семейства Coronaviridae. роме него в этот род входят антигенно родственные вирус эпизооти-гской диарреи свиней и гемагглютинпрующий коронавирус свиней. Био-эгпя этих возбудителей изучена достаточно хорошо. В последние годы в зпноводческих хозяйствах некоторых стран Западной Европы обнаружи-и необычное явление - в отсутствие специфической вакцинопрофилактики без клинического проявления ТГС резко возросло количество серопози-[щного поголовья (Callebaut, 1988). Двумя независимыми группами иссле-ователей, из респираторного тракта здоровых свиней, был выделен ранее еизвестный коронавирус, с такими характерными свойствами, как пнев-оропность, авирулентность для естественного хозяина и тесное антиген-ое родство с вирусом ТГС. Выделенный возбудитель получил название еспираторный коронавирус свиней (РКС или РКВС). Проникновение казанного вируса в популяцию свиней, по-видимому, способствовало
формированию иммунного фона, достаточной напряженности (Broun et al, 1988; Pensaert et al., 1979). В связи с обнаружением новой нозоединицы возникла необходимость разработки средств и методов лабораторной диагностики, которые позволили бы обнаруживать и дифференцировать указанные коронавпрусы.
Для лабораторной диагностики ТГС в настоящее время разработан-ны следующие методы: биопроба на поросятах, выделение вируса на культуре клеток, метод флюоресцирующих антител (МФА), реакция диффузионной преципитации (РДП), реакция нейтрализации и твердофазный им-мунофсрментный анализ на основе полпклональных сывороточных антител для обнаружения антигенов возбудителя; а также реакция нейтрализации на культуре клеток (РН) и непрямой МФА для обнаружения антител к антигенам возбудителя в сыворотке крови иммунных животных. В виду чрезвычайно тесного антигенного родства возбудителей ТГС и РКВС (Correa at al., 1990; Pensaert at al., 1989) ни один из вышеперечисленных методов не позволяет дифференцировать антигены этих двух возбудителей между собой и дифференцировать иммунный ответ при инфицировании животных вирусом ТГС от иммунного ответа при инфицировании РКВС, т.е. ретроспективно дифференцировать ТГС от респираторной коронави-русной инфекции свиней.
Представляется целесообразным проведение работы по получению МА к консервативным и вариабельным участкам антигенов вируса ТГС для разработки на их основе средств и методов дифференциальной диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной корона-вирусной инфекции свиней.
Цель работы. Получение линий гибридных клеток, стабильно секретирующих МА, обладающие специфичностью к консервативным и вариабельным антигенным детерминантам вируса ТГС, и совершенствование на их основе средств и методов дифференциальной диагностики
трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной коронавирусной инфекции свиней.
Задачи исследования 1. Получить моноклональные антитела к некоторым консервативным и вариабельным антигенным детерминантам вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, для чего разработать схему получения таких моноклональных антител, включающую:
- изучение эффективности различных схем иммунизации мышей - до
норов иммунных спленоиптов;
- адаптацию некоторых методов лабораторной диагностики для
скрининга моноклональных антител нужной специфичности;
- стандартизацию моноклональных пммунореагентов.
-
Экспериментально определить, какие методы лабораторной диагностики позволяют использовать и максимально эффективно реализовать свойства моноклональных антител для обнаружения и дифференцирования антигенов вируса трансмиссивного гастроэнтерита и респираторного ко-ронавируса свиней, а также, для обнаружения и дифференцирования антител, специфичных к указанным возбудителям в сыворотках крови инфицированных животных.
-
Определить пригодность разработанных методов для дифференциальной диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной коронавирусной инфекции свиней.
