Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 17
1.1. Изменчивость бруцелл 17
1.2. Антигенная структура бруцелл 24
1.3. Иммунодиагностика бруцеллеза животных, инфицированных типичными и измененными вариантами бруцелл 30
1.4. Дифференциальная диагностика больных бруцеллезом животных от иммунизированных противобруцеллезными вакцинами 50
1.5. Диагностика инфекционного эпидидимита баранов 60
1.6. Диагностика бруцеллеза собак, вызываемого В.canis 70
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 78
Материалы и методы исследования 78
2.1. Концепция оптимизации диагностики болезней, вызываемых у животных бруцеллами 80
2.2. Усовершенствование бактериологической диагностики бруцеллеза у животных, сенсибилизированных измененными формами бруцелл 82
2.2.1. Отбор штамма бруцелл для производства R-бруцеллезной агглютинирующей сыворотки 83
2.2.2. Изыскание схемы гипериммунизации крупного рогатого скота и кроликов с целью получения R-бруцеллезной сыворотки 87
2.3. Разработка биологического метода диагностики бруцеллеза у животных, инфицированных диссоциированными формами бруцелл 96
2.3.1. Изучение чувствительности R-бруцеллезного цветного антигена для РА в опытах на морских свинках 97
2.4. Изучение антигенной структуры бруцелл с применением S- и R-бруцеллезных диагностикумов 105
2.4.1. Результаты изучения антигенной структуры разных серий вакцины из штамма 82 106
2.4.2. Результаты изучения биологических свойств культур бруцелл, выделенных от крупного рогатого скота, иммунизированного штаммом B.abortus 82 108
2.4.3. Опыты на крупном рогатом скоте по изучению антигенных свойств штаммов бруцелл 112
2.4.4. Разработка методики количественного содержания S- и R-компонентов в антигенной структуре бруцелл 116
2.5. Изучение диагностической ценности реакции иммунофлюоресценции (РНИФ и РИФ) при индикации и идентификации измененных форм бруцелл 118
2.5.1. Испытание РНИФ при индикации и изучении антигенной структуры бруцелл 118
2.5.2. Разработка R-бруцеллезных люминесцирующих иммуноглобулинов, изучение их свойств 121
2.6. Изучение диагностической ценности R-бруцеллезного антигена для РСК 128
2.6.1. Специфичность антигена 129
2.6.2. Изучение чувствительности R-бруцеллезного антигена в экспериментах на лабораторных животных и крупном рогатом скоте 129
2.6.3. Производственные испытания R-бруцеллезного антигена 130
2.6.3.1. Испытание R-бруцеллезного антигена на непривитых животных в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах... 131
2.6.3.2. Испытание R-бруцеллезного антигена в неблагополучных хозяйствах на животных, привитых вакциной из штамма 82 133
2.6.3.3. Испытание R-бруцеллезного антигена в благополучных по бруцеллезу хозяйствах на животных, привитых вакциной из штамма 82 134
2.7. Разработка и испытание R-бруцеллезных диагностикумов для РА и РИГА 138
2.7.1. Изучение чувствительности R-бруцеллезных диагностикумов для РА и РИГА в экспериментальных условиях на крупном рогатом скоте 139
2.7.2. Испытание R-бруцеллезных диагностикумов для РА и РНГА в производственных условиях 146
2.8. Изучение реакции непрямой гемагглютинации с сывороткой крови для диагностики бруцеллеза у коров, инфицированных S-формами бруцелл 148
2.8.1. Результаты испытания специфичности и чувствительности РНГА на непривитых противобруцеллезными вакцинами животных 149
2.8.2. Изучение возможности применения РНГА для диагностики бруцеллеза у крупного рогатого скота, реиммунизированного вакциной из штамма 82 154
2.8.3. Результаты производственного испытания реакции непрямой гемагглютинации с отечественным эритроцитарным бруцеллезным диагностикумом 160
2.9. Результаты испытания РА, РСК, РНГА в целях дифференциальной диагностики бруцеллеза у крупного рогатого скота, реиммунизированного вакциной из штамма 82 170
2.10. Изучение кольцевой реакции (КР) с молоком для диагностики бруцеллеза у коров, привитых вакциной из штамма 82 176
2.10.1. Испытание КР с молоком в производственных условиях... 178
2.10.2 . Испытание КР с молоком в экспериментальных условиях ... 184
2.11. Разработка и испытание реакции непрямой гемагглютинации с молоком для диагностики бруцеллеза у коров 192
2.11.1. Результаты изыскания наиболее оптимального варианта постановки РИГА 194
2.11.2. Изучение специфичности и чувствительности РНГА с молоком при исследовании коров, непривитых противобруцеллезными вакцинами 195
2.11.3. Испытание РНГА с молоком для дифференциальной диагностики бруцеллеза у коров, иммунизированных вакциной из штамма 82 202
2.12. Противоэпизоотическая и экономическая эффективность системы дифференциальной диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82 209
2.13. Результаты сравнительного изучения диагностической ценности реакции иммунодиффузии (РИД) 226
2.13.1. Изучение диагностической ценности РИД с О-ПС антигеном в естественных очагах бруцеллеза 227
2.13.2. Испытание диагностической эффективности РИД в сравнении с другими тестами дифференциальной диагностики 230
