Содержание к диссертации
стр.
ВВЕДЕНИЕ 6
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11-38
1.1. Общая характеристика стрепто- 11
кокков
1.1.2. Этиологическая роль стрепто- 11
коккозов в патогенезе различных за
болеваний
1.1.3 .Антигенная структура стрепто- 14
кокков
1.1 ^.Классификация стрептококков 19
1.2.0сновные методы диагностики 25
1.2.1.Иммуноферментный анализе 27
диагностике инфекционных заболе
ваний
1.2.2.Ферменты и субстраты, исполь- 33
зуемые в иммуноферментном анали
зе.
1.2.3. Применение иммунофермент- >>н
ного анализа для диагностики стреп
тококковых инфекций
2. Собственные исследования 39-89
2.1 .Материалы и методы 39-47
2.1.1 .Материалы 3 9
2.1.2.Методы исследований 41
2.2. Статистические методы 47
3.Результаты исследований
3.1.Культивирование S. equi subsp. zooepidemicus
3.2Лолучение специфических антистрептококковых сывороток
3.2.1,Совершенствование метода получения стрептококковых антигенов для гипериммунизации.
3.2.2.Изыскание оптимальных вариантов схем для иммунизации
3.3.Результаты испытания антистрептококковых сывороток на активность и специфичность
3.4. Получение реагентов набора ИФА.
Получение иммунопероксидаз-ных конъюгатов и отработка постановки иммуноферментного анализа.
Выделение и сравнительный химический состав антигенных препаратов S. equi subsp. zooepidemicus полученных разными методами
Иммуноферментный анализ с антигенами, полученными различными методами.
Определение оптимальных условий проведения ИФА
Определение оптимального 80 разведения конъюгата
Подбор индикаторной смеси 83
3.5. Экспериментальные испытания 84
твердофазного иммуноферментного
анализа
4. Обсуждение результатов исследо- 91
ваний
ВЫВОДЫ 100
Практическое использование полу- 101
ченых научных результатов
Рекомендации по использованию по- 101
лученных научных результатов
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 103
Приложение 124
ОСНОВНЫЕ ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
OD - оптическая длина волны ИФА - иммуноферментный анализ МПА- мясопептонный агар МПБ — мясопептонный бульон ОП - оптическая плотность ОФД - ортофенилендиамин ПЦР - полимеразная цепная реакция РА - реакция агглютинации
РДП - реакция диффузионной преципитации
РП - реакция преципитации
ТМБ - тетраметилбензидин
ФБР - фосфатно-буферный раствор
Микр. тел - микробных тел
РРИД - радиальная реакция иммунной диффузии
НРИФ — непрямая реакция иммунофлуоресценции
РЗПГА — реакция задержки пассивной гемагглютинации
РН - реакция нейтрализации
КРС - крупный рогатый скот
Введение к работе
Ветеринарная наука за последние годы достигла значительных успехов в диагностике, профилактике и лечении инфекционных болезней животных. С целью разработки более эффективных и адекватных методов диагностики, средств специфической профилактики болезней животных требуются новые методические подходы, основанные на современных достижениях биологической науки и научно-технического прогресса в целом.
В связи с этим одним из главных направлений ветеринарной диагностики является создание простых в использовании и надежных иммунохи-мических методов экспресс-диагностики инфекционных болезней животных. Этот подход важен, когда речь идет о диагностике таких бактериальных инфекций как стрептококкозы. Из-за особенностей идентификации стрептококков при бактериологическом анализе не всегда удается выявить их как этиологический агент.
Применение антибиотиков, а также появление атипичных, плохо дифференцируемых форм бактерий существенно снижают эффективность бактериологического исследования. Трудности бактериологического анализа стрептококковых инфекций также связаны с несовершенством питательных сред и дороговизной или отсутствием в практических лабораториях некоторых ингредиентов, необходимых для идентификации. Поэтому представляется перспективным использовать методы иммунохимической диагностики стрептококковой инфекции, направленные на выявление постинфекционных или поствакцинальных антител.
Стрептококкозы регистрируют в крупных и мелких животноводческих хозяйствах Дании, Германии, Франции, США, Англии, Словакии, России и ряда других стран (126; 152; 122,156; 8,19; 45). Значительное распространение и экономический ущерб от заболеваний, вызываемых стрептококками (слагаемый из гибели животных, затрат на диагностику, лечение,
профилактику), актуализируют задачу создания современных методов ла
бораторной диагностики инфекции.
Широкое распространение кокков затрудняет диагностику только по результатам бактериологического исследования и нуждается в дополнительном подтверждении путем выявления реакции антителообразования у инфицированных животных. Этим требованиям отвечают методы, основанные на реакции взаимодействия антигена с антителом и получении иммунного комплекса, который можно выявить с помощью меченного ферментом реагента (62; 152; 16). Результат реакции оценивают по интенсивности окрашивания визуально или используют автоматизированные методы учета.