Научная новизна Научная новизна состоит в том, что в результате проведенных исследований:
- получены девятнадцать клонов гибридных клеток, секретирующие
МА к консервативным и вариабельным антигенным детерминантам вируса
ТГС и консервативным антигенным детерминантам РКВС;
установлено, что антигенные детерминанты нуклеопротеина (молекулярная масса 47 кД) вируса ТГС, распознаваемые моноклональ-ными антителами клонов T1G4.2 и T4D4.1, а также антигенные детерминанты пепломерного гликопротеииа (молекулярная масса 200 кД) вируса
ТГС, распознаваемые моноклональными антителами клонов ТЗА6.2 и Т1С12.2, присутствуют на соответствующих белках всех изученных референтных и вакцинных штаммов вируса ТГС и его полевых изолятов. Антигенные детерминанты, распознаваемые перечисленными моноклональными антителами, присутствуют также на соответствующих белках респираторного коронавируса свиней. Таким образом, указанные моноклональ-ные антитела пригодны для обнаружения консервативных антигеных детерминант вируса ТГС и РКВС, а также обнаружения антител, специфичных к консервативным антигенным детерминантам вируса ТГС;
- установлено, что антигенные детерминанты, расположенные на
пепломерном глпкопротепне S (молекулярная масса 200 кД) вируса ТГС,
распознаваемые моноклональными антителами клона T4BU.1 присут
ствуют на соответствующем белке у всех изученных референтных и вак-
цинных штаммов и полевых изолятов вируса ТГС. На пепломерном гли-
копротеине респираторного коронавируса свиней антигенные детерми
нанты, распознаваемые указанными моноклональными антителами, отсут
ствуют;
прямой вариант ГХ ИФА, прямой вариант МФА и сэндвич вариант ТФ ИФА, разработанные на основе моноклональных антител клонов T1G4.1 и Т1С12.2 позволяют обнаруживать консервативные антигены вируса ТГС и РКВС;
прямой вариант ГХ ИФА, прямой вариант МФА и сэндвич вариант ТФ ИФА, разработанные на основе моноклональных антител клона Т4В11.1 позволяют обнаружить вариабельные антигенные детерминанты вируса ТГС и дифференцировать их от антигенов РКВС;
метод ингибирования ТФ ИФА, разработанный на основе моноклональных антител клонов T1G4.2, Т1С12.2 и T4D4.1, позволяет обнаружить в сыворотке крови свиней антитела к консервативным антигенным детерминантам вируса ТГС и РКВС;
- метод ингибирования ТФ ИФА, разработанный на основе моно-клональных антител клонов T4BI1.1, позволяет обнаружить в сыворотке крови свиней антитела к вариабельным антигенным детерминантам вируса ТГС, которые отсутствуют у РКВС и пригоден для ретроспективной дифференциальной диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной коронавирусной инфекции свиней.
Практическая значимость На основании экспериментальных исследований разработаны и рекомендованы для включения в схему дифференциальной диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной коронавирусной инфекции свиней чувствительные, специфичные, производительные и экспрессные методы ТФ ИФА, ГХ ИФА и МФА на основе моноклональных антител. Разработанные методы позволяют выявлять консервативные антигенные детерминанты вируса транс-миссивного гастроэнтерита свиней и респираторного коронавируса свиней, а также вариабельные антигенные детерминанты вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, что позволяет дифференцировать вирус ТГС от РКВС в вируссодержащих культуральных материалах, пробах органов и содержимого кишечника инфицированных животных. При ретроспективной дифференциальной диагностике трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной коронавирусной инфекции свиней данные методы позволяют обнаружить антитела, специфичные к консервативным антигенным детерминантам вируса ТГС и РКВС, и вариабельным антигенным детерминантам вируса ТГС в сыворотках крови инфицированных животных, что позволяет дифференцировать иммунный ответ при инфицировании животных вирусом ТГС от иммунного ответа при инфицировании животных РКВС.
Разработана нормативно-техническая документация на "Набор препаратов для дифференциальной диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной коронавирусной инфекции свиней гистохимическим иммуноферментным анализом на основе моноклональных анти-
тел" и "Набор препаратов для диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней твердофазным иммуноферментным анализом на основе моноклональных антител". (Временные инструкции по изготовлению и контролю, Технические условия, Наставления по применению "Наборов..." и Методические указания по постановке ТФ и ГХ ИФА), утвержденные директором ВНИИВВиМ.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научных конференциях ВНИИВВиМ (г. Покров 1993, 1994 гг), научно-практической конференции УНИИКЭВМ (г. Харьков 1995 г) и на заседаниях ученого совета ВНИИВВиМ (г Покров, 1993-1995гг).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ.
