Содержание к диссертации
Введение
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
2.1. История открытия болезни, этиология и мировое распространение РРСС 13
2.2. Таксономия, физико-химическая и молекулярно-генетическая характеристика вируса РРСС 16
2.3. Культивирование вируса РРСС in vitro 18
2.4. Репликация, вирусные белки и патогенез болезни 19
2.5. Биологическая и генетическая вариабельность вируса РРСС 21
2.6. Средства и методы лабораторной диагностики РРСС 23
2.6.1. Прямое обнаружение вирусных антигенов в тканях и органах заражённых животных 23
2.6.2. Изоляция и идентификация вируса РРСС 23
2.6.3. Методы обнаружения вирусного генома 24
2.6.4. Характеристика и диагностическая ценность методов обнаружения вирусспецифических антител 25
2.6.4.1. Иммуно-гистохимические методы анализа 26
2.6.4.2. Методы твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) 26
2.6.4.3. Реакция нейтрализации 27
2.6.4.4. Специфические иммуноглобулины М и диагностическая ценность их обнаружения 28
2.6.4.5. Интерпретация результатов серологических исследований 30
Заключение по обзору литературы 32
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 34
3.1. Материалы 34
3.1.1. Штаммы и изоляты вируса РРСС 34
3.1.2. Животные 34
3.1.3. Культуры клеток 35
3.1.4. Питательные среды и добавки к ним 35
3.1.5. Специфические иммунные сыворотки 35
3.1.6. Моноклональные антитела 36
3.1.7. Белки и ферменты 36
3.1.8. Матрицы для гель-фильтрации 36
3.1.9. Кислоты, основания, соли 36
3.1.10. Растворители 36
3.1.11. Красители и хромогенные субстраты 36
3.1.12. Детергенты 36
3.1.13. Реактивы 36
3.1.14. Исходные водные растворы 37
3.1.15. Диагностические препараты 38
3.1.16. Оборудование 38
3.2. Методы 39
3.2.1. Получение альвеолярных макрофагов свиньи 39
3.2.2. Выделение вируса РРСС из проб органов заражённых свиней 40
3.2.2.1. Подготовка проб 40
3.2.2.2. Инокуляция исследуемым материалом культур клеток, идентификация вируса 40
3.2.2.3. Титрование вируса РРСС 41
3.2.2.4. Биопроба 41
3.2.3. Определение концентрации белка 42
3.2.4. Приготовление конъюгатов 42
3.2.5. Серологические реакции, иммуногистохимические методы 43
3.2.5.1. Реакция непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) 43
3.2.5.2. Гистохимический вариант ИФА (ГХ-ИФА) 43
3.2.5.3. Твердофазный вариант ИФА (ТФ-ИФА, ELISA) 43
3.2.6. Обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) 45
3.2.6.1. Выделение вирусной РНК 45
3.2.6.2. Синтез кДНК 45
3.2.6.3. Постановка ПЦР 45
3.2.6.4. Электрофорез продуктов ПЦР 46
3.2.7. Статистическая обработка результатов исследований 46
4. Результаты собственных исследований 47
4.1. Репродукция вируса РРСС европейского и американского вариантов в различных культуральных системах in vitro 47
4.2. Экспериментальное воспроизведение РРСС с использованием вируса европейского и американского вариантов 51
4.3. Разработка непрямых вариантов иммуно-гистохимического анализа для обнаружения ранних антител (IgM) к вирусу РРСС 55
4.3.1. Получение IgM интактной свиньи 55
4.3.2. Получение иммуноглобулинов анти IgM свиньи 56
4.3.3. Приготовление конъюгата ФИТЦ- анти- IgM свиньи 57
4.3.4. Приготовление конъюгата ПХ- анти- IgM свиньи 59
4.3.5. Определение активности и специфичности конъюгатов (ФИТЦ- анти-IgM и ПХ- анти- IgM ) для обнаружения антител IgM к вирусу РРСС непрямыми методами иммуно-гистохимического анализа 59
4.4. Разработка метода серологической дифференциации европейского и американского вариантов вируса РРСС и специфических антител.. 62
4.5. Оценка методов обнаружения вируса, генома и специфических антител при экспериментальной РРСС-инфекции 66
4.5 1. Оценка чувствительности тест-систем ОТ-ПЦР для обнаружения РНК вируса РРСС 66
4.5.2. Обнаружение специфических РРСС IgM и IgG в сыворотках крови экспериментально зараженных свиней 69
4.5.3. Сравнительные результаты оценки методов изоляции вируса (АМС), обнаружения генома (ОТ-ПЦР) и специфических антител (РНИФ, ГХ-ИФА, ТФ-ИФА) 72
4.6. Оценка лабораторных методов диагностики РРСС в свинокомплексах с различным эпизоотологическим статусом 75