2.14. Разработка и испытание овисного антигена для реакции агглютинации 234
2.14.1. Изучение специфичности овисного антигена для РА 236
2.14.2. Изучение чувствительности овисного антигена цветного в экспериментах на баранах 236
2.14.3. Изучение диагностической ценности РА с овисным антигеном в производственных условиях 254
2.15. Разработка и испытание овисного антигена для реакции связывания комплемента 262
2.15.1. Изучение специфичности и чувствительности овисного антигена в экспериментальных условиях 263
2.15.2. Производственные испытания чувствительности овисного антигена 269
2.15.3. Изучение биохимических свойств антигенов, изготовленных из R-форм бруцелл 278
2.16. Сравнительное испытание чувствительности различных диагностических тестов при ИЭ баранов 280
2.16.1. Сравнительное изучение чувствительности диагностических тестов в экспериментах на баранах, инфицированных В.ovis 281
2.16.2. Сравнительное испытание чувствительности разных методов диагностики ИЭ баранов в производственных условиях 286
2.17. Испытание РИФ с R-бруцеллезными люминесцирующими иммуноглобулинами для прижизненной диагностики возбудителя ИЭ баранов 288
2.18. Разработка метода диагностики ИЭ баранов с использованием реакции иммунитета — иммунологической памяти 292
2.18.1. Изучение возможности применения метода провокации биосинтеза антител в экспериментальных и производственных условиях 292
2.18.2. Изучение эпизоотической опасности животных, диагностированных методом провокации антител к B.ovis 303
2.19. Разработка диагностики бруцеллеза собак, вызываемого B.canis 304
2.19.1. Биологические свойства культур B.canis, выделенных на территории Западной Сибири 305
2.19.2. Испытание диагностической эффективности РА и РСК при бруцеллезе собак 307
2.19.2.1. Изучение специфичности антигенов для РА и РСК 307
2.19.2.2. Определение чувствительности диагностикумов в опыте на морских свинок 308
2.19.3. Изучение чувствительности диагностикумов в опыте на собаках, инфицированных B.canis 310
2.19.4. Изучение диагностической ценности диагностикумов для РА, РСК при бруцеллезе собак в полевых условиях 314
2.19.5. Изучение диагностической ценности реакции иммунофлюоресценции при бруцеллезе собак 318
2.19.5.1. Изучение специфичности и чувствительности эритроцитарных канисных антигенов 319
2.19.6. Изучение диагностической ценности реакции иммунофлуоресценции при бруцеллезе собак 3 24
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 329
4. ВЫВОДЫ 384
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 389
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ! 393
- Дифференциальная диагностика больных бруцеллезом животных от иммунизированных противобруцеллезными вакцинами
- . Испытание КР с молоком в экспериментальных условиях
- Изучение эпизоотической опасности животных, диагностированных методом провокации антител к B.ovis
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Одной из важнейших задач сельскохозяйственного производства во всем мире является обеспечение населения высококачественной экологически чистой животноводческой продукцией, что предполагает изыскание новых и совершенствование существующих методов профилактики, диагностики и ликвидации таких антропозоонозов как бруцеллез животных, вызываемый видами abortus, melitensis, suis.
Несмотря на значительные успехи, достигнутые в ликвидации бруцеллеза в Российской Федерации совместными усилиями научного потенциала и практической ветеринарной службы, проблема ликвидации бруцеллеза крупного рогатого скота окончательно не решена.
Современная система профилактики и борьбы с бруцеллезом основывается на проведении общих ветеринарно-санитарных мероприятий, выявлении источников инфекции - больных животных и их удалении, применении средств специфической профилактики.
Наиболее важным элементом этой системы является диагностика бруцеллеза, от эффективности которой зависят размеры экономического ущерба при ликвидации заболевания.
Значительные трудности в диагностике бруцеллеза создают циркулирующие в природе измененные варианты возбудителя бруцеллеза: R, RS, SR и L-формы, о существовании которых сообщали многие исследователи (П.А.Вершилова с соавт., 1972; Н.П. Потапов, 1974; К.М. Салмаков с соавт., 1974; И.А. Косилов, 1975, 1992; П.А. Триленко, 1976; Е.С. Мозесюк, 1982; В.Г.Ощепков, 1990; Л.Н. Гордиенко, 1999 и др.).
Измененные формы бруцелл, несмотря на их пониженную вирулентность, способны к реверсии в исходные формы и могут вызвать вспышки бруцеллеза.
Изменения в антигенной структуре возбудителя создают трудности в бак-териологической диагностике при индикации возбудителя бруцеллеза и в серо-
логической, поскольку официальные диагностические средства сконструированы на основе типичных S-форм бруцелл.
В этой связи исследования по изысканию новых эффективных диагностических препаратов с учетом изменчивости возбудителя бруцеллёза являются актуальными.
