Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12-74
1.1. Бруцеллез 12-47
1.1.1. Краткая историческая справка 12-15
1.1.2. Характеристика возбудителя бруцеллеза 14
1.1.2.1 Таксономия 14
1.1.2.2. Геном 15-16
1.1.3. Краткий анализ эпизоотической ситуации по бруцеллезу 16-19
1.1.4. Резервуар и источники бруцеллезной инфекции 19
1.1.5. Диагностика бруцеллеза животных 20
1.1.5.1. Серологические методы диагностики бруцеллеза 21
1.1.5.2. Аллергическая диагностика бруцеллеза 33
1.1.5.3. Бактериологическая диагностика бруцеллеза 33-34
1.1.5.4. Молекулярно-генетическая диагностика бруцеллеза 34-47
1.2. Кампилобактериоз 47-74
1.2.1. Краткая историческая справка 47-48
1.2.2. Характеристика возбудителя болезни 48
1.2.2.1. Таксономия 48-49
1.2.2.2. Морфологические свойства 49
1.2.2.3. Культуральные свойства 49-51
1.2.3. Эпизоотология заболевания 51-57
1.2.4. Диагностика кампилобактериоза животных 57-71
1.2.5. Идентификация камни лоб актерий 71-74
1.3. Анализ обзора литературы 74-88
2. Собственные исследования 89-184
2.1. Материалы иметодві 89-102
2.1.1. Подготовка исследуемого материала 91
2.1.2. Выделение геномной ДНК из исследуемого материала . 91-93
2.1.3. Постановка ПЦР 93
2.1.4. Очистка ампликонов методом фенолы-юй экстракции . 93-94
2.1.5. Рестрикциоыный анализ 94
2.1.6. Электрофоретический анализ 95-96
2.1.7. Изучение свойств кампилобактерий 96-101
2.2. Результаты собственных исследований 101
2.2.1. Разработка ПЦР-тест-системы для выявления бруцеял 101-140
2.2.1.1. Краткое теоретическое обоснование основных принципов при разработке ПЦР-тест-сиетем 101 -104
2.2.1.2. Определение чувствительности и специфичности праймеров WboA 104-108
2.2.1.3. Оценка чувствительности и специфичности ПЦР-тест-системы для выявления бруцелл 109-113
2.2.2. Оценка чувствительности ПЦР-тест-системы с использованием молока, крови и спермы животных, контамини-роваиных бруцеллами и крови морских свинок, инфицированных бруцеллами 113-120
2.2.3. Изучение чувствительности и специфичности ПЦР-тест-системы в производственных условиях 120-140
2.2.3.1. Московская область 120-123
2.2.3.2. Смоленская область 123-127
2.2.3.3. Волгоградская область 127-130
2.2.3.4. Краснодарский край ; 131-140
2.2.4. Дифференциация видов и штаммов бруцелл 140-156
2.2.4.1 Идентификация вакцинного штамма Brucella abortus 19 140-141
2.2.4.2 Идентификация диссоциированных штаммов бруцелл . 141-143
2.2.4.3 Дифференциация видов бруцелл, основанная на полиморфизме расположения в геноме бруцелл элемента iS 711 144-149
2.2 4.4. Дифференциация всех биоваров В, abortus 149-151
2.2.4.5 Использование ПЦР-ПДРФ- анализ а для дифференциации5. cams к В. neotomae 151-156
2.2.5. Изучение дифференциально-диагностических признаков кампилобактерий 156-159
2.2.6. Разработка тест-системы для выявления Campylobacter jejuni subspecies jejuni 159-166
2.2.6.1. Краткое теоретическое обоснование основных принципов при разработке ШДР-тест-системы для диагностики кампилобактериоза 159
2.2.6.2. Изучение чувствительности и специфичности ПЦР-тест-системы для выделения и идентификации кампилобактерий подвида jejuni 160-166
2.2.7. Конструирование питательной среды для выделения и культивирования кампилобактерий 166-179
2.2.7.1. Сравнительное изучение разных питательных сред для культивирования кампилобактерий 166-168
2.2.7.2. Определение оптимального состава питательной среды на основе гидролизатов казеина 168-170
2.2.7.3. Изучение селективных свойств СПК 170-171
2.2.7.4. Изучение селективных и ростообеспечивающих свойств СПК с использованием биологического материала 172-173
2.2.7.5. Сравнительное изучение ростообеспечивающих и селективных свойств СПК и сред для кампилобактерий фирмы "Oxoid" 173-174
2.2.7.6. Сравнительное изучение ро сто обеспечивающих и селективных свойств СПКиМППА 174-179
Обсуждение результатов собственных исследований 179-197
Выводы 197-199
Практические предложения 199-200
Список литературы 200-244
Приложение 245-271
- Краткая историческая справка
- Диагностика кампилобактериоза животных
- Выделение геномной ДНК из исследуемого материала
Введение к работе
Актуальность темы
Бруцеллез (Brucellosis) и кампилобактериоз (Campylobacter iosis) - инфекционные болезни животных и человека, вызываемые патогенными микроорганизмами рода Brucella и рода Campylobacter.
