Содержание к диссертации
Введение
1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Общая характеристика возбудителя B.canis 9
1.2. Распространение бруцеллеза собак, вызываемого B.canis 11
1.3. Клинические признаки заболевания и пути распространения 14
1.4. Серологическая диагностика бруцеллеза животных 18
1.4.1. Реакция агглютинации пробирочная 18
1.4.2. Реакция агглютинации пластинчатая 22
1.4.3. Реакция связывания комплемента 23
1.4.4. Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации 27
1.4.5. Реакция иммунофлюоресценции 30
1.5. Бактериологическая диагностика бруцеллеза собак 32
1.6. Заключение к обзору литературы 34
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 36
2.1. Материалы и методы 36
2.2. Биологические свойства культур B.canis, выделенных на территории Западной Сибири 39
2.2.1. Культурально-морфологические свойства 39
2.2.2. Агглютинабельные свойства 44
2.3. Изучение диагностической ценности РА и РСК при бруцеллезе собак 47
2.3.1. Проверка специфичности антигенов для РА и РСК 47
2.3.2. Изучение чувствительности диагностикумов в опыте на белых мышах 48
2.3.3. Изучение чувствительности диагностикумов в опыте на морских свинках 51
2.3.4.Опыт на собаках 54
2.3.5. Изучение чувствительности РА и PCK при бруцеллезе собак в производственных условиях 58
2.3.6. Определение классов иммуноглобулинов у животных, экспериментально зараженных B.canis 59
2.4. Разработка диагностикума для РНГА 63
2.4.1. Сравнительная оценка активности, специфичности, чувствительности эритроцитарных диагностикумов, полученных разными методами из B.canis 63
2.4.2. Испытание активности, специфичности и чувствительности эритроцитарных диагностикумов 67
2.5. Изучение диагностической эффективности РИФ с R-бруцеллезными люминесцирующими иммуноглобулинами в экспериментальных и производственных условиях 75
2.5.1. Изучение специфичности и чувствительности РИФ 75
2.6. Изучение чувствительности и целесообразности применения биологического исследования при бруцеллезе собак 82
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 86
4. ВЫВОДЫ 99
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 101
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 102
ПРИЛОЖЕНИЕ 125
Введение к работе
Актуальность темы. В системе противоэпизоотических мероприятий диагностика инфекционных болезней занимает ведущее место и определяет многие элементы ее дальнейшего построения и реализации.
В нашей стране остро стоит проблема диагностики ранее не регистрировавшихся инфекций, одной из которых является бруцеллез собак.
Видоспецифический возбудитель бруцеллеза у собак - B.canis впервые был выделен и идентифицирован L.E. Carmichael в 1966 году из абортированного плода бигля в США. В настоящее время заболевание зарегистрировано во многих странах мира, в т. ч. Англии, Франции, ФРГ, Японии, Аргентине, Мексике, Румынии и др. (В.А. Freeman, 1964; Z. Sebek, 1976; I. Sycora, 1977; R.Higgins, 1979; T.Sericawa, T. Muraguchi, 1979; D.M. Myers, 1980; D.J.Taylor, 1980; W.D.Hines, A.Weber, 1980; С A. Jonson, 1982; D.Q.Shang, 1984; K. Sarris, 1987; B.E.Patten, 1987; С Valente, 1991; EJ.Villalba, 1992; V.K. Srinivasan, 1992).
В нашей стране впервые B.canis был выделен от стаффордширского терьера в Волгоградской области в 1994 году (К.В. Шумилов с соавт., 1996).
Заболевание наносит значительный ущерб собаководству, который складывается из потери воспроизводительной способности кобелей, выбраковки ценных в племенном отношении животных, затрат на диагностические и лечебные мероприятия.
По данным ФАО/ВОЗ (1986), бруцеллез собак, вызываемый B.canis, относится к антропозоонозным инфекциям, в связи с чем особую актуальность приобретают методы диагностики, позволяющие эффективно и в короткий срок поставить диагноз.