Широко применяющаяся в системе противобруцеллёзных мероприятий слабоагглютиногенная вакцина из штамма B.abortus 82, имеющая RS-антигенную структуру, осложняет диагностику из-за проблемы дифференциации поствакцинальных реакций от реакций у больного скота.
Эта проблема также требовала проведения исследований, направленных на разработку надежных диагностических средств и методов дифференциальной диагностики, которые возможно было бы использовать не только в отдаленные, но и ранние сроки после иммунизации животных.
Основными методами серологической диагностики бруцеллеза у непривитого и иммунизированного противобруцеллёзными вакцинами крупного рогатого скота в нашей стране являются РА, РСК, РИД. Однако, для эффективного выявления больных животных на всех стадиях развития инфекционного процесса этих реакций недостаточно. Возникает необходимость в разработке новых легко выполнимых, доступных для массового исследования экспресс методов диагностики бруцеллезных антител в сыворотке крови и молоке.
Такие диагностические средства и методы необходимы не только для выявления больных животных в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах, но и для зон свободных от инфекции, где взамен РА, дающей в ряде случаев неспецифические реакции на бруцеллез, и трудоемких дорогостоящих РСК, РИД целесообразно внедрять более простые, эффективные способы диагностики бруцеллеза.
Важной проблемой до настоящего времени остается ликвидация инфекционного эпидидимита баранов, вызываемого В.о vis, и наносящего ощутимый экономический ущерб овцеводству.
Наряду с широким распространением этого заболевания почти во всех странах мира, он имеет место и в Российской Федерации. Несмотря на разработанные в ВГНКИ - ВИЭВ такие эффективные диагностические методы, как ИФА, РНГА, РНАТ, РНИФ, на практике применяется, в основном, один серологический тест - РДСК, что является недостаточным как для профилактики, так и для оздоровления хозяйств от ИЭ баранов.
Бруцеллез собак, вызываемый B.canis, впервые установленный в США G.E. Carmichael в 1966 году, впоследствии в результате разработки средств диагностики зарегистрирован во многих странах мира: Франции, Англии, ФРГ, Японии, Мексике, Румынии, Аргентине, Германии, Китае, Бразилии и др.
В России первый случай бруцеллеза собак, обусловленный B.canis, был зарегистрирован в Волгоградской области в 1994 году (К.В. Шумилов с соавт., 1996).
Инфекция наносит значительный ущерб собаководству, который складывается из потери воспроизводительной способности кобелей, выбраковки ценных в племенном отношении животных, абортов и рождении слабых, нежизнеспособных щенков (G.E. Carmichael, 1988).
Бруцеллез собак относится к зооантропонозам - болезням, регистрируемым у животных и представляющих угрозу для здоровья людей (6-ой доклад ФАО/ВОЗ, 1986).
В России (ВГНКИ) проводится разработка диагностических средств при данном заболевании, но до настоящего времени они не внедрены в ветеринарную практику.
Вышеизложенное обусловило необходимость проведения исследований, направленных на разработку новых и совершенствование существующих средств и методов диагностики бруцеллеза животных и ИЭ баранов, поиск вариантов наиболее рационального использования их в системе мер борьбы с этими инфекциями.
В настоящей диссертационной работе обобщены результаты многолетних
исследований по созданию новых и совершенствованию существующих средств и методов диагностики бруцеллеза животных и ИЭ баранов. В частности, показана особенность диагностики бруцеллеза в связи с изменчивостью возбудителя и представлены материалы по разработке R-бруцеллезных антигенов для РСК, РА, РНГА, R-бруцеллезных люминесцирующих иммуноглобулинов, R-бруцеллезной агглютинирующей сыворотки. Изложены результаты испытаний РНГА с сывороткой крови и молоком, КР с молоком, РИД для диагностики бруцеллеза у непривитых животных, а также апробация этих методов с целью дифференциальной диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма B.abortus 82.
При ИЭ баранов представлены материалы по разработке и испытанию новых средств диагностики: РА и РСК с овисными антигенами, R-бруцеллезных люминесцирующих иммуноглобулинов для прижизненной диагностики заболевания, метода провокации биосинтеза антител для диагностики латентно больных животных.
При бруцеллезе собак, вызываемом B.canis, представлены материалы по разработке и апробации средств серологической диагностики для РА пластинчатой, пробирочной, РСК, РНГА. Показана возможность совершенствования прижизненной бактериологической диагностики заболевания с помощью РИФ.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ. Исходя из вышеизложенного, мы поставили цель: разработать новые и усовершенствовать существующие средства, методы диагностики бруцеллеза животных и инфекционного эпидидимита баранов.
