Введение к работе
1.1. Аюгуальность темы. Классическая чума свиней (КЧС) - особо опасная, высококонтагиозная болезнь свиней, эпизоотии и вспышки которой регистрируют как в России, так и за рубежом. Несмотря на тенденцию к снижению количества вспышек болезнь наносит значительный экономический ущерб (Horzinek М.С, 1991; Van Oirschot G., 1994; Джупина СИ., 2001).
Противоэпизоотические мероприятия при классической чуме свиней включают вакцинацию поголовья, в том числе в повышенных дозах, полное или частичное уничтожение животных в эпизоотическом очаге и диагностику болезни. Однако, несмотря на проводимые мероприятия в некоторых свинокомплексах установлена стационарность эпизоотических очагов этой болезни (Вишняков И.Ф., 1985; Коломыцев А.А., 1992; Джупина СИ., 2001). Эффективность современной системы защиты свиноводческих хозяйств от классической чумы свиней и меры борьбы с болезнью постоянно подвергаются углубленному анализу. В настоящее время в качестве основных звеньев совершенствования противоэпизоотических мероприятий при классической чуме свиней выдвигаются диагностика, специфическая профилактика, оценка поствакцинального иммунитета и серологический мониторинг болезни (Макаров В.В., 2001; Vannier Р., 1986; Harcness J.W., 1985).
Природная очаговость классической чумы свиней среди диких кабанов представляет опасность для промышленного свиноводства возможностью вовлечения домашних свиней в цепь циркуляции возбудителя. В связи с этим оценка эффективности специфической профилактики, а именно, определение популяционного иммунитета диких свиней в природе также является актуальным (Скупый М.Ф., 1973; Коломыцев А.А., Куриннов В.В., 1992).
Основным методом серологического мониторинга при определении напряженности иммунитета в нашей стране является реакция нейтрализации (Carbrey Е.А., 1988). Однако, несмотря на ее важное значение, использование реакции нейтрализации (РН) для широкомасштабного мониторинга классической чумы свиней и определения напряженности иммунитета при
массовых обследованиях крайне затруднительно ввиду длительности ее постановки, высокой стоимости, необходимости специально оснащенных лабораторий - стерильные условия, поддержание культуры клеток, наличие живого эпизоотического вируса.
Для решения аналогичных задач в настоящее время предложены методы, основанные на использовании моноклональных антител (Wensvoort G. и др., 1988). Для определения специфических к вирусу КЧС антител имеются коммерческие наборы (Ceditest ELISA), SYNBIOTICS (Франция), IDEXX, CYPRESS (Бельгия) и др., однако, эти методы пригодны для качественного определения антител, но не позволяют оценивать напряженность иммунитета.
Разработан ряд методов твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ ИФА), в которых в качестве антигена использовали целую вирусную частицу (Have Р., 1984). Несмотря на их высокие чувствительность и специфичность, возможны проблемы, связанные с интерпретацией результатов (Thibault J., 1994). Имеются сложности при очистке вируса КЧС. Применение в качестве антигена в методах ТФ ИФА рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС исключает эти проблемы
На основании вышеизложенного совершенствование и разработка высокопроизводительных средств и методов для серологического обследования большого количества свиноводческих хозяйств и определения напряженности иммунитета при классической чуме свиней на основе рекомбинантного белка Е2 ВКЧС являются актуальными.
1.2. Цели и задачи. Основная цель исследований - разработка средств и методов для проведения широкомасштабного серологического мониторинга и определения напряженности иммунитета при классической чуме свиней на основе ТФ ИФА.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- Определить оптимальные условия получения антигенов вируса
классической чумы свиней, их концентрирования и очистки для использования
в методах ТФ ИФА.
Разработать тест-систему на основе моноклональных антител (МА) для технологического контроля активности протективных антигенов вируса классической чумы свиней.
Разработать тест-систему с использованием рекомбинантного белка Е2 вируса классической чумы свиней, экспрессируемого вирусом осповакцины для выявления антител к вирусу классической чумы свиней в сыворотках крови свиней.
Определить чувствительность, специфичность и коэффициент корреляции результатов разработанного непрямого метода ТФ ИФА на основе рекомбинантного белка Е2 по отношению к результатам РН.
- Оценить эффективность разработанного "Набора препаратов для
выявления специфических антител к вирусу классической чумы свиней
непрямым методом ТФ ИФА на основе рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС"
при проведении серологического мониторинга и определения напряженности
иммунитета свиней при классической чуме свиней в условиях свинокомплексов
и охотхозяйств.
1.3. Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на защиту:
Прямой метод ТФ ИФА на основе моноклональных антител для технологического контроля при получении протективных антигенов вируса классической чумы свиней и определении условий их оптимального накопления, концентрирования и очистки.
Непрямой метод ТФ ИФА для выявления специфических антител к вирусу классической чумы свиней в сыворотках крови свиней с использованием в качестве антигена рекомбинантного белка Е2 вируса классической чумы свиней, экспрессируемого вирусом осповакцины и конъюгата моноклональных антител к Ig G свиней.
Чувствительность и специфичность разработанного непрямого метода ТФ ИФА и его корреляция с результатами, полученными с использованием РН.
"Набор препаратов для выявления специфических антител к вирусу классической чумы свиней непрямым методом ТФ ИФА на основе рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС" для проведения серологического мониторинга классической чумы свиней в практике полевых исследований на свинокомплексах и охотхозяйствах.
1.4. Научная новизна исследований.
Разработан метод концентрирования и очистки рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС на основе вектора вируса осповакцины.
Разработан непрямой метод ТФ ИФА и набор препаратов для обнаружения специфических к ВКЧС антител в сыворотках крови свиней, пригодный для проведения серологического мониторинга КЧС.
Показана корреляция между результатами выявления антител с помощью разработанного непрямого метода ТФ ИФА на основе рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС и РН, изучена диагностическая ценность разработанного непрямого метода ТФ ИФА.
1.5. Практическая значимость исследований.
На основании результатов проведенных экспериментов, апробации при проверке полевых материалов и результатов комиссионных испытаний разработанный "Набор препаратов для выявления специфических антител к вирусу классической чумы свиней непрямым методом ТФ ИФА на основе рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС" рекомендован для определения напряженности иммунитета при КЧС после вакцинации животных на свинокомплексах и проведения серологического мониторинга КЧС в свиноводческих хозяйствах и дикой природе.
1.6. Апробация работы.
Результаты исследований, выполненных по теме диссертационной работы, доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ
ВНИИВВиМ (г.Покров) 2002-2005гг., Международной научно-практической конференции ВНИТИБП (Щелково, 2005г.)
1.7. Публикации.
По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в т.ч. одна статья в журнале «Ветеринария».
1.8. Личный вклад соискателя
Представленные в диссертационной работе экспериментальные исследования, теоретический и практический анализ полученных результатов проведены автором самостоятельно. В выполнении работы по разделам 4.2.1, 4.3.2., 4.4.3., 4.7. практическую и консультативную помощь оказывали сотрудники ГНУ ВНИИВВиМ: Новиков Б.В., Власова Н.Н., Анохина Е.Г. и Стрижакова О.М.
1.9. Объем и структура диссертации
Похожие диссертации на Разработка средств и методов серологического мониторинга классической чумы свиней на основе твердофазного иммуноферментного анализа
