Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 6
І.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
Классификация цирковирусов 10
Структурно-функциональная организация цирковирусов свиней 10
Патогенность цирковирусов свиней 13
1.3.1 .Патогенность ЦВС-1 13
1.3.2. Патогенность ЦВС-2 14
1.3.2.1. Синдром мультисистемного истощения отъёмышей 14
Эпизоотология 14
Клинические признаки 16
Патологоанатомические изменения 17
Патогенез СМИО 17
Экспериментальная инфекция СМИО 25
Дерматити синдром нефропатии поросят 27
Инфекционные врождённые треморы 28
Пролиферативная некротизирующая пневмония 29
Комплекс респираторной патологии 29
Репродуктивные нарушения и перинатальный миокардит 30
Распространение цирковирусов свиней 31
Диагностика цирковирусной инфекции свиней 33
Обнаружение вируса или вирусного антигена 33
Обнаружение антител кЦВС-1 и ЦВС-2 37
Дифференциальный диагноз 39
1.6. Меры борьбы с цирковирусной инфекцией свиней 40
1.7. Заключение по обзору литературы 41
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 43
2.1. Материалы 43
Патологический материал 43
Клеточные культуры 43
Вирусы и бактерии, используемые для проверки специфичности.. 43
Сыворотки 43
Бактериальные штаммы 43
Плазмиды 43
Реактивы 44
Ферменты 45
Среды и растворы 45
Пероксидазный конъюгат 47
Прочие материалы 47
Оборудование 47
2.2. Методы исследования. 48
Выделение ДНК 48
Расчет и синтез праймеров 49
ПЦР 50
Очистка продуктов ПЦР 50
Нуклеотидное секвенирование 51
Анализ первичной структуры нуклеиновых кислот 51
Молекулярное клонирование продуктов ПЦР 51
Экспрессия рекомбинантных белков 52
Очистка рекомбинантных белков 52
Непрямой вариант ИФА 52
Коммерческие наборы 53
Статистическая обработка результатов 53
2.3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ
ОБСУЖДЕНИЕ 55
2.3.1.1. Разработка мультиплексной ПЦР для выявления и типирования
цирковирусов свиней 55
2.3.1.2. Применение мПЦР в диагностических исследованиях 58
2.3.1.2.1. Исследование патологического материала от свиней 58
2.3.1.2.1.1. Синдром мультисистемного истощения отъёмышей и
респираторный комплекс 60
2.3.1.2.1.2. Другие формы инфекционной патологии свиней 66
Исследование на наличие ЦВС-2 материала от диких кабанов. 69
Исследование на наличие ЦВС клеточных культур, применяющихся в ФГУ ВНИИЗЖ для производства вакцин 70
Секвенирование и филогенетический анализ российских изолятов ЦВС-2 71
Разработка непрямого варианта ИФА на основе рекомбинантного белка ЦВС-2 для выявления антител в сыворотках крови 78
2.3.3.1. Получение рекомбинантного капсидного белка ЦВС-2 в системе
экспрессии Е. coli 79
2.3.3.2. Определение антигенной активности и специфичности
рекомбинантного белка 81
Разработка непрямого варианта ИФА методом последовательных разведений сывороток крови 82
Разработка непрямого варианта ИФА по одному разведению сывороток крови 86
Выбор оптимального рабочего разведения сывороток 87
Определение позитивно - негативного порога реакции.... 90
2.3.3.4.3. Определение допустимых величин оптической плотности
контрольных сывороток 91
2.3.3.4.4. Оценка воспроизводимости результатов серологической реакции92
2.3.3.5. Сравнение результатов тестирования сывороток, полученных в
разработанной тест-системе относительно коммерческого набора 93
2.3.3.6. Применение разработанного непрямого варианта ИФА для изучения
распространения ЦВС-2 в хозяйствах РФ 95
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 98
ВЫВОДЫ 102
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 103
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 104
ПРИЛОЖЕНИЯ 128
Введение к работе
Актуальность темы. Эмерджентные болезни являются одной из наиболее актуальных проблем современного животноводства. В инфекционной патологии свиней важная роль принадлежит недавно получившим широкое распространение болезням, ассоциированным с цирковирусами.
У свиней идентифицированы два вида цирковирусов. Цирковирус свиней типа 1 (ЦВС-1) был обнаружен в 1974 году как нецитопатогенный контаминант перевиваемой культуры клеток почек поросят РК-15 (199) и считается непатогенным вирусом, так как не вызывает каких-либо клинических признаков у инфицированных животных. Цирковирус свиней типа 2 (ЦВС-2) был впервые выделен от больных поросят в Канаде в 1998г. (116, 117, 145) и является первичным этиологическим агентом синдрома мультисистемного истощения поросят-отъёмышей (СМИО). Кроме того, этот вирус ассоциирован с синдромом нефропатии и дерматитов поросят, а также вовлечён в респираторную и репродуктивную патологию свиней. ЦВС-2 распространён во всех странах с развитым свиноводством, причём встречается практически в 100% стад. Чрезвычайно широкое распространение ЦВС-2 и многообразие клинических проявлений инфекции делают его одним из наиболее значимых для современного свиноводства инфекционных агентов (36). По современным оценкам заболевания, связанные с ЦВС-2, особенно СМИО, обходятся Европейским производителям в 600 млн. евро в год (168).