Основные задачи исследований:
- разработать способ изготовления R-бруцеллезной агглютинирующей сыворотки и R-бруцеллезных люминесцирующих иммуноглобулинов для ин-дикации возбудителей инфекционного эпидидимита баранов и бруцеллеза (диссоциированные формы); испытать диагностическую эффективность полученных препаратов;
разработать R-бруцеллезные диагностикумы для РА, РСК и РНГА, изучить их диагностическую ценность в экспериментальных и производственных условиях;
изучить диагностическую ценность РНГА с сывороткой крови, КР и РНГА с молоком у крупного рогатого скота, инфицированного типичными формами бруцелл, в том числе на фоне иммунизации вакциной из штамма 82;
разработать оптимальную систему дифференциальной диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма 82, изучить её противоэпизоотическую эффективность;
разработать методики изготовления овисных антигенов для РА, РСК, испытать их специфичность, чувствительность в экспериментальных и производственных условиях при ИЭ баранов;
изучить диагностическую ценность метода провокации биосинтеза антител при ИЭ баранов;
разработать средства и методы диагностики бруцеллеза собак, вызываемого B.canis.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые разработана технология промышленного изготовления «Набора компонентов для серологической дифференциации культур бруцелл», включающего R-бруцеллезную агглютинирующую сыворотку и R-бруцеллезный цветной антиген для РА.
Способ изготовления R-бруцеллезного цветного антигена защищен авторским свидетельством № 955572 от 04.05.1982 г.
Впервые разработана технология промышленного изготовления R-бруцеллезных люминесцирующих иммуноглобулинов для бактериологической диагностики диссоциированных форм бруцелл в реакции иммунофлуоресцен-ции. Установлена более высокая чувствительность РИФ с новым диагностику-мом в сравнении с бактериологическим методом диагностики. Показана целесообразность применения R-бруцеллезных люминесцирующих иммуноглобулинов для прижизненной диагностики возбудителя B.ovis в сперме баранов.
Впервые сконструирован специфичный и чувствительный R-бруцеллезный диагностикум для РИГА на основе сенсибилизации эритроцитов барана фенольным экстрактом антигена из штамма B.abortus 16/4, показана возможность использования его для выявления R-бруцеллезных антител у животных в экспериментальных и производственных условиях.
Доказана необходимость применения R-бруцеллезного антигена РСК для дифференциальной диагностики бруцеллеза у крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82, в благополучных и неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах в разные сроки после иммунизации.
Впервые показана возможность применения РНГА с сывороткой крови для диагностики бруцеллеза у крупного рогатого скота, реиммунизированного штаммом B.abortus 82, в ранние и отдаленные сроки после иммунизации.
Разработана методика постановки РНГА с молоком для экспресс-диагностики бруцеллезных антител. В экспериментальных и производственных условиях доказана специфичность и чувствительность теста. Установлено, что РНГА с молоком возможно использовать в целях дифференциальной диагностики бруцеллеза у коров, реиммунизированных вакциной из штамма 82.
Доказана целесообразность применения КР с молоком для диагностики бруцеллеза у коров, ревакцинированных вакциной из штамма 82.
Разработаны критерии эпизоотической оценки по бруцеллезу животных, иммунизированных вакциной из штамма 82, для благополучных и неблагополучных хозяйств по показателям РА и РСК с единым антигеном.
Впервые разработана оптимальная система дифференциальной диагностики бруцеллеза у коров, реиммунизированных вакциной из штамма 82, доказана ее противоэпизоотическая эффективность при оздоровлении неблагополучных по бруцеллезу хозяйств.
Разработаны технологии изготовления овисных антигенов для РА и РСК, в экспериментальных и производственных условиях доказана специфичность и чувствительность новых диагностикумов.
Разработан новый метод диагностики ИЭ баранов на основе использования реакций иммунологической памяти (метод провокации биосинтеза антител), в экспериментальных и производственных условиях показана возможность применения в качестве провоцирующих средств бруцеллина ВИЭВ, бру-целлоовина в общепринятых дозах.
Впервые экспериментальным путем доказана возможность использования вакцины из штамма B.melitensis Rev-1 для регистрации вторичного иммунного ответа с целью диагностики животных, инфицированных возбудителем B.ovis.
Сконструированы новые диагностикумы из бруцелл вида canis для РА, РСК, РИГА и апробированы наряду с антигенами из R-формы B.abortus в экспериментальных и производственных условиях, показана целесообразность их применения для диагностики бруцеллеза у собак.
Впервые на территории Западной Сибири с помощью испытанных диаг-ностикумов выявлен бруцеллез собак, вызываемый В.canis.
При бруцеллезе собак впервые установлена высокая эффективность прижизненного способа диагностики - РИФ с R-бруцеллезными люминесцирую-щими иммуноглобулинами.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Результаты проведенных исследований вносят существенный вклад в решение проблемы диагностики бруцеллеза животных и инфекционного эпидидимита баранов.
Они могут быть использованы при изучении патогенеза и иммуногенеза бруцеллеза разных видов животных и усовершенствовании системы противо-бруцеллезных мероприятий.
Предложена концепция оптимизации диагностики болезней, вызываемых у животных бруцеллами.
На основе указанной концепции разработан комплекс диагностических средств и методов, внедрение которого в ветеринарную практику обеспечило повышение эффективности противоэпизоотических и профилактических мероприятий при бруцеллезе животных и инфекционном эпидидимите баранов.