Основой успешной борьбы с бруцеллезом и кампилобактериоз ом является их ранняя диагностика. Однако, особенности течения бруцеллезной инфекции, несмотря на многообразие применяемых средств и методов диагностики, не позволяют при однократном исследовании выявить всех больных бруцеллезом животных (Триленко П.А., 1976; Сочнев В.В., 1984; Коси-лов И.А. и др., 1999; Corbel MJ, 1997; Григорьева Г.И. и др., 1998; Ощепков В.Г. и др, 2004; и другие). Причем, бактериологическая диагностика бруцеллеза весьма трудоемкая и продолжительная по времени выполнения. Серологическая диагностика - осложняется антигенным родством между бруцел-лами и другими микроорганизмами, в частности Yersinia enter ocolltica, что обусловливает получение ложиололожительных реакций, кроме того, она не позволяет дифференцировать антитела синтезированньте на полевые культуры и вакцинные штаммы бруцелл (Желудков М.М., 1981; Мельниченко Л.П., 1995; Альбсртян М.П., 1996). Традиционно применяемые диагностические методы не позволяют оперативно дифференцировать бруцеллы на уровне видов и штаммов, что затрудняет проведение эпизоотологиче-ского и эпидемиологического анализа и рациональное использование средств специфической профилактики бруцеллеза.
Многое из вышеперечисленного имеет место и при диагностике кам-пилобактериоза животных. Тем более что выделение кампилобактерий представляет определенные трудности, обусловленные их микроаэрофиль-ностью, капнофифильностью и неспособностью выдерживать конкуренцию в смешанных культурах (Триленко П.А., 1961; Чайка НА., 1988; Шумилов К.В. идр, 1999).
Несовершенство диагностики бруцеллеза и кампилобактериоза на современном этапе подтверждает актуальность исследований, посвященных изучению возможности применения для диагностики этих болезней моле-кулярно-генетических экспресс-методов, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ).
Цель и задачи исследований
Целью настоящей работы явилась разработка тест-систем для диагностики бруцеллеза и кампилобактериоза животных с помощью молекулярно-генетических методов и разработка питательной среды для кампилобакте-рий.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
- подобрать праймеры и определить оптимальные условия проведения ПЦР с использованием культур бруцелл и кампилобактерий;
- изучить аналитическую чувствительность и специфичность ПЦР в сравнении с бактериологическими методами исследования с использованием культур бруцелл всех видов, культур кампилобактерий видов и подвидов, имеющих значение в этиологической структуре кампилобактериоза животных;
- изучить диагностическую эффективность и специфичность ПЦР в сравнении с серологическими и бактериологическими методами исследований, с использованием патологического материала от животных из хозяйств с разным эпизоотическим статусом по бруцеллезу;
- оценить возможность проведения прижизненной диагностики бруцеллеза животных методом ПЦР и применения этого метода для постановки окончательного диагноза на бруцеллез;
- адаптировать для практического применения молекулярно- генетические методы типирования бруцелл на уровне видов и штаммов;
- разработать стандартную питательную среду для кампилобактерий;
- изучить ростообеспечиаающие свойства питательной среды с использованием культур кампил об актер ий разных подвидов;
- изучить ростообеспечивающие свойства экспериментальной питательной среды с использованием биологического материала от животных, инфицированных кампилобактериями;
- провести сравнительное изучение свойств экспериментальной питательной среды и лучших отечественных и зарубежных аналогов.