Клинический осмотр животных служит только ориентировочным методом диагностики, так как характерные для этого заболевания симптомы
(орхит, эпидидимит, аборты), могут наблюдаться и при других инфекционных и неинфекционных патологиях.
За рубежом для диагностики инфекции применяют РА (пробирочную, пластинчатую), РИД, ИФА. Об использовании РСК, РИФ имеются лишь единичные сведения (L.E. Carmichael, 1970; J. Ferney et al. 1984). Для постановки окончательного диагноза широко применяется бактериологический метод исследования крови, как наиболее достоверный (L.E.Carmichael, 1976).
В нашей стране (ВГНКИ) ведутся исследования, направленные на разработку отечественных препаратов для РА, РСК-РДСК, однако до настоящего времени ветеринарная практика не располагает диагностикумами при бруцеллезе собак, вызываемом B.canis, в связи с чем неизвестна степень распространения инфекции, не разработаны мероприятия по ее профилактике и ликвидации.
Исходя из вышеизложенного, мы поставили целью изыскать и дать сравнительную оценку средствам и методам диагностики бруцеллеза, вызываемого B.canis у собак.
Для этого нужно было решить следующие задачи:
изучить биологические свойства культур B.canis, выделенных от собак на территории Западной Сибири, с целью определения штамма для производства диагностикумов;
изучить в сравнительном аспекте диагностическую ценность РА и РСК с антигенами из B.canis и R-формы В.abortus при бруцеллезе собак;
изыскать рациональный способ изготовления эритроцитарного диаг-ностикума, изучить биологические свойства препарата;
определить диагностическую значимость РИФ с R-бруцеллезными люминесцирующими иммуноглобулинами;
изучить возможность и целесообразность постановки биологической пробы при бруцеллезе собак.
Научная новизна. Впервые на территории Западной Сибири выявлен
бруцеллез собак, вызываемый B.canis. Установлено что выделенные от собак культуры бруцелл вида canis имеют основные биологические свойства, включая R-антигенность, идентичные референтному штамму B.canis RM 6/66.
Антигены из B.canis и R-формы В.abortus для РА и РСК, изготовленные во ВНИИБТЖ, использованы при бруцеллезе собак в экспериментальных и производственных условиях, показана целесообразность применения их в серологической диагностике заболевания.
Способ изготовления эритроцитарного диагностикума для РНГА при бруцеллезе собак с использованием 2% додецилсульфата натрия, в сравнении с другими способами, позволяет получить высокоактивный, чувствительный и специфичный препарат.
Выявлена целесообразность прижизненной диагностики бруцеллеза собак путем исследования крови в РИФ с R-бруцеллезными люминесци-рующими иммуноглобулинами.
Показана возможность использования флуоресцирующих R-бруцеллезных иммуноглобулинов для выявления возбудителя B.canis во внутренних органах экспериментально инфицированных животных.
Установлена диагностическая ценность метода постановки биопробы на морских свинках при бруцеллезе собак, вызываемом B.canis.
Практическая значимость работы. Внедрение в ветеринарную практику разработанных серологических диагностикумов для РА пробирочной, пластинчатой, РСК, РИФ, РИГА, биологического метода диагностики позволит контролировать эпизоотическую обстановку, своевременно выявлять и лечить больных животных, способствовать ликвидации заболевания.
Разработаны методические рекомендации: «Диагностика, лечение и профилактика бруцеллеза собак», утверждены НТС Главного управления сельского хозяйства администрации Омской области, протокол № 4 от 21.06.2001 г., и «Методы диагностики и борьбы с бруцеллезом собак, вызы-
ваемым B.canis», утверждены подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины СО РАСХН, протокол №12 от 13.12.2001 г..
Апробация полученных результатов. Материалы диссертации доложены и обсуждены:
на конференции молодых ученых ВНИИБТЖ, Омск, 2000 г.
на Ученых советах ВНИИБТЖ, Омск, 1998, 1999, 2000 гг.
на шестой научной конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов Ом ГАУ, Омск, 2000 г.