4.6.1. Серологический скрининг популяций домашних свиней благополучного и неблагополучного свинокомплексов по РРСС 75
4.6.2. Оценка методов лабораторной диагностики РРСС при острой вспышке болезни 80
4.6.2.1. Эпизоотологическая характеристика свинокомплекса 80
4.6.2.2. Динамика инцидентности абортов, клинические симптомы и макроскопические изменения 81
4.6.2.3. Лабораторные исследования 85
4.6.2.4. Результаты лабораторных диагностических исследований 85
4.7. Схема лабораторной диагностики РРСС 88
5. ОБСУЖДЕНИЕ 92
6. ВЫВОДЫ ПО
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 111
8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 112
ПРИЛОЖЕНИЯ 135
- История открытия болезни, этиология и мировое распространение РРСС
- Специфические иммунные сыворотки
- Репродукция вируса РРСС европейского и американского вариантов в различных культуральных системах in vitro
Введение к работе
Репродуктивный и респираторный синдром свиней (РРСС) - контагиозная вирусная болезнь, характеризующаяся абортами в конце срока супоросно-сти, рождением мертвых и/или слабых поросят, погибающих в первые 2-3 недели жизни, и поражением органов дыхания у поросят в постотъёмный период (23, 45, 200). Вирус чаще циркулирует в изолированных фермах с полным циклом и промышленных свинокомплексах, наносит значительный экономический ущерб из-за репродуктивных потерь и низкой сохранности новорожденных и поросят на доращивании (15).
В настоящее время, на основании имеющихся сведений о вирусе и патогенезе болезни рутинные диагностические исследования базируются на использовании серологических методов для обнаружения специфических антител и обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) для обнаружения генома (200). Так, при типичных случаях (т.е. наличии эпизоотологи-ческих данных, клинических признаков) в хозяйстве с полным циклом при отсутствии вакцинации, первичного обнаружения генома вируса РРСС и специфических антител, особенно у поросят группы доращивания, достаточно для подтверждения диагноза, а обследуемая ферма (хозяйство) считается неблагополучной по РРСС (36, 61). Однако, результаты исследований, выполняемых на основе использования коммерческих диагностических наборов «РРСС-Серотест» производства НПО НАРВАК, широко используемого в РФ, «HerdChek PRRS 2XR» фирмы IDEXX (США) и др., не позволяют идентифицировать группы недавно зараженных животных в неблагополучной ферме, потому что реакции предназначены для обнаружения только специфических антител к вирусу РРСС класса IgG. Недостаточная информативность существующих серологических методов не позволяет использовать их для совершенствования стратегии и тактики борьбы с болезнью. Учитывая энзоотичность РРСС в свиноводческих хозяйствах, особенно с полным циклом, перспективным направлением для совершенствования мер борьбы с болезнью является разработка серологического метода для выявления животных на ранних стадиях заражения, являющихся источником вируса, а именно, обнаружение специфических вирусу РРСС ранних антител класса IgM. Несмотря на широкое использование методов обнаружения ранних антител в медицинской вирусологии, сведения о диагностическом значении специфических антител класса IgM в ветеринарии, в том числе и при РРСС, ограничены лишь несколькими работами (117, 166).
До последнего времени считалось, что в странах Европы (за исключением Дании) циркулируют изоляты вируса РРСС европейского генотипа, а в Северной Америке и странах Азии - американского. По данным литературы, в свиноводческих хозяйствах РФ циркулируют изоляты, относящиеся только к европейскому генотипу вируса РРСС (16). Однако, с учетом значительных закупок племенных свиней из стран Европы и Северной Америки, а также применения в течение нескольких лет живой вакцины из штамма «БД» американского варианта (181), ситуация может измениться, и поэтому с целью контроля заноса вируса РРСС американского варианта актуальным является серологический мониторинг свиней как неблагополучных, так и благополучных хозяйств на присутствие антител к американскому варианту вируса.