Научная новизна Впервые в Российской Федерации:
- разработана диагностика бруцеллеза и кампилобактериоза животных с помощью молекулярно-генетических методов;
- разработана тест-система "БРУ-КОМ" для диагностики бруцеллеза животных методом ПЦР и изучена ее аналитическая чувствительность, специфичность и диагностическая эффективность в сравнении с бактериологическими и серологическими методами;
- предложена и апробирована новая система видовой дифференциации бруцелл и идентификации вакцинного штамма В. abortus 19 с помощью ШДР и ПЦР-ПДРФ анализа;
- разработана тест-система "КАМ-ВАК" для диагностики и для индикации C.jejuni.s.jejuni и изучена ее аналитическая чувствительность и специфичность.
Практическая значимость Внедрение в лабораторную ветеринарную практику молекулярно-генетических методов диагностики бруцеллеза с видовой и штаммовой дифференциацией бруцелл и диагностики кампилобактериоза животных, а также сконструированной нами питательной среды для кампилобактерий позволяет существенно сократить затраты времени и средств на диагностику указанных заболеваний, повысить эффективность исследований и исключить получение при этом ложноположительных результатов.
Апробация полученных результатов
Материалы диссертации доложены;
- в годовых отчетах отдела препаратов против хронических болезней животных на заседаниях Ученого совета ФГУ "ВГНКИ" в 1996-2004 гг.;
- на заседаниях научно-проблемной методической комиссии по контролю и стандартизации препаратов, применяемых при бактерийных и грибковых болезнях животных ВГНКИ (1996-2004 гг.);
- на семинарах специалистов бактериологов и серологов краевых и областных ветеринарных лабораторий Российской Федерации (ЦНМВЛ, 2004-2005 гг.);
- на конференции, посвященной 100-летию открытия вируса ящура "Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных". Владимир, 27-31 октября 1997 г.;
- на 2-й Всероссийской научно-практической конференции "Полиме-разная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний". Москва, 20-22 января 1998 г.;
- на Всероссийской научно-производственной конференции "Разработка и освоение производства нового поколения лекарственных средств для животных и их применение в ветеринарной практике". Ставрополь, 20-21 июня 2000 г.;
- на Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы патологии сельскохозяйственных животных". Минск, 2000 г,;
- на Всероссийской научной конференции "Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов", посвященной 70-летию со дня организации ВГНКИ, Москва, 14-15 февраля 2001 г.;
- на V11I съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва, 2002 г.;
- на 4-ой Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных заболеваний". Москва, 22-24 октября 2002 г.;
- на 5-й Всероссийской научно- практической конференции "Генодиагностика инфекционных болезней". Москва, 19-21 октября 2004 г.;
- на Международной производственной конференции "Актуальные проблемы эпизоотологии на современном этапе" СПб, 2004 г.;
- на Международной научно-практической конференции "Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных". Воронеж, 21-23 сентября 2004 г.;
- на межлабораторном совещаниии сотрудников ФГУ "ВГНКИ". Москва, 18 октября 2005 г.
По результатам исследований составлены заключительные отчеты о НИР:
- "Разработка тест-систем с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) для диагностики бруцеллеза, кампилобактериоза животных" (ВГНКИ), 2001.
- "Селекционирование штаммов Yersinia enterocolllica для изготовления иерсиниозных диагностикумов и противоиерсиниозной вакцины. Разработка методов изготовления, стандартизации, контроля и применения препаратов для диагностики иерсиниоза сельскохозяйственных животных" (ВГНКИ), 2001.
Разработанные ПЦР-тест-системы и питательная среда для кампило-бактерий были испытаны комиссионно:
- "Тест-система для диагностики бруцеллеза у сельскохозяйственных животных методом полимеразной цепной реакции" - 18.12.1995 г. в соответствии с распоряжением Департамента ветеринарии Минсельхозпрода РФ № 32 от 16.10.1995 г.;
- "Тест-система для диагностики кампилобактериоза {Campylobacter jejuni) методом полимеразной цепной реакции" - в период с 15.07.99 по 28.07.99 г. в соответствии с распоряжением Департамента ветеринарии Минсельхозпрода РФ № 2 от 13.02.1998 г.;
- "Среда питательная для кампилобактерий" - в период с 15.04.2000 по 17.05.2000 г. в соответствии с распоряжением Департамента ветеринарии Минсельхозпрода РФ № 9 от 3.04.2000 г.