на 2-й региональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины мелких домашних животных», Омск, 2002 г.
Публикация материалов исследований. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.
Внедрение результатов исследования. Полученные результаты научных исследований вошли составной частью в методические рекомендации: «Диагностика, лечение и профилактика бруцеллеза собак, вызываемого В. canis», утверждены НТС Главного управления сельского хозяйства администрации Омской области, протокол № 4 от 21.06.2001 г., и «Методы диагностики и борьбы с бруцеллезом собак, вызываемым B.canis», утверждены подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины СО РАСХН, протокол №12 от 13.12.2001 г.
Основные теоретические положения и экспериментальные данные, изложенные в диссертационной работе, используются при чтении лекционных курсов по эпизоотологии и инфекционным болезням в ИВМ Ом ГАУ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 125 страницах компьютерного набора и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов, практических предложении и
списка литературы, включающего 234 источника, из них 82 - отечественных, 152 - зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 20 таблицами, 2 рисунками.
Общая характеристика возбудителя B.canis
Бруцеллез собак известен давно. Его существование было отмечено еще в 1906 г. на заседании Английской комиссии по изучению Мальтийской лихорадки, которая отмечала, что плотоядные были заражены B.melitensis. Дальнейшие исследования ученых показали, что собаки демонстрируют большую сопротивляемость к естественной бруцеллезной инфекции и среди этого вида бруцеллез чаще вызван В.abortus, реже B.melitensis, а возбудителя B.suis не выделяли. (J. Ferney et al., 1984).
В.И. Апарцев (1972) приводит данные о том, что в США бруцеллез в большинстве случаев диагностировали у пастушьих собак при естественном заражении возбудителем В.abortus, которым животные инфицировались при контакте с больным бруцеллезом крупным рогатым скотом.
Р.З. Исламов (1972) проводил бактериологическое исследование 36 чабанских собак в возрасте 1-10 лет, подвергнутых эвтаназии в связи с положительными серологическими реакциями со стандартными бруцеллезными ди-агностикумами. Из девяти выделенных культур только три получили при посевах из первичного патологического материала, остальные культуры выделили посредством биологической пробы на морских свинках. Все собаки, от которых изолировали возбудителя бруцеллеза, реагировали положительно в РСК, у двух из них была положительной РА. Культуры были идентифицированы как B.melitensis.
А.С. Махашвили (1972) проводил обследование собак, которые обитали на фермах и питались мясными отходами, очевидно, и от больных бруцеллезом животных. При бактериологическом исследовании патологического материала от 27 естественно заболевших бруцеллезом животных были выделены культуры В.abortus, из них у 16 собак диагноз установили по клиническим и серологическим исследованиям.
А.Ф. Пинигин с соавт. (1970), И.И. Дукур (1978) сообщают, что диагностика бруцеллеза у собак велась в направлении выявления возбудителя того вида, который циркулировал в неблагополучных хозяйствах, где находился крупный и мелкий рогатый скот, т.е. В.abortus и B.melitensis.
V.K. Srinivasan (1992) считает, что в сельской местности наиболее часто выявляют собак, у которых при серологическом исследовании обнаруживают антитела к В.abortus.
В 1966 году L.E. Carmichael в США в одном из питомников биглей из абортированных плодов был изолирован и идентифицирован возбудитель бруцеллеза собак - B.canis. Несколько позже исследователям в разных местах США удалось выделить из тканей плаценты, плодов и влагалищных выделений абортировавших сук грамотрицательные бактерии, которые идентифицировали по биологическим и биохимическим свойствам как B.canis. Выделенные штаммы возбудителя бруцеллеза собак характеризовались как грамотрицательные микрококки, колонии, находящиеся в R-форме, при окрашивании по методу Уайт-Вилсона (1951) указывали на наличие слизистого слоя на их поверхности. В реакции агглютинации культуры давали положительные результаты с R-бруцеллезной и отрицательные с S-бруцеллезной сыворотками, а также с М- и А- монорецепторными сыворотками. При росте на питательных средах не выделяли сероводород и не требовали для роста углекислого газа. Выделенные штаммы не отличались от культуры бруцелл, изолированной Л.Е. Кармикелем, поэтому штамм B.canis RM 6-66 был признан референтным, а возбудитель бруцеллеза собак - новым видом рода Brucella (L.E. Carmichael and D.W. Bruner, 1968; R. Diaz, 1968; L.M. Jonson et al., 1982).
