Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1. Характеристика вирусов группы бешенства 11
1.2. Методы лабораторной диагностики бешенства 18
1.2.1. Методы обнаружения антигена возбудителя бешенства и специфических к нему антител 18
1.2.2. Методы выделения вируса бешенства 26
1.2.3. Идентификация штаммов вируса бешенства с помощью мо-ноклональных антител 28
1.2.4. Методы обнаружения генома возбудителя бешенства 31
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 34
2.1. Материалы и методы исследований ...34
2.1.1. Материалы исследований 34
2.1.2. Методы исследований 36
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 40
3.1. Разработка диагностических препаратов для выявления и идентификации вируса бешенства на основе моноклональных антител (МКА) 40
3.1.1. Получение очищенного и концентрированного вакцинного вируса бешенства и его основных структурных белков 42
3.1.2. Изыскание оптимальной схемы гипериммунизации белых мышей линии ВALB/c антигеном возбудителя бешенства 49
3.1.3. Получение гибридом, продуцирующих МКА к структурным белкам возбудителя бешенства и изучение их свойств 52
3.1.4. Идентификация полевых штаммов возбудителя бешенства с помощью МКА к глико- и нуклеопротеинам рабического вируса 65
3.2. Применение гликопротеина вируса бешенства для выявления антирабических антител методом ИФА 72
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 75
ВЫВОДЫ 88
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 90
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 91
ПРИЛОЖЕНИЕ 124
- Характеристика вирусов группы бешенства
- Материалы и методы исследований
- Разработка диагностических препаратов для выявления и идентификации вируса бешенства на основе моноклональных антител (МКА)
Введение к работе
Актуальность проблемы. Бешенство - острое вирусное заболевание общее для животных и человека, характеризующееся признаками полиэнцефаломиелита с летальным исходом (Авилов В.М. и соавт., 1994; Никишин И.В. и соавт., 1995; Селимов М.А., 1998; Груздев К.Н. и соавт., 2001).
Сложная эпидемическая и эпизоотическая ситуация по этой инфекции наблюдается более чем в ПО странах мира (Дрансейка А.Л., Таршис М.Г., 1987). Ежегодно в мире погибает свыше 50 -70 тыс. человек и более 1 млн. животных. Число заболеваний домашних и диких животных в ряде регионов растет и, наряду с типичной, регистрируются и атипичные формы течения болезни (Панкова Г.Е., 1984; - Wikipedia, the free encyclopedia, 2006).
Как известно, для возбудителя бешенства характерны выраженная вариабельность антигенной структуры и изменчивость (Таршис М.Г. и соавт., 1990; Селимов М.А., 1998; Груздев К.Н. и соавт., 2001; Nadin Davis et al., 1993 и др.). В работах Н.А. Хисматуллиной, А.Н. Чернова, Р.Х. Юсупова и др. (1999-2006) установлено различие по степени патогенности эпизоотических изолятов, циркулирующих на территории Татарстана, индекс инвазив-ности для которых колеблется в пределах от 0,9 до 2,3. Однако до сих пор не ясно, в каких отношениях находятся антигенные структуры гликопротеида и нуклеокапсидного белка вакцинных штаммов и эпизоотических изолятов ра-бического вируса, циркулирующих на территории Республики Татарстан.
В целом применяемые в практике диагностические препараты на основе поликлональных антител, обеспечивая установление диагноза бешенства, не выявляют межштаммовые различия рабического вируса. Моноклональные антитела, обладая узкой специфичностью, позволяют идентифицировать штаммы рабического вируса, в частности, дифференцировать серотипы группы бешенства (Селимов М.А. и соавт., 1982-1998; Ботвинкин А.Д. и соавт., 1989-2004; Кузьмин И.В. и соавт., 1992; Кузьмин И.В., 1998; Wiktor Т.,
1975; Wiktor Т. et al., 1978-1981; Schneider L., et al., 1985; Lafon M., 1996; ОкопА.,2000идр.).
He менее актуален вопрос контроля эффективности вакцинопрофилак-тики бешенства животных, в особенности диких плотоядных, при оральной иммунизации.
Традиционно используемая реакция вирусной нейтрализации (РН) для выявления антирабических антител в сыворотке крови и других биологических жидкостях (Webster L., Dawson J., 1935; Briggs D. et al., 1998) трудоемка и требует длительного наблюдения.
Имеющиеся разработки метода ИФА для ускоренного определения титра антирабических антител в сыворотках крови людей и животных (Ботвинкин А.Д. и соавт., 1986; Сазанова Э.Я. и соавт., 1991; Хисматуллина Н.А.и соавт., 1989, 2000; Barton L.D., Campbell J.B. 1988; Elmgren L.D., Wandeler A.I. 1996; Atanasiu P. et al., 1977; Nicholson K.G., Prestage H., 1982) не вышли за рамки лабораторных исследований.
В связи с вышеизложенным, перспективным направлением в диагностике бешенства является применение моноклональных антител, а для контроля эффективности вакцинопрофилактики бешенства - метод ИФА.