Таким образом, несмотря на существенные достижения в изучении вируса и вызываемой им болезни, применение существующих средств специфической профилактики и мер борьбы не всегда дает успех, так как эффективные вакцины отсутствуют, а длительная персистенция, различные формы проявления болезни и циркуляция генетически различных европейского и американского вариантов вируса РРСС приводят к необходимости повысить эффективность серологических исследований и улучшить схему лабораторных диагностических исследований.
1.2. Цель и задачи исследования
Целью данных исследований являлось совершенствование и оценка средств и методов лабораторной диагностики репродуктивного и респираторного синдрома свиней. В соответствие с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:
- изучить репликацию вируса РРСС европейского и американского вариантов в клеточных культурах различного происхождения;
- разработать модифицированные методы иммуногистохимического анализа (РНИФ, ИФА) для обнаружения специфических вирусу иммуноглобулинов класса М в сыворотках крови инфицированных свиней;
- разработать метод для серологической дифференциации европейского и американского вариантов вируса РРСС;
- изучить диагностические характеристики лабораторных методов диагностики РРСС в эксперименте и при исследовании полевого патологического материала;
- разработать схему проведения лабораторных диагностических исследований при подозрении РРСС.
1.3. Научная новизна работы
Усовершенствованы методики получения диагностических препаратов и постановки реакции непрямой иммунофлуоресценции для обнаружения ранних специфических антител класса IgM к вирусу РРСС в сыворотках крови заражённых свиней и животных - вирусоносителей.
Усовершенствован метод идентификации в сыворотках крови инфицированных свиней специфических антител к вирусу РРСС американского и европейского вариантов.
Разработана схема лабораторных диагностических исследований при подозрении РРСС.
1.4. Практическая значимость результатов исследований
Разработанная реакция непрямой иммунофлуоресценции пригодна для обнаружения инфицированных свиней на ранней стадии заражения вирусом РРСС и вирусоносителей и может быть включена в схему лабораторных исследований и проведения мероприятий при совершенствовании мер борьбы с РРСС в хозяйствах с полным циклом и свинокомплексах промышленного типа. Разработанные Методические указания по идентификации антител к европейскому и американскому вариантам вируса респираторного и репродуктивного синдрома свиней могут использоваться при проведении диагностических исследований в случае подозрения заноса вируса РРСС американского варианта.
На основании результатов оценки диагностических методов (изоляции вируса, обнаружения генома, а также специфических антител) усовершенствована схема лабораторных исследований на РРСС как при подозрении заноса вируса, так и в неблагополучных хозяйствах.
1.5. Основные положения, выносимые на защиту
- метод обнаружения ранних специфических антител к вирусу РРСС класса IgM на основе непрямых вариантов иммуногистохимического анализа и диагностическое значение обнаружения специфических антител класса IgM;
- серологический метод идентификации антител европейского и американского вариантов вируса РРСС в крови инфицированных свиней и его практическое значение;
- диагностическая характеристика методов обнаружения вируса, генома и специфических антител при исследовании экспериментальных и полевых материалов от заражённых вирусом РРСС разной патогенности животных и усовершенствованная схема лабораторной диагностики болезни.
1.6. Апробация работы и публикация результатов
Материалы исследований были доложены на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 1 статья в журнале «Ветеринария».
1.7. Личный вклад соискателя
Представленные в диссертационной работе материалы получены, проанализированы и обработаны автором самостоятельно. Практическую и консультативную помощь при изготовлении конъюгатов анти-IgM свиньи оказал д.б.н. Новиков Б.В. (ГНУ ВНИИВВиМ). 1.8. Структура и объём диссертации
Диссертация изложена на 134 страницах и содержит следующие разделы:
введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список литературы, приложения. Список литературы включает 209 источников, в том числе 39 отечественных и 170 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 19 рисунками и 15 таблицами.
1.9. Благодарности
Автор выражает искреннюю благодарность д.б.н., заведующему лаборатории Иммунологии Новикову Борису Валентиновичу; к.б.н., ведущему научному сотруднику лаборатории Диагностики Балашовой Елене Алексеевне; к.б.н., ведущему научному сотруднику лаборатории Диагностики Новиковой Марине Борисовне; лаборантам лаборатории Диагностики Макарычевой Елене Валерьевне и Малышковой Любовь Петровне за помощь при выполнении диссертационной работы. Автор выражает особую благодарность Бунькову Алексею Васильевичу за его терпение и поддержку.