Публикация результатов исследований
Материалы диссертации опубликованы в 31 научной статье.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 271 странице компьютерного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложение.
Работа иллюстрирована 40 таблицами и 25 рисунками, библиографический список включает в себя 372 наименования, в том числе 183 иностранных.
Основные положения, выносимые на защиту
Чувствительность, специфичность и диагностическая эффективность тест-системы "БРУ-КОМ" в сравнении с серологическими и бактериологическими методами с использованием культур бруцелл всех видов, бактерий, имеющих с ними антигенное родство и материала от животных из хозяйств с разным эпизоотическим статусом по бруцеллезу.
Молекулярно-генетическая дифференциация бруцелл на уровне видов и дифференциация вакцинного штамма № 19 В. abortus от изолятов и штаммов бруцелл разных видов.
Чувствительность и специфичность тест-системы "КАМ-БАК" с использованием культур кампилобактерий, имеющих значение в этиологической структуре кампилобактериоза животных и патологического материала от животных, инфицированных кампилобактериями.
Ростообеспечивающие свойства среды питательной для кампилобак терни (СПК) в сравнении лучшими отечественными и зарубежными аналогами.
Краткая историческая справка
Бруцеллез (Brucellosis) - хроническое заболевание многочисленных видов животных и человека, вызываемое бактериями рода Brucella. Восприимчивость к бруцеллезу зарегистрирована у 60 видов позвоночных. Бруцелл выделяли от 30 видов кровососущих клещей, двух видов блох, двух видов комаров, а также у домовых мух; рептилий, амфибий и даже рыб.
У сельскохозяйственных животных болезнь имеет тенденцию к широкому распространению и проявляется в виде массовых абортов, бесплодия и яловости, уменьшения продуктивности, снижения жизнеспособности приплода. Все это, с учетом того, что ликвидация бруцеллеза требует затраты значительных сил и средств, наносит существенный экономический ущерб животноводству.
Ущерб, причиняемый бруцеллезом, усугубляется заболеванием людей, которое зачастую ведет к потере трудоспособности и часто к пожизненной инвалидности.
Описание болезни людей, сходной по клиническим признакам с бруцеллезом, относится к пятому веку до нашей эры.
Особое значение в истории изучения болезни имеет 1887 год, в котором английский военный врач Брюс (Bruce) на Мальте выделил из селезенки одного из 4 погибших солдат, больных "мальтийской " или " средиземноморской " или "упдулирующей" лихорадкой, возбудителя, названного впоследствии Micrococcus melitensis (365).
Хыогс (Hugues), работая вместе с Брюсом, изучил и описал клинику болезни (365).
Райт (Wright) установил, что сыворотка крови больных людей склеивает микрококки, выделенные Брюсом (Micrococcus melitensis) (365).
Банг и Стриболт (Bang and Stribolt) в 1897 г. в Дании (57) изучали эпизоотические аборты коров и изолировали из матки коровы "абортоген-ную бациллу" (бациллу Банга), в 1902 году переименованную в Bacterium abortus (365).
Этиология заболевания человека оставалась неясной до тех пор, пока Заммит и Хоракс (Zammit and Horrocks), работавшие в 1904 - 1907 гг. в составе английской экспедиции по изучению средиземноморской лихорадки, не обнаружили эти бактерии в молоке клинически здоровых мальтийских коз, установив, таким образом, их роль в заражении человека (365).
Позже, в 1911 году, идентичные бактерии были обнаружены в коровьем молоке Шредером и Катоиом (Schroeder and Cotton), Смитом и Фабье-ном (Smith and Fabyan) (365). Тром (Traum) изолировал возбудителя, похожего на бактерии, описанные Бангом, от недоношенных поросят с фермы в Индиане (США), где были зарегистрированы аборты у свиноматок (365).