Данные L.B. Forbes, J.F. Pantekoeck (1988) свидетельствуют, что вид canis имеет подвид B.canis МЕХ 51, который отличается более низкой чувствительностью к пенициллину (растет при концентрации 2,5 ЕД/мл) и некоторым анилиновым красителям (фуксину при концентрации 1:25000, сафранину 1:5000). Образцы штаммов B.canis RM 6/66 и Мех 51 после 7-10 пассажей в лабораторных условиях и длительного хранения сохраняли стабильность основных биологических свойств.
Исследования, проведенные ВГНКИ (К.В. Шумилов, 1984; Ю.П. Михайлова, 2000), свидетельствуют о циркуляции на территории РФ как первого, так и второго биовара B.canis, последний отличается от референтного штамма B.canis RM 6166 по ростовым свойствам на средах с антибиотиками и анилиновыми красителями. Изолированные ими культуры на территории г. Москвы и г. Волгограда авторы относят ко второму биовару B.canis - МЕХ 51, а в г. Санкт-Петербурге - и первого, и второго.
В.Г. Ощепковым, И.О. Кривошеевым (2001) установлено, что изолированные на территории Западной Сибири (г. Омск) эпизоотические штаммы B.canis способны под воздействием антибиотиков (доксициклина, стрептомицина, пенициллина) к трансформации in vivo и in vitro в нетипичные бруцеллезные клетки - L-форму. Важно отметить, что трансформированные L-формы бруцелл, обладающие низкой вирулентностью, способны реверсировать в обычные бактериальные формы, что подтверждено Т.А. Толмачевой (1975), В.Г. Ощепковым, Л. Н. Гордиенко (2000) в опытах in vivo и in vitro.
Материалы и методы
Настоящая работа выполнена в лаборатории биотехнологии и апробации диагностических средств ВНИИБТЖ с 1997 по 2000 годы. Изучение культурально-морфологических, тинкториальных и других свойств культур B.canis проводили по методикам, рекомендованным комитетом экспертов ФАО/ВОЗ по бруцеллезу (6-й доклад, 1986 г.). В работе были использованы: животные: белые беспородные мыши - ПО; морские свинки массой 250 - 300 гр - 221; кролики массой 2,5-3,0 кг - 43; беспородные собаки старше года, массой 18 -30 кг- 8. штаммы:
B.canis 1 - 99 питательные среды: эритрит-агар, мясо-пептонно-печеночный агар, мясо-пептонно-печеночный бульон; сыворотка крови 376-и здоровых собак, 12-и собак, больных инфекционными заболеваниями (лептоспироз, пироплазмоз, чума, вирусный гепатит).
Биологические свойства штаммов бруцелл, выделеннх от собак в полевых условиях, изучали в сравнении с референтным штаммом B.canis RM 6/66. Агглютинабельные свойства штаммов определяли при помощи пластинчатой РА с S- и R-бруцеллезными сыворотками из «Набора компонентов для серологической дифференциации культур бруцелл» (ВНИИБТЖ -ВГНКИ).
Для изучения антигенной структуры выделенных штаммов B.canis использовали коммерческие медицинские S-флюоресцирующие бруцеллезные иммуноглобулины ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи и R-бруцеллезные флюоресцирующие иммуноглобулины, разработанные совместно ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи и ВНИИБТЖ (М.М. Желудков, Л.В. Дегтяренко и др.). Постановку реакции иммунофлюоресценции осуществляли согласно «Инструкции по применению иммуноглобулинов диагностических флюоресцирующих R-бруцел-лезных сухих» утвержденной Госкомэпиднадзором РФ (10.03.95).