АПРОБАЦИЯ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: Всесоюзной научной конференции по проблемам бруцеллеза и туберкулеза (Омск, 1980); 3-ей Всесоюзной конференции «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биопрепаратов» (Щелково, 1987); XII Всесоюзной конференции по природной очаговости болезней (Новосибирск, 1989); Всесоюзной конференции «Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организации медицинской помощи» (Новосибирск, 1989); Всесоюзных и Всероссийских координационных совещаниях по проблеме бруцеллеза и туберкулеза с.-х. животных (Омск, 1987; Кустанай, 1988; Новочеркасск, 1989; Махачкала, 1990; Омск, 1991-1995; Новосибирск, 1999); Международной научно-практической конференции «Проблемы стабилизации и развития сельскохозяйственного производства Сибири, Монголии и Казахстана в XXI веке» (Новосибирск, 1999); 2-й региональной конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины мелких домашних животных на Северном Кавказе (п.Персиановский, 1999); Всероссийской научной конференции по проблемам хронических инфекций (Омск, 2001); Международной научно-практической конференции «Состояние и перспективы аграрной науки Казахстана и Западной Сибири» (Петропавловск, 2003); 6-й Международной научно-практической конференции «Научное обеспечение АПК Казахстана, Сибири, Кыргыстана, Монголии, Беларуси и Башкортостана (Новосибирск, 2003); Международной научной конференции «Современные проблемы эпизоотологии» (п. Краснообск, 2004).
ПУБЛИКАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ. По теме диссертации опубликовано 52 научные работы в журналах «Ветеринария»; «Сибирский вестник с.-х. науки»; материалах всесоюзных, всероссийских и международных научных конференций; трудах Всероссийского научно-исследовательского института бруцеллеза и туберкулеза животных и других НИУ.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 455 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы,
собственных исследований, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений.
Диссертация иллюстрирована 67 таблицами, 3 рисунками. Список литературы включает 565 источников, из них 226 — зарубежных авторов.
ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ. Результаты научных исследований нашли отражение в разработке наставлений по диагностике бруцеллеза животных и инфекционного эпидидимита баранов, инструкции о мероприятиях по профилактике и ликвидации инфекционного эпидидимита баранов, ветеринарно-санитарных правил по профилактике и борьбе с бруцеллезом животных, методических указаниях по дифференциальной эпизоотической оценке стад крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82.
Всего на основе научных разработок, проведенных в комплексе с сотрудниками других НИУ, подготовлено 30 новых нормативных документов, утвержденных на союзном и республиканском уровнях.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАШИТУ:
материалы по усовершенствованию серологической и бактериологической диагностики бруцеллеза животных, сенсибилизированных диссоциированными формами бруцелл;
результаты испытаний реакции непрямой гемагглютинации, кольцевой реакции с молоком, диагностическое значение этих тестов при бруцеллезе крупного рогатого скота;
система дифференциальной диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма 82, и ее противоэпизоотическая эффективность;
материалы по разработке и испытанию диагностических средств, методов при инфекционном эпидидимите баранов и бруцеллезе собак, вызываемом B.canis.
Дифференциальная диагностика больных бруцеллезом животных от иммунизированных противобруцеллезными вакцинами
Дифференциация поствакцинальных и постинфекционных титров бруцеллезных антител представляет наиболее сложную проблему в диагностике разных видов сельскохозяйственных животных. Имеются различия в пропорциях и длительности персистенции каждого типа антител в зависимости от характера инъекции, физиологического состояния, возраста, времени вакцинации, сроков исследования, вирулентности возбудителя, индивидуального ответа организма восприимчивого животного, которые и создают проблему дифференциальной диагностики.
Наибольшую сложность в эпизоотической оценке стад вызывают живые агглютиногенные противобруцеллезные вакцины, такие как штаммы В.abortus 19, которую стали применять в Советском Союзе широко с начала пятидесятых годов.
Основное внимание отечественных и зарубежных исследователей было направлено на изучение динамики иммунобиологических реакций у животных после прививки в разных эпизоотических условиях (И.В. Ротов, 1960; В.П.Бельченко, 1975; Н.С. Вождаев, 1979; T.G. Amerault et al., 1962; T.MBuchanan, L.C. Faber, 1980; G.G. Klein, K.A. Behan, 1981; A.R- MacMillan, R.A. Bell, 1985 и другие). Все исследователи показывают длительную серопози-тивность у животных на введение штамма В.abortus 19, вплоть до окончания их производственного использования.
Первоначально при применении этой вакцины многие ученые пытались дифференцировать больных от вакцинированных с помощью РА и РСК. Например, К.Д. Дарвишев, 1961; Б.С. Акчурин, 1963; R. Gaumontl.W, 1964 и другие считают возможным применение РСК в отдаленные сроки после вакцинации для диагностики больных животных. Вместе с тем, большинство исследователей пришли к выводу о нецелесообразности применения РА и РСК для дифференциальной диагностики при иммунизации взрослых животных штаммом 19.