Работа выполнена в лаборатории Диагностики в период с 2003 по 2007 гг. по плановым тематикам ВНИИВВиМ при выполнении Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития АПК Российской Федерации (шифр 01.).
История открытия болезни, этиология и мировое распространение РРСС
В 1987 году в США появились сообщения о «таинственной болезни свиней» - острой репродуктивной патологии, характеризующейся массовыми абортами на поздней стадии супоросности, снижением общего количества жизнеспособных поросят в результате рождения мертвых и слабых поросят, нарушением полового цикла у свиноматок, снижением либидо у хряков, а также высоким уровнем смертности из-за респираторных нарушений у поросят в группах доращивания (37, 69, 111, 144). Через 4 года после появления первого сообщения признаки болезни были обнаружены у свиней от 60 до 80% ферм страны (209).
В конце 80-х - начале 90-х годов прошлого столетия эпизоотии болезни со сходными клиническими признаками были зарегистрированы в Канаде (81), Японии (175), Германии (127), Нидерландах, Испании, Франции и Великобритании (192, 196, 144), Дании (62), и начиная с 1992 г. - в остальных регионах мира с развитым промышленным свиноводством (145). Болезнь имела все признаки, присущие инфекции, и ее распространение было связано с перемещением животных при коммерческих сделках и племенной работой, а также через транспортные средства, аэрогенно, и другими путями (79, 81).
Болезнь стали называть "синее ухо" (у некоторых пораженных свинок и свиноматок во время переболевания отмечали синюшность в области шеи и живота, а также ушей), "синдром бесплодия и абортов свиней", "эпидемический аборт и респираторный синдром свиней" и "таинственная болезнь свиней" (79, 81,93,98,100, 190,196).
Хотя эпизоотологические данные даже первых случаев болезни позволяли предположить ее инфекционную природу, вирус как этиологический агент был окончательно идентифицирован только через несколько лет (78, 192). Первый шаг в установлении вирусной этиологии возбудителя РРСС был сделан в 1990 г. Collins и др., которые воспроизвели респираторную форму болезни, за 14
разив восприимчивых свиней фильтратом гомогенизированных тканей от больных животных (79). Около года спустя исследователи из Центрального Ветеринарного Исследовательского института (г. Лелистад, Нидерланды) воспроизвели репродуктивную форму болезни вирусом, выделенным от больных животных с использованием культуры альвеолярных макрофагов свиней, который назвали как вирус Lelystad (LV) (184, 192). Вскоре после этого подобные результаты получены американскими исследователями с вирусом, который был выделен в перевиваемой культуре клеток MARC-145 и обозначен как VR-2332 (54, 78).
Чтобы вытеснить из научной литературы различные и несколько запутывающие названия, использовавшиеся в различных частях мира для описания болезни, в 1991 г. на сессии МЭБ и в 1992 г. на 2-м Международном симпозиуме в США болезни дано единое название: «Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS)» - «репродуктивный и респираторный синдром свиней (РРСС)» (37, 77, 130).
После того, как вирус был идентифицирован и разработаны способы его культивирования, а также методы обнаружения специфических антител, в результате ретроспективного серологического исследования проб сывороток крови от свиней, отобранных ранее в 1979 г. в штате Онтарио (Канада), было получено самое раннее лабораторное доказательство РРСС у домашних свиней. Так, в результате исследований 51 пробы сывороток крови свиней от 1979 г. твердофазным иммуноферментным анализом и непрямым ИФА Carman и др. (64) в 2-х пробах обнаружили специфические антитела к вирусу РРСС, а в 1980 г. из 51 пробы 8 были положительными. Скорее всего, вирус РРСС появился в Канаде на нескольких лет раньше, чем в Соединенных Штатах, так как ни в одной из 1425 проб сывороток крови свиней из подозрительных стад в штате Айова, отобранных в 1980 г., не были обнаружены антитела к вирусу РРСС (209). Се-ропозитивных животных стали обнаруживать с 1985 г., и в каждый последующий год отмечали их увеличение. К 1988 г. 17 из 27 свиней (63,0 %) и 313 из 658 (47,6 %) были сероположительными. Низкое распространение в 1985 г. свидетельствовало о том, что появление вируса в штате Айова произошло в течение этого года или чуть раньше. Подобно данным из штата Айова, самое раннее доказательство инфекции в штате Миннесота было подтверждено серологическими исследованиями проб крови, полученных в 1986 г. (205).