При изучении биологических свойств изолированные штаммы исследовали на способность выделять сероводород, определяли чувствительность к анилиновым красителям и антибиотикам.
Экспериментальная часть работы: конструирование диагностикумов для серологических исследований, опыты на белых мышах, морских свинках, собаках была проведена в условиях лаборатории.
При постановке РА и РСК по общепринятым методикам использовали диагностикумы из глубокодиссоциированного штамма В.abortus 16/4. При этом в РА применяли R-бруцеллезный цветной антиген из «Набора для серологической дифференциации бруцелл», разработанный Л.В. Дегтяренко, У.Э. Ниязовым, К.В. Шумиловым, И.А. Косиловым, в РСК - R-бруцеллезный антиген ВНИИБТЖ - ВГНКИ (авторы Л.В. Дегтяренко, У.Э. Ниязов, К.В. Шумилов, И.А. Косилов).
Кроме того, при постановке РА и РСК использовали диагностикумы, изготовленные из референтного штамма B.canis RM 6/66 в лаборатории биотехнологии и апробации диагностических средств (автор Л.В. Дегтяренко).
При конструировании диагностикума для РИГА антигенное начало извлекали из штамма B.canis RM 6/66. Экстрагирование антигена для РНГА проводили с применением физических и химических факторов (автоклавиро-вания, ультразвука, карболовой и трихлоруксусной кислоты, додецилсульфа-та натрия).
Испытание специфичности изготовленных диагностикумов проводили на сыворотках крови 377-и здоровых собак и 12 больных инфекционными заболеваниями (лептоспироз, пироплазмоз, чума, вирусный гепатит), 50-и интактных белых мышей, 80-и морских свинок, 35-и кроликов.
Активность и чувствительность экспериментальных антигенов изучали при исследовании полевых сывороток крови 11 -и естественно инфицированных и 8-й экспериментально зараженных собак, а также на лабораторных животных указанных выше.
Для приготовления взвесей культур штаммов бруцелл применяли оптический стандарт мутности ГНИИСК им. Л.А. Тарасевича.
Инфицирование животных для лабораторных исследований (серологического, бактериологического), идентификацию выделенных культур микроорганизмов проводили по общепринятым методикам.
Бактериологические исследования патологоанатомического материала, полученного от белых мышей, морских свинок, собак осуществляли путем посева из лимфатических узлов (подчелюстных, заглоточных, предлопаточ-ных, паховых, параортальных), внутренних органов (сердца, печени, селезенки, костного мозга, семенников, придатков семенников, предстательной железы), а также мочи. Посевы из лимфатических узлов и паренхиматозных органов проводили в одну пробирку с мясо-пептонно-печеночным бульоном (МППА) и две пробирки с эритрит-агаром. Пробирки с посевами инкубировали в термостате при 37С в течение 30 суток, периодически просматривая рост бактериологических находок.
Обсуждение результатов исследования
После открытия представителя рода Brucella возбудителя бруцеллеза собак - B.canis и разработки средств диагностики зарубежными исследователями установлено широкое распространение этого инфекционного заболевания.
В нашей стране бруцеллез собак, вызываемый B.canis, был впервые обнаружен в 1994 году в Волгоградской области и с тех пор, по сообщениям отечественных исследователей, его регистрируют в Москве, Санкт-Петербурге, Ростове-на-Дону, Омске.
В г. Омске от пяти собак (кобелей) разных пород с клиническими признаками бруцеллеза и применением разработанных средств диагностики бруцеллеза собак для РА, РСК выделили культуры возбудителя B.canis.