Эванс (Evans) в 1918 г. первой показала существование родства между Micrococcus melitensis (365) и Bacterium abortus (57).
Мир и Шав (Meyer and Shaw) (365), подтвердив и дополнив работы Эванс, предложили создать род Brucella, объединяющий 2 вида: Brucella abortus и Brucella melitensis.
Однако потребовались еще долгие годы, пока роль этих бактерий в патологии человека была единогласно признана (365).
После введения Хеддельсоном (Huddleson) методов более точной дифференциации бактерий внутри рода, возбудитель, выделенный Тромом (Traum) в 1914г. и рассматривавшийся как свиной вариант В- abortus., был назван В. suis (263).
Уилсон (Wilson), используя методы, предложенные Хеддельсоном, и реакцию агглютинации с моноспецифическими сыворотками, первым ввел понятие биотип (365).
В 1966 году Подкомитет по таксономии бруцелл принял новый вид В. neotomae. Возбудитель был выделен Стоннером и Лэкмэном (Stoenner and Lackman) в 1957 году от Neotoma leoida Thomas - мелких грызунов класса мышиных из пустынных областей штата Юта (США) (365).
В. ovis, возбудитель инфекционного элидидимита баранов, был впервые выделен Баддл и Сойзом (Buddie and Soyes) в 1953 году в Новой Зеландии и официально признан в 1970 году (365).
Возбудитель, ответственный за эпизоотические аборты у сук, предложен Кармайклом и Брюнером (Carmichael and Bruner) в 1968 в качестве нового вида В. cams и принят окончательно под таким названием в 1978 году (365).
Вопрос о классификации возбудителей бруцеллеза неоднократно подвергался обсуждению, и по этому поводу высказаны противоречивые точки зрения. С учетом высокой гомогенности возбудителей рода Brucella предложения об объединении его в один генетический вид продолжают обсуждаться и в настоящее время (314). Однако, классификация, предложенная Verger (206), в которой все виды должны рассматриваться как биовары В. melitensis, не принята по ряду практических причин. В настоящее время принята таксономия, согласно которой род Brucella подразделяют на 6 видов: В. abortus, В. melitensis, В. suis, В. neotomae, В. ovis и В. canis.
В свою очередь В. abortus включает 7 биоваров, В. melitensis - 3 биовара, В. suis - 5 биоваров (229). Другие виды на биовары не дифференцируются. Штаммы, изолированные от морских млекопитающих относительно недавно, пока неофициально обозначены, как В. maris (334). Настоящая таксономическая схема разделения бруцелл представляет определенные практические удобства, имеет эпизоотическое и эпидемиологическое значениє и отражает несомненный факт, что разные виды бруцелл обнаруживают преимущественную адаптацию к определенному виду животных и что бру-целлы вида melilensis особенно опасны для людей (15,130).
Диагностика кампилобактериоза животных
Методы диагностики кампилобактериоза активно разрабатывали и разрабатываю! во многих странах мира. Согласно результатам этих разработок, при постановке диагноза основными методами являются бактериологические, что же касается иммунобиологических методов, то лишь некоторые из них нашли применение в лабораторной ветеринарной практике. В частности, достаточно широкое распространение получила RA. с вагинальной слизью коров, но только как метод оценки благополучия по кампилобактериозу животных всего хозяйства (158, 318). Антитела выявляются в этой реакции через 30-60 дней после заражения животных. В последующем некоторые животные остаются серопозитивными по данным этой же реакции в течение 2 - б месяцев, другие - в течение ряда лет. В среднем агглютинины регистрируют у 50 % животных. Кроме того, при исследовании слизи от коров с воспалением органон воспроизводства нскампилобактериозной этиологии возможно получение ложнопиложитедъных результатов (221 э 223).
Также с ориентировочной целью при диагностике кампилобактериоза применяется люминесцептно-серологический метод с использованием лю-минесцирутощих кампилобактериозных сывороток. Метд позволяет идеи тифицировать кампилобактерии вида fetus (без дифференциации подвида fetus от подвида venerealis) и подвида bubulus (307).