В Европе клинические вспышки РРСС впервые были установлены в Германии в ноябре 1990 г. (98), однако имеется серологическое доказательство, подтверждающее наличие РРСС в Германии уже в 1988 г. (55). За период с 1992 по 2000 гг. проявление болезни или серопозитивных свиней регистрировали в Дании, Северной Ирландии, Греции, Австрии; Восточной Европе - Словении, Чехии, Польше, Словакии. И только в Швеции было подтверждено отсутствие вируса. Серологическими исследованиями 11003 проб, отобранных в период 1993 - 1996 гг., не получено доказательства инфекции (97).
В Азии антитела к вирусу РРСС были ретроспективно подтверждены в Южной Корее у свиней, импортированных в октябре 1985 г. (176), в Японии - в пробах крови, отобранной в июне 1988 г. (ПО). В последующем неблагополучными по РРСС были объявлены Тайвань, Гонконг, Китай, Таиланд, Малайзия.
В Южной Америке РРСС был установлен в Коста-Рике, Чили, Венесуэле, Колумбии, Панаме (46, 47, 48, 49, 50, 67, 76, 154, 182, 195).
В Австралии при серологических исследованиях 875 проб крови свиней, отобранных из 163 стад всех штатов страны, антитела к вирусу РРСС не обнаружены (101).
Специфические иммунные сыворотки
Для световой микроскопии использовали инвертированный микроскоп СК-2 (Olympus, Япония).
Для работы с культурами клеток использовали комплект оборудования, включающий шкаф с ламинарным вертикальным потоком стерильного воздуха (BABCOCK-BSH, ФРГ; BellCo Biotechnology, Canada), С02-инкубатор (ASSAB Medicin AB, Швеция), водяной термостат (ТЖ-0-03), шейкер для 96-луночных пластин "TITERTECK" (Flow, Англия), холодильник бытовой, холодильник низкотемпературный на минус 70С (Revco, США), комплект одноканальных автоматических микропипеток (Gilson, Франция), комплект пластин для культивирования клеток (Linbro, Англия), магнитную мешалку.
Для центрифугирования образцов использовали центрифугу Т-23 (Германия), ультрацентрифугу Beckman L-65 (США), настольную центрифугу Eppendorf Model-1415 (Швеция).
Для взвешивания использовали весы технические на 2 кг, лабораторные на 1 кг, аналитические (ВЛА-200) (СССР), электронные "Gibertini" (Италия).
Амплификацию проводили в амплификаторах «Терцик» («ДНК-Технология», Россия) или Touch Down («Hybaid», UK).
Электрофорез проводили с использованием системы для электрофореза фирмы LKB (Швеция), включающей источник питания PS 2197 и камеры для горизонтального электрофореза MULTIPHORII.
Для проведения боксовых работ использовали комплект посуды, включающий колбы мерные, Бунзена, плоскодонные, пипетки, чашки Петри, цилиндры мерные, диализные стаканы, мерные флаконы различного объема, стеклянные пластины, покровные и предметные стекла и др.
Для учета результатов ИФА использовали анализатор иммунофермент-ных реакций "Униплан" АИФР-1 (ЗАО "Пикон", Россия).
В работе использовали рН-метр милливольтметр рН-121, магнитную мешалку, многоканальные (1-, 4-, 8-, 12-канальные) пипетки ("Flow Laboratories", Великобритания).
При определении белка по методу Лоури использовали фотоэлектроколо риметр КФК-2-УХЛ.
Для получения клеток АМС использовали легкие от клинически здоровых поросят 10-30 дневного возраста, от свиноматок, не имеющих антител к вирусу РРСС. Животных тотально обескровливали, отделяли легкие. Альвеолярные макрофаги получали путем многократного вымывания их из легких средой ДМЕМ с добавлением раствора антибиотиков. Полученные клетки трижды отмывали с последующим центрифугированием при 2000 об/мин, ресус-пендировали в ростовой среде до концентрации клеток 2-2,5 х 10б /мл, добавляли 10% фетальной сыворотки КРС и антибиотики (пенициллин и стрептоми-цин по 100 ЕД/см ).