На следующем этапе изучалась возможность использования для дифференциации методов определения различных классов иммуноглобулинов с помощью 0,2М концентрации меркаптоэтанола, солянокислого цистеина и прогревания сыворотки крови при 65С (В.И. Левенсон, Е.В. Чернохворстова, 1967; Б.И. Кондауров, 1973; Т.С. Сайдулдин, 1984; А.А. Лим, 1989; G.L. Asherson, D.C. Drumoude, 1963; S.B. Anderson, 1964; A. Lewkowicz, 1972 и другие). Все эти методы были основаны на разрушений макроглобулиновых фракций — 19S в сыворотке крови, характерной для антител поствакцинальной природы, как считали исследователи, и диагностике 78-антител, не разрушающихся под действием редуцирующих веществ и постоянно присутствующих в организме больных бруцеллезом животных.
Но в дальнейшем было показано, что 2-меркаптоэтанол разрушает в ряде случаев и антитела класса 7S, как и прогревание, кроме того антитела класса 19S синтезируются также в организме инфицированных животных, особенно в начальной стадии инфекции. Очевидно, по этим причинам тесты не получили широкого применения в ветеринарной практике. Кроме того, данные методы не могут быть применены в стадах, в которых вакцина применяется неоднократно, поскольку во вторичном иммунном ответе участвуют в большом проценте 7S-антитела у здоровых животных (Н.С. Вождаев с соавт., 1979;).
Первоначально за рубежом появились сообщения о возможности дифференциации инфицированного и вакцинированного скота при помощи реакции радиальной иммунодиффузии (R. Diaz, P. Garatea et al., 1979; L.M. Jones, D.G.Becman, 1980; B.M. Jose et al., 1983 и другие).
R. Diaz et al. (1979) было установлено, что экстракты штаммов B.abortus и B.melitensis, полученные с помощью трихлоруксусной кислоты, фенола, эфира, содержат два компонента: S-LPS, ответственный за специфичность для S-форм, имеющий большое значение в серологической диагностике, а также полисахарид Б или поли-Б, который обладал значительной диффузностью в РРИД, содержал большое количество углеводов. Впоследствии эти исследователи получали поли-Б-антиген из штамма B.abortus 16М, путем последовательной обработки супернатанта этанолом. Исследователями определено, что антитела к по-ли-Б-антигену содержатся только в сыворотке крови инфицированных бруцеллезом людей и животных, тогда как у здоровых, вакцинированных, они отсутствовали. Многими исследователями за рубежом сделаны выводы о специфичности РРИД с поли-Б-антигеном, его способности дифференцировать больных животных от здоровых, иммунизированных агглютиногенными и слабоагглюти-ногенными штаммами бруцелл.
В нашей стране возможность применения РРИД с поли-Б-антигеном для дифференциальной диагностики бруцеллеза у крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма 19 и овец, привитых штаммом B.melitensis Рев-1, показаны С. Аскеровой (1985), однако по ее данным (1988), эта реакция выявляла больных бруцеллезом после 40-50 дней с момента инфицирования, причем сроки зависели от дозы заражающего штамма и способа его введения.
А.К. Булашевым с соавт. (1989) также был изготовлен поли-Б-антиген и установлена возможность проведения с его помощью дифференциальной диагностики у крупного рогатого скота, привитого агглютиногенными и слабоагг-лютиногенными противобруцеллезными вакцинами.
С целью дифференциации вакцинного и инфекционного процессов при бруцеллезе у людей В.Е. Маликовым, В.Л. Львовым и др. (1989) были изготовлены препараты поли-Б-антигенов из штамма B.abortus 16М (S-форма) и испытаны на больных бруцеллезом и здоровых, вакцинированных людях. Исследователями установлена возможность дифференциации больных бруцеллезом людей от вакцинированных, т.к. все сыворотки крови от больных, за исключением сыворотки с низкими титрами РА, имели позитивные показатели РРИД с поли-Б-антигеном, при отрицательных показателях теста у здоровых, привитых людей.
Отмечая возможность применения РРИД с поли-Б-антигеном для дифференциации больных бруцеллезом людей и животных от привитых, эксперты ФАО/ВОЗ указывают на недостаточную чувствительность этого метода (1986).
Исследователями изучалась возможность использования реакции гиперчувствительности замедленного типа или аллергической пробы для дифференциальной диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота и овец. В частности, М.К. Юсковец, 1957; Э.А. Алиев, 1987 и другие показали, что аллергическая настроенность носит более выраженный характер у естественно больных животных, чем у привитых.
В этой связи О.И. Моряковой, 1957; Ф.П. Локтевой, 1959; предложено применение аллергической пробы в комплексе с РСК для дифференциальной диагностики больного бруцеллезом и привитого штаммом 19 крупного рогатого скота.
Аналогичное мнение о возможности применения аллергической пробы для дифференциальной диагностики бруцеллеза у овец и крупного рогатого скота имели И.А. Косилов, 1962; В.Т. Котов, Б.Т. Артемов, 1962 и другие, которые считали возможным применять этот метод для эпизоотической оценки стад через год после вакцинации. В противоположность вышеизложенному А.А.Новицким с соавт. (1980) показано, что аллергическая проба может быть применена для дифференциации лишь у животных, привитых слабоагглютино-генным штаммом 82 во взрослом состоянии однократно. Вероятно, в связи с этим обстоятельством аллергическая проба не нашла применения в ветеринарной практике для целей дифференциальной диагностики бруцеллеза.