По разным причинам серологические методы используются в лабораторной ветеринарной практике не слишком широко, В частности, по причине отсутствия у исследователей единого мнения о величине диагностических тигров этих реакций и из-за получения в некоторых случаях ложноположи-телъных результатов. Сложность применения РА с использованием кампюто-бактериозных антигенов и сыворотки крови коров связана также и с гем, что, по мнении? ряда авторов, эта реакция штаммоспецифическая, то есть наиболее высокие титры могут быть получены, если сыворотки крови больных животных исследуются с применением антигенов из аутоштаммов или смеси штаммов.
В отличие от РАЭ реакция связывания комплемента (РОС) при кампи-лобактериозе является видоспецифической, кроме того, при постановке реакции с использованием кампилобактериозных сывороток к антигенам одного вида с антигенами кампилобактерий других видов и микроорганизмов других родов, например., бруцелл или иерсиний, перекрестных реакций, как правило, не наблюдается.
Реакцию длительного связывания комплемента при диагностике кам-пилобактериоза впервые применил Триленко ПА (158) , а затем Ручий Г.А. и Зяблин А.С. (140). По данным Триленко ПА, это наиболее достоверная серологическая реакция при диагностике камнилобактериона. Однако низкие диагносги4сские тигры, приближающиеся к неспецифическим, затрудняют ее использование в практике (158).
Более высотой чувствительностью, в сравнении с вышеперечисленными реакциями, обладает РИГА. В 1975 году Демченко Г,Г. разработал методику приготовления эритроцитарного антигена для исследования в РИГА на кампилобактериоз сыворотки крови животных (45).
Определенный интерес представляют сообщения об использовании для диагностики кампилобактериоза высокочувствительного метода имму-ноферментного анализа (95, 265).
Hum S. et al. разработана диагностика кампилобактериоза (venerealis) методом ИФА, позволяющая выявлять преимущественно IgA во влагалищной слизи. При исследовании материала от 241 стада коров с бесплодием и абортами кампилобактериоз был подтвержден на 84 фермах (34,8 %), и подозревался на остальных 27 фермах (11,2 %). Специфичность метода составила 98,5 %, но чувствительность из-за отсутствия надежного сравнительного метода оценить не удалось. Вакцинация против камиилобак-териоза не оказывает влияния на результаты теста, потому что во влагалищной слизи иммунизированных коров присутствуют преимущественно IgC. Тем не менее, в связи с возможностью ложных реакций, обусловленных колебаниями состава антител у отдельных коров, метод рекомендован для оценки состояния но кампилобактериозу всего стада (265).
Весьма перспективным в диагностике кампилобактериоза представляется обнаружение в реакции ИФА жгутикового антигена Campylobacter jejuni и Campylobacter colt в собачьих фекалиях. Извлечение кислотораство-римых белков из фекальных проб и последующее тестирование с использованием определенных разновидностей моноклональных антител в ЙФА позволило обнаружить все зараженные С. jejuni или С coli пробы по сравнению с прямым отбором фекалий для культивирования. Количество ложно-положительных результатов - 1 из 18 (5,6 %) и, соответственно, специфичность 94,4 %. Предполагается, что процедура скрининга с целью обнаружения флагеллярного антигена С. jejuni и С. соН в пробах собачьих фекалий при дальнейшей разработке может быть диагностической альтернативой культивированию (313),
В нашей стране для диагностики кампилобактериоза ЖИВОТНЫХ применяют клинико-эпизоотологический, иммунобиологические и бактериологические методы (130).
Выделение геномной ДНК из исследуемого материала
Для исследования методом ПЦР каждый образец патологического материала от животных отбирали отдельным набором инструментов. Пробы паренхиматозных органов, размером І І Іем, а лимфатические узлы целиком, помещали в прифламбированные ступки и измельчали ножницами. Затем материал в ступках тщательно растирали с прокаленным битым стеклом и 5-15 мл физиологическош раствора. Образовавшуюся смесь отстаивали при комнатной температуре в течение 30 мин, затем верхнюю фазу 0,4-0,5 мл переносили в пробирки типа «эппендорф» вместимостью 1,5 мл и использовали для выделения ДНК.
Пробы пельной крови отбирали в пробирки с трилоном Б (ЭДТА) в соотношении 10:1 и использовали для выделения ДНК без предварительной подготовки.