В ветеринарии иммуноферментный анализ используют для обнаружения возбудителей инфекционных болезней животных и птиц. Метод успешно применяется для выявления антител вирусу лейкоза крупного рогатого скота (84), к возбудителю бруцеллеза (46), для диагностики трихинеллеза, к
возбудителю вируса болезни Ньюкасла, к возбудителю чумы свиней и др.
(15).
При разработке препарата для диагностики стрептококковой инфекции необходимо определить, какие из бактериальных антигенов играют ведущую роль в ходе патологического процесса. В многочисленных исследованиях, посвященных этому вопросу ранее, было показано, что полисахариды клеточной стенки стрептококков играют основную роль в стимуляции иммунного ответа и создании иммунитета к стрептококку гомологичного серотипа(13,97,107, 170,180).
Это послужило основанием для использования С-полисахарида в качестве специфического реагента (антигена) в иммуноферментном анализе. Ранее изученные биологические и серотипические свойства С-полисахарида (11; 19; 152; 102, 130; 13) позволили определить оптимальные условия ад-
сорбции его на твердом носителе (полистироловом планшете) и получить
высокоактивные гипериммунные сыворотки к стрептококковым антигенам (45;62; II, 18).
Классические иммунологические тесты, такие как РА, РДП, РП по выявлению специфических антител к стрептококкозам животных требуют титрования. При этом невысокая чувствительность и значительная доля субъективизма в учете этих реакций, связанного с тем, что, как правило, нелегко отличить слабую положительную реакцию от отрицательной с достаточной надежностью (52). Альтернативным является иммуноферментный анализ, позволяющий непосредственно регистрировать взаимодействие антигена с антителом, а не анализировать вторичные их проявления — агглютинацию, преципитацию или гемолиз.
Результативность метода иммуноферментного анализа зависит от активности, специфичности и стабильности всех компонентов реакции.
В связи с этим, целью настоящего исследования явилась разработка ИФА теста для диагностики стрептококковой инфекции.
Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:
Отработка режимов выделения и очистки антигена штамма S. equi subsp. zooepidemicus и изучение его биохимического состава.
Разработка схемы гипериммунизации и получение специфической сыворотки и иммуноглобулина к стрептококковым антигенам.
Отработка параметров коньюгирования иммуноглобулинов (гаммаглобулина) пероксидазой хрена и получение специфического конъю-гата.
4. Составление набора ИФА для выявления противострептококковых
антител в биологических жидкостях, подбор оптимальных параметров по
становки ИФА.
5. Экспериментальные испытания ИФА выявления антител к S. equi
subsp. zooepidemicus.
Научная новизна результатов исследования. Впервые для серологической диагностики инфекционных болезней животных, вызываемых S.equi subsp. zooepidemicus разработана тест-система ИФА. Метод показал высокую чувствительность и специфичность и позволял выявлять поствакцинальные и постинфекцинные специфические антитела.
Разработаны биотехнологические параметры получения кроличьих гипериммунных референс-сывороток и иммуноглобулинов к растворимым антигенам S. equi subsp. zooepidemicus.
Изучены условия адсорбции антигенов стрептококка на полистироловых планшетах.
Практическая значимость результатов исследования. Разработана тест-система для диагностики стрептококкозов животных, вызываемых S. equi subsp. zooepidemicus, методом ИФА и нормативная документация на опытно-промышленное производство антигенного иммуноферментного стрептококкового диагностикума (СТО (Технические условия), инструкция по применению). Практическое применение антигенного иммуноферментного стрептококкового диагностикума позволит повысить диагностическую значимость лабораторных исследований, проводить серологический мониторинг и прогнозировать стрептококкозы у животных.
Материалы исследований включены в учебные программы кафедр иммунология и биотехнология ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И.Скрябина.
Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на научно-практической конференции (г. Душанбе, 2004г) и обсуждены
* на межкафедральном совещании сотрудников кафедр микробиологии, эпи
зоотологии, иммунологии, биотехнологии и научно-исследовательской ла
боратории инфекционной патологии и биотехнологии.
По теме диссертации опубликовано 4 научных работ.
Положения, выносимые на защиту:
Результаты исследований по обоснованию и разработке ИФА теста для серологической диагностики стрептококковой инфекции, вызываемой S.equi subsp. zooepidemicus .
Результаты экспериментальных испытаний разработанного ИФА теста для серологической диагностики и мониторинга стрептококковой инфекции у животных.
Структура и объем работы.
Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, ил
люстрирована 10 рисунками и 16 таблицами. Диссертация содержит сле
дующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, резуль
таты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практи
ческие предложения, список литературы, включающий 184 источника, из
которых 100 иностранных и приложение.