Значительные по объему исследования проведены учеными по изучению возможности использования тестов с молоком для дифференциальной диагностики больных бруцеллезом от привитых штаммом 19 (Е.С. Орлов, О.И.Морякова, 1955; В.В. Литвиненко, 1974; Т.Г. Попова, 1990; I. Drazan, V.Mader, 1956; G.S. Ferguson, A. Robertson, 1960).
В основном, большинство исследователей считали, что с помощью КР с молоком можно дифференцировать больных и привитых штаммом 19 животных (W.K. Hill, 1953; R. Worthington, 1969; I. Patterson, 1974).
фы
Испытание КР с молоком в экспериментальных условиях
Дальнейшие исследования по изучению диагностической ценности КР с молоком проведены нами в условиях экспериментов.
Результаты исследований животных опыта № 1 представлены в таблице 2.10.2.1.
Перед заражением у привитых животных КР была отрицательной, РА и РСК регистрировали только в одной группе у 14,0% коров.
Как показывают данные, приведенные в таблице 2.10.2.1., уже на второй день после заражения у 42,9% коров была отмечена РА и 21,4% животных имели положительную КР, на пятый день несколько увеличилось количество реагирующих в КР с молоком (до 28,6%). На седьмой день появились комплемен-тсвязывающие антитела в сыворотке крови у 85,7% коров, и почти вдвое увеличилось количество реагирующих в КР (до 50,5%), при этом титр у 21,4% животных повысился до 1:4.
В последующие сроки положительная КР отмечалась уже у 57,1-71,4% коров, из них имели КР с цельным молоком - 16,7%, титр 1:4- - 33,3%, 1:8 — 33,4% и 1:16 - 16,6% животных.
Культуру бруцелл заражающего штамма выделили от девяти животных, из которых у трех коров (33,3%) регистрировали КР только с цельным молоком, у остальных титр был от 1:4 до 1:16.
В опыте № 2, поставленном на коровах из неблагополучного по бруцеллезу хозяйства, перед заражением вирулентной культурой бруцелл КР была зарегистрирована у шести коров, из них с цельным молоком — у двух, в титре 1:2-1:4 — у четырех животных.
В ранние сроки после заражения агглютинины устанавливали у коров в цельном молоке и разведении 1:4. На 15-й день исследования титр КР 1:8-1:16 имели только два животных, тогда как у подавляющего большинства коров (11) титр КР составлял 1:2-1:4.
Накануне диагностического убоя в КР реагировало десять коров, агглютинины в цельном молоке обнаружены у трех, в разведении молока 1:2-1:4 — у семи голов. Культуры бруцелл вирулентного штамма выделили от четырех коров, которые имели титр КР 1:2-1:4.
В следующем опыте на пяти непривитых коровах, инфицированных вирулентной культурой бруцелл, как и в предыдущих опытах, установлена возможность выявления агглютининов в молоке в ранний срок после заражения (через семь дней) у 60,0% животных. На 14-28 дни реагировали почти все инфицированные животные как в КР, так и РА+РСК.
Агглютинины в молоке были выявлены у значительной части зараженных животных в цельном молоке, а также в титре 1:2-1:4 (71,4%), тогда как в титре 1:8-1:16-у 28,6% коров.
При бактериологическом исследовании молока от зараженных коров культуры бруцелл выделены от четырех коров, из которых накануне убоя КР с цельным молоком была положительной у одной, в титре 1:2-1:4 — у двух, одно животное имело агглютинины в разведении молока 1:16.
Опыт по изучению динамики КР у инфицированных коров на протяжении длительного периода с момента инокуляции возбудителя бруцеллеза наглядно показал высокую диагностическую ценность этого теста (табл. 2.Ю.2.2.).
Кроме того, в доступной литературе мы не обнаружили сведений, касающихся возможности выявления антител не в молоке, а в секрете молочной железы при полном прекращении лактации животных, что может иметь дальнейшее практическое значение, поскольку в отдельных стадах процент коров в сухостойном периоде бывает значительным.
Изучение эпизоотической опасности животных, диагностированных методом провокации антител к B.ovis
С целью изучения эпизоотической опасности животных, выявленных с помощью метода провокации антител, из совхоза «Чистовский» в ОПХ ВНИ-ИБТЖ переведено 15 баранов-производителей, из которых 10 имели различное сочетание иммунологических реакций, у 5 животных серологические реакции угасли.
После введения аллергена через 28 дней из числа отрицательно реагирующих у четырех вновь появились в сыворотке крови агглютинины и компле-ментсвязывающие антитела. У остальных животных резко повысился титр R-комплементсвязывающих антител в сыворотке крови. Даже с низкочувствительным овисным антигеном для РДСК Алма-Атинской биофабрики титр ком-плементсвязывающих антител повысился от 4 до 14 раз, овисным антигеном РСК ВНИИБТЖ - в 2-3 раза.