Проведенные нами исследования по идентификации выделенных культур бактерий указывают на то, что культуры относятся к виду B.canis и обладают аналогичными культурально-морфологическими, тинкториальными, метаболическими и агглютинабельными свойствами. Данные зарубежных и отечественных исследователей свидетельствуют о существовании двух подвидов B.canis: RM 6/66 и МЕХ 51 (L.B. Forbes, J.F. Pantekoeck, 1988; К.В.Шумилов; Ю.П. Михайлова, 2000). Последний растет на питательных средах с фуксином в концентрации 1:100000, сафранином - 1:10000, пенициллином - до 20 ЕД/мл. Исследования, проведенные нами, показали, что все пять выделенных штаммов B.canis по росту на среде с анилиновыми красителями и антибиотиками относились ко второму подвиду B.canis - МЕХ 51. Изолированные культуры находились в R-форме, т.к. при изучении агг-лютинабельных и антигенных свойств не обнаружено S-компонентов в антигенной структуре штаммов B.canis. В связи с тем, что по основным биологическим свойствам выделенные культуры не отличались от референтного штамма B.canis RM 6/66, для конструирования диагностикумов нами был из бран штамм B.canis RM 6/66, который часто используют за рубежом с целью изготовления диагностических препаратов (L.E. Carmichael, 1968; L.E. Carmi-chael, J.C. Jubert, 1987; R.V. Pollock, 1988; M. Katami, 1991; Jin-San Moon, 1994; M. Necsulescu, 1995).
В системе противоэпизоотических мероприятий особое место занимает диагностика заболеваний. В нашей стране диагностика бруцеллеза собак, вызываемого B.canis, находится в стадии разработки.
В работе для выявления инфицированных животных использовали серологические тесты: РА (пластинчатая, пробирочная), РСК, РНГА. Для выявления возбудителя B.canis при жизни животных применяли РИФ и бактериологический метод исследования крови.
Кроме того, диагноз на бруцеллез ставили с применением бактериологического исследования материала и обнаружения в нем возбудителя с помощью РИФ.
При испытании экспериментальных антигенов из бруцелл вида canis и abortus для РА и РСК в опытах на разных видах животных получены следующие результаты.
При изучении специфичности антигенов для РА на 50-ти пробах сыворотки крови интактных белых мышей с разведения 1:10, а также 80 здоровых морских свинок с аналогичного разведения в РА и с 1:5 в РСК были получены отрицательные результаты.
Опыт на белых мышах, инфицированных разными дозами возбудителя эпизоотического штамма B.canis 2-97, показал, что с помощью экспериментальных антигенов для РА антитела к B.canis улавливали у 80,0% животных, зараженных минимальной инфицирующей дозой - 10 м.к. Титр агглютинирующих антител в этой группе составлял от 1:10 до 1:20. С увеличением дозы инфицирующего агента возрастал и уровень регистрируемых агглютининов, которые обнаруживали в сыворотке крови у 100%) животных. Максимальный титр агглютинирующих антител (1:320) наблюдали в группе животных, где инфицирующая доза составила 100 млн. м.к.. Результаты проведенных исследований указывают на специфичность и чувствительность используемых антигенов, что подтверждено бактериологическим методом исследования патологического материала.
В другом опыте на белых мышах, инфицированных культурой эпизоотического штамма B.canis 2-97 в дозе 100 тыс. м.к., испытуемые цветные антигены из B.canis и R-формы В.abortus в РА позволяли контролировать иммунный ответ у 100% животных на протяжении 120 дней (срок наблюдения). Бактериологическим методом удавалось выявить бруцеллоносительство у инфицированных белых мышей лишь через 30 и 60 дней с момента заражения.
Дальнейшее изучение чувствительности диагностикумов для РА и РСК продолжено в опыте на морских свинках.
При серологических исследованиях сыворотки крови морских свинок, инфицированных разными дозами возбудителя B.canis, наименее выраженный иммунный ответ был у животных на введение минимальной дозы (100 м.к.) инфицирующего агента, особенно на 60-й день после заражения. Средний титр антител в сыворотке крови животных в этой группе был самым низким и составлял в РА - 1:10, в РСК - 1:5, тем не менее даже при инфицировании животных такой низкой дозой возбудителя B.canis было диагностировано 33,3% зараженных морских свинок
Похожие диссертации на Изыскание и сравнительная оценка средств и методов диагностики бруцеллеза, вызываемого B. canis у собак