Клеточную суспензию с ростовой средой в пробирках или чашках Карре-ля помещали в термостат и инкубировали при 37С до формирования полного монослоя (обычно 24 часа).
В качестве патологического материала для изоляции вируса РРСС использовали пробы селезенки, лимфоузлов, легких и других органов больных и павших животных, а также альвеолярные макрофаги от новорожденных нежизнеспособных поросят, грудной экссудат поросят и сыворотки крови абортировавших свиноматок.
Альвеолярные макрофаги от новорожденных нежизнеспособных поросят получали вымыванием клеток культуральной средой из стерильно отобранных легких. Грудной экссудат поросят и сыворотки свиноматок выдерживали с антибиотиками 30 мин при 37С.
Из проб органов готовили 10%-ную суспензию, замораживали при минус 40-60С и оттаивали при комнатной температуре, полученную смесь центрифугировали при 2500 об/мин в течение 15-20 мин; надосадок выдерживали с антибиотиками 30 мин при 37С.
Полученные материалы использовали для выделения вируса в культурах клеток и биопробой на животных.
Репродукция вируса РРСС европейского и американского вариантов в различных культуральных системах in vitro
С целью оптимизации условий изоляции вируса РРСС из патологического материала при проведении диагностических исследований, а также приготовления культуральных тест-препаратов для реакций непрямой иммунофлуорес-ценции или гистохимического варианта ИФА определяли уровень репродукции референс-штаммов и полевых изолятов европейского и американского вариантов вируса в различных клеточных культурах.
Для этого вирусные штаммы выращивали в первичной культуре АМС и перевиваемых культурах клеток. В чашки Карреля с монослоем клеток вносили по 1,0 мл вируссодержащего материала (вирус в виде культуральной жидкости АМС различных пассажей) с активностью 102 0-105 ТЦД5о и инкубировали в течение 96 час при 37С. После 1-го цикла замораживания-оттаивания в культуральной жидкости определяли инфекционную активность вируса. Размножение и результаты накопления вируса РРСС европейского и американского вариантов в культурах клеток представлены в табл. 1.
Все вирусные штаммы и полевые изоляты размножались в АМС и MARC-145, за исключением изолятов «Владимирский» и «Кострома», репродукция которых в культуре клеток MARC-145 не была установлена. Размножение вируса американского варианта (штаммы «NADC-8», «БД») и адаптированного европейского штамма «Lelystad» в клетках MARC-145 сопровождалось их разрушением с проявлением выраженного ЦПЭ на 2-3 сутки после заражения. Полевые изоляты хорошо накапливались в АМС (іо3,0"5 5 ТЦДбо/мл) и значительно хуже - в клетках MARC-145 и без ЦПЭ (К)1 0"4,0 ТЦД50/мл).
Из данных литературы известно, что чувствительность АМС, полученных от поросят разных свиноматок, к поддержанию репродукции вируса РРСС может отличаться.
Для определения избирательной чувствительности АМС для репродукции вируса РРСС была получена культура клеток из легких 6-недельных поросят от 14 свиноматок, содержащихся в виварии ГНУ ВНИИВВиМ, и заражена вирусом РРСС. Результаты исследований, приведенные в табл. 2, свидетельствуют, что АМС поросят только от 7 свиноматок стабильно поддерживали репродукцию вируса РРСС европейского варианта (Волнушка, Сойка, Малинка, Волга, Астра, Белянка, Берёзка). В АМС поросят от 5 свиноматок (Веснушка, Марта, Пеструшка, Висла, Галка) репродукция вируса полностью отсутствовала, а в АМС поросят от 2-х свиноматок (Ночка, Кама) была переменной.
С целью оптимизации условий приготовления тест-препаратов для им-муно-гистохимических реакций определяли дозу заражения и время культивирования вируса. Для этого перевиваемую культуру клеток MARC-145, выращенную на стеклянных пластинках в пробирках или 96-ти луночных культу-ральных микропанелях, инфицировали вирусом РРСС европейского и американского вариантов (адаптированные штаммы «Lelystad» и «БД», соответственно) при множественности заражения от 0,001 до 1,0 ТЦД50/клетка.
Похожие диссертации на Совершенствование и оценка средств и методов лабораторной диагностики репродуктивного и респираторного синдрома свиней