При бактериологическом исследовании патологического материала при убое 15-и баранов культуры B.ovis выделены от семи животных (46,7%).
Из числа животных, у которых выявили антитела к B.ovis после введения аллергена, у одного (инз. JY» 80390) выделена культура B.ovis. У животного № 80239 бруцеллоносительство подтверждено биопробой на морских свинках.
Кроме того, имелись доказательства наличия ИЭ баранов и у остальных двух животных: позитивный результат аллергической пробы и патологоанато-мические изменения в придатках семенников, характерные для ИЭ баранов. У остальных животных, в сыворотке крови которых отмечено резкое повышение уровня комплементсвязывающих антител, бактерионосительство установлено в шести случаях.
Таким образом, результаты изучения метода провокации антител в экспериментальных условиях показали, что у значительной части животных, утративших серопозитизность в различные сроки после заражения культурами
B.ovis, при введении вакцины штамма Rev-1 палпебральным, подкожным способами или аллергенов (бруцеллнна ВИЭВ, брунеллоовина) уровень специфических R-антител значительно повышается, что позволяет выявлять латентно больных животных.
Наиболее эффективно удается диагностировать таких животных на 21-28 дни после введения провоцирующих средств с помощью овисного антигена ВНИИБТЖ в РСК.
В экспериментальных условиях установлено, что эффективность метода провокации антител в значительной мере зависит от длительности периода, прошедшего с момента антигенной стимуляции. С увеличением продолжительности периода до 3-х лет (срок наблюдения) диагностическая ценность метода снижается.
Животные, выявленные методом провокации антител, как на введение вакцины Rev-І, так и аллергенов, представляют эпизоотическую опасность, поскольку являются бруцеллоносителями, о чем свидетельствуют данные бактериологических исследований. В производственных условиях в неблагополучных хозяйствах с помощью метода провокации антител при использовании бруцеллоовина или бруцеллина удается диагностировать животных с положительными серологическими реакциями.
При выполнении работы использовали 146 морских свинок, 20 кроликов, 430 собак.
Биологические сгіойстча шгаммен бактерии, выделенных от собак в полевых условиях, изучали по методикам, рекомендованным комитетом экспертов ФАО/ВОЗ по бруцеллезу (6-й доклад, 1986), в сравнении с референтным штаммом В. canis RM 6/66.
Дополнительно антигенную структуру штаммов бруцелл изучали с применением S-флюоресцирующих бруцеллезных иммуноглобулинов ИЭМ им. Н.Ф. Гамалея и R-бруцеллезных флюоресцирующих иммуноглобулинов, разработанных нами совместно с ИЭМ им. Н.Ф. Гамалея.
Для постановки РА и РСК изготавливали диагностикумы из стабильного штамма R-формы В. abortus 16/4, при этом в РА использовали антиген, окрашенный красителем Rose-Bengal, для РСК - извлеченный фенольным методом ВНИИБТЖ.
Аналогичными способами были сконструированы диагностикумы для РА и РСК из референтного штамма В. canis RM 6/66.
Прижизненное выделение возбудителя В. canis из крови собак проводили по методу Кастанеда.
Результаты изучения биологических свойств штаммов B.canis, выделенных от 8 собак разных пород г. Омска в сравнении с референтным штаммом В. canis RM 6/66, представлены в іаблице 2.19.Ї .1.
Данные таблицы показывают, что референтный штамм B.canis RM 6/66 имел характерные для него биологические свойства.
Все изученные штаммы бруцелл агглютинировались специфической R-бруцеллезной сывороткой и раствором акрифлавина, не взаимодействовали с S-бруцеллезной сывороткой в пластинчатой РА.
В РИФ наблюдали специфическое свечение микробных клеток лишь при контакте с R-бруцеллезными люминесшірующими иммуноглобулинами.
При изучении состава популяции у выделенных от собак культур определили, что 100,0% колоний окрашивались по Уайт-Вилсону в синий цвет, т.е. находились в R-форме. Эпизоотические штаммы не продуцировали сероводород, как и контрольный 3. canis R1VI 6/66.
Изучаемые штаммы бруцелл росли на среде с содержанием натриевой соли бензилпенициллина от 2,5 до 10 ЕД/мл, с основным фуксином и тионином — от 1:25000 до 1:100000, сафранином - от 1:2500 до 1:20000.
У референтного штамма В. canis RM 6/66 отмечали рост на МППА только с концентрацией пенициллина 0,5 ед/мл и отсутствие роста при более высоких концентрациях сафранина в средах, чем отличался от эпизоотических штаммов бруцелл.
Таким образом, все выделенные нами эпизоотические штаммы В. canis отнесены ко второму биотипу, поскольку отличались от референтного штамма В. canis RM 6/66 ростовыми свойствами при добавлении анилиновых красителей и антибиотика.
Похожие диссертации на Разработка и совершенствование средств, методов диагностики бруцеллеза животных и инфекционного эпидидимита баранов