В России ЦВС-2 был впервые обнаружен в 2000 году (14). Цирковирусная инфекция была установлена у свиней во многих из обследованных хозяйств РФ. В то же время неизученным оставался широкий круг проблем, связанных с этой инфекцией: степень распространения цирковирусов среди домашних свиней и диких кабанов, генетическое разнообразие вируса, циркулирующего на территории России, вовлечённость ЦВС-2 в различные формы инфекционной патологии свиней. Обусловлено
это было тем, что отсутствовали, либо были несовершенны, методы диагностики цирковирусной инфекции.
Цели и задачи исследования. Основная цель данной работы состояла в разработке методов диагностики цирковирусной инфекции свиней и применении разработанных методов для изучения распространения и клинического проявления этой инфекции на территории РФ.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
разработать метод обнаружения и типирования цирковирусов свиней, основанный на мультиплексной ПЦР;
применить разработанный метод в диагностических исследованиях и изучить связь между различными формами инфекционной патологии свиней и наличием ЦВС;
провести филогенетический анализ изолятов ЦВС-2, циркулирующих в свиноводческих хозяйствах и дикой фауне РФ;
исследовать на наличие цирковирусов клеточные культуры, применяющиеся в ФГУ ВНИИЗЖ для вирусологических исследований и производства вакцин;
- получить рекомбинантный капсидный белок ЦВС-2 и разработать на его
основе иммуноферментную тест-систему для выявления антител к вирусу в
сыворотках крови свиней;
- применить разработанную иммуноферментную тест-систему для
изучения распространения ЦВС-2 в хозяйствах РФ.
Научная новизна исследований.
Разработан метод обнаружения и типирования цирковирусов свиней, основанный на мультиплексной ПЦР.
Изучены особенности клинического проявления цирковирусной инфекции свиней в хозяйствах РФ.
Проведен филогенетический анализ российских изолятов ЦВС-2, показано большое генетическое разнообразие вируса, циркулирующего в свиноводческих хозяйствах и дикой фауне РФ.
Получен рекомбинантный капсидный белок цирковируса свиней типа 2 и на его основе разработана иммуноферментная тест-система для выявления антител к ЦВС-2.
Проведён мониторинг цирковирусной инфекции свиней и показано чрезвычайно широкое распространение ЦВС-2 в свиноводческих хозяйствах РФ и среди диких кабанов.
Практическая значимость исследований. В результате проведённых исследований разработаны следующие методики:
«Методика обнаружения и типирования цирковирусов свиней с использованием мультиплексной полимеразной цепной реакции», одобренная учёным советом и утверждённая директором ФГУ ВНИИЗЖ 02.06.2005г.;
«Методика обнаружения антител к цирковирусу свиней типа 2 в непрямом варианте иммуноферментного анализа», одобренная учёным советом и утверждённая директором ФГУ ВНИИЗЖ 29.09.2005г.
Разработанные методики используются в диагностике цирковирусной инфекции свиней.
Публикации научных исследований. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и опубликованы на 5-й всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 19-21 октября 2004г.), на 3-й международной научно-практической конференции «Ветеринарне забеспечення свинарства: сучасний стран і шляхи розвитку» (Харьков, 2005г.), «International Conference on Animal Circoviruses and Associated Diseases» - Queen's University, (Belfast, Northern Ireland, UK, llth-13th September 2005), на заседаниях учёного совета ФГУ ВНИИЗЖ в 2004-2006 гг.
Основные положения, выносимые на защиту:
Метод обнаружения и типирования цирковирусов свиней, основанный на мультиплексной ПЦР.
Результаты изучения клинических проявлений цирковирусной инфекции свиней в хозяйствах РФ.
Результаты филогенетического анализа российских изолятов ЦВС-2.
Рекомбинантный капсидный белок ЦВС-2 и разработанная на его основе иммуноферментная тест-система для выявления антител к вирусу.
Результаты использования разработанной иммуноферментной тест-системы в серологическом мониторинге цирковирусной инфекции.
Структура и объём работы. Диссертация изложена на 130 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения и приложения. Список используемой литературы включает 207 источников, из которых 192 иностранных. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 15 рисунками.
Исследования по диссертационной работе выполнены в 2003-2006гг. в ФГУ "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГУ ВНИИЗЖ, г. Владимир).
Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю кандидату биологических наук Алексею Владимировичу Щербакову и сотрудникам лаборатории диагностики особо опасных болезней животных -за оказанную практическую помощь в выполнении отдельных этапов работы и оформлении диссертации.