В разделе "Результаты собственных исследований" приведен еще один более простой и эффективный способ отбора материала и подготовки его к исследованию.
Выделение геномной ДНК из исследуемого материала Для выделения ДНК из суспендированных бактериальных клеток брали по 10 мкл суспензии, для выделения ДНК из клинических образцов (суспензия паренхиматозных органов, кровь) по 100 мкл обработанного материала.
1. К пробе добавляли 300 мкл лизирующего раствора (65% -ый гуани-дин тиоционат, 1 ОмМ Трис - HCL (рН =1Л), 1 мМ ЭДТА (рН -8,0), 1 % Три-тон-Х-100), тщательно перемешивали смесь на вортексе. прогревали 4 мин при 65 "С. Еще раз перемешивали содержимое пробирок на вортексе.
2. В каждую пробирку вносили 20 мкл суспензии сорбента (40% -ый SiCb) отдельным наконечником, хорошо перемешивали смесь на вортексе и оставляли пробирки в штативе на 2 мин для осаждения сорбента. Повторно перемешивали содержимое пробирок на вортексе и оставляли последние в штативе на 10 - 12 мин для осаждения сорбента (каждые 2 мин смесь перемешивали),
3. Сорбент осаждали на микроцентрифуге при 5 тыс. об./мип в течение 30 с и отбирали супернатант из каждой пробирки отдельным наконечником.
4. Вносили по 300 мкл отмывочного раствора № 1 (48% гуанпдинтпо-ционат, ЮмМ Трис - UCL (рН =7Д), 1 мМ ЭДТА (рН =8,0), 1% Тритон - X -100), тщательно перемешивали смесь на вортексе и вновь осаждали в прежнем режиме. Удаляли супернатант из каждой пробирки отдельным наконечником.
5. В каждую пробирку вносили по 500 мкл отмывочного раствора № 2 (50 % этанол, 50 NaCL: 10 мМ Трис - HCL (рН -7,4), 1мМ ЭДТА (рН -8,0); ресуспендировали па вортексе, осаждали на микроцептрифуге при 10000 об./мин, в течение 30 сек и удаляли супернатант. Повторяли процедуру отмывки раствором № 2.
6. Супернатант отбирали и высушивали осадок сорбента, открыв крышки пробирок, в термостате при 65 С в течение 10 мин.
7. В пробирки вносили по 50 мкл элюирующего ТЕ-буфера (10 мМ Трис-НС1? 1 мМ ЭДТА). Смесь ресуспендировали, помещали в термостат на 5-6 мин при 65 С, встряхивая на вортексе через каждую минуту.
8. Осаждали сорбент на микроцентрифуге при 13000 об ./мин в течение 2 мин. Супернатант содержал очищенную ДНК, которую использовали в проводили с применением "горячего старта" (hot start) (177). Hot start - один из вариантов постановки ПЦР. основанный па искусственном разделении компонентов реакционной смеси до начала реакции. Реакционную смесь разделяют на нижнюю и верхнюю. В состав нижней смеси входят смесь дезоксинуюіеотидтрифосфатов в количестве 2 мМ, вода и праймеры в определенной концентрации. Верхнюю смесь составляют 67 мМ Трис-НС!, 17 мМ (N1-14)2S04; 0,1% Твин-20, 0Л2 мг/мл ЬСА, 8% глицерин при разных концентрациях MgCb и фермента Tbg-полимеразы. Между нижней и верхней смесью находится прослойка воска, которая препятствует перемешиванию реагентов при комнатной температуре. Такая процедура необходима, так как при комнатной температуре (20-25 С) возможен неспецифический отжиг праймеров па любой одноцепочечной молекуле ДІДС и также процесс элонгации, благодаря активности Tag - полимеразы. При использовании "hot start" амплификация начинается непосредственно в момент расплавления воска, т. е. при 95 С. Поэтому при постановке ПЦР сначала в каждую пробирку вносят нижнюю смесь (5 мил), затем воск ()] мкл) и верхнюю смесь (10 мкл). На реакционную смесь наносят одну каплю минерального масла (масло предотвращает испарение воды из реакционной смеси). В последнюю очередь в каждую пробирку отдельным наконечником добавляют матричную ДНК (10 мкл).