Цель и задачи исследований. Целью работы явилось усовершенствование методов идентификации вируса бешенства и выявления антирабических антител. Для достижения данной цели решались следующие задачи:
Разработать технологию получения моноклональных антител к глико-и нуклепротеинам вируса бешенства для идентификации рабического вируса в патматериале.
Получить высокоактивный очищенный вирус бешенства, штамм «Овечий» ГНКИ, выделить его структурные белки (глико- и нуклеопротеи-ны), использовать их в качестве иммуногенов, а гликопротеин также - для иммуноферментного анализа активности антирабических сывороток.
Разработать схему гипериммунизации белых мышей линии BALB/c
антигеном вируса бешенства для получения спленоцитов, секретирующих специфические к нему антитела.
Получить гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к глико- и нуклеопротеинам вакцинного штамма «Овечий» ГНКИ рабического вируса, и изучить антигенное соответствие некоторых циркулирующих на территории Республики Татарстан эпизоотических изолятов вируса бешенства вакцинному штамму.
Изучить возможность применения гликопротеина вакцинного штамма вируса бешенства для выявления антирабических антител методом иммуно-ферментного анализа.
Научная новизна. На основании проведенных исследований впервые получены гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к возбудителю бешенства (штамм "Овечий" ГНКИ), и установлена возможность их применения в непрямом методе флуоресцирующих антител и сэндвич - варианте иммуноферментного анализа для выявления и идентификации возбудителя бешенства в патологическом материале. Показана возможность применения гликопротеина рабического вируса для выявления специфических антител в сыворотках крови животных, методом ИФА.
Практическая ценность. Установлена антигенная гомология эпизоотических изолятов, циркулирующих на территории Республики Татарстан, глико- и нуклеопротеинам вакцинного штамма вируса бешенства. Моноклональные антитела к глико- и нуклеопротеинам вируса бешенства рекомендуется использовать для идентификации возбудителя бешенства в патологическом материале. Выделенные структурные белки вируса бешенства (глико- и нук-леопротеины) могут быть применены в качестве антигенов для получения высокоспецифичных сывороток при создании более совершенных серологических тест-систем для диагностики и контроля вакцинопрофилактики бешенства.
На основании проведенных исследований разработаны и утверждены директором ФГУ "ФЦТРБ-ВНИВРТ' 2 инструкции и 1 наставление по применению.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:
Ежегодных отчетных научных сессиях ФГНУ «ВНИВИ» - ФГУ «ФЦТРБ» по итогам НИР за 2001 - 2005 гг.; Международной научно-практической конференции, посвященной 45-летию создания ВНИИВВиМ «Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов» (Покров, 2003); Международной научно-практической конференции, посвященной 60-летию факультета ветеринарной медицины УГСА «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» (Ульяновск, 2003); Всероссийской научно-практическй конференции посвященной 45-летию ВНИВИ (Казань, 2005); Международном симпозиуме «Научные основы обеспечения защиты животных от эко-токсикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» (Казань, 2005); Всероссийской научно-практической конференции "Перспективы агропромышленного производства регионов России в условиях реализации приоритетного национального проекта "Развитие АПК" (Уфа, 2006).
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.
Основные положения диссертации, выдвигаемые на защиту:
Получение очищенного и концентрированного вируса бешенства и его основных структурных белков - глико- и нуклеопротеинов.
Оптимальная схема гипериммунизации белых мышей линии BALB/c антигеном вируса бешенства.
Идентификация эпизоотических изолятов вируса бешенства методами иммунофлуоресценции и иммуноферментного анализа на основе антинуклео-и антигликопротеиновых МКА.
4. Применение гликопротеина рабического вируса для определения специфических антител в сыворотках крови животных, вакцинированных против бешенства, методом ИФА.
Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 124 страницах и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, практические предложения, список использованной литературы (всего 309 источников, в том числе 133 иностранных и 3 ссылки на сайты internet) и приложения. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами и 5 рисунками.
Характеристика вирусов группы бешенства
В соответствии с классификацией Международного Комитета по таксономии вирусов, возбудитель бешенства - РНК-содержащий вирус, относится к семейству Rhabdovirida, порядка Mononegavirales. Семейство Rhabdoviridae объединяет вирусы, выделенные от позвоночных, беспозвоночных и растений, состоит из пяти родов: Vesikulovirus, Lyssavirus, Ephemerovirus, Cytor-habdovirus, Nucleorhabdovirus (Virus Taxonomy, 7h, 2000; Franchi et al., 1991).
К рабдовирусам позвоночных относятся роды - Lyssa- и Vesiculovirus. Род Lyssavirus включает вирус бешенства и подобные вирусу бешенства (лиссаподобные) вирусы, которые характеризуются как общностью основных свойств генома вириона, так и способностью вызывать энцефалит у позвоночных животных. Кроме того, у всех видов рода Lyssavirus обнаружен общий групповой нуклеокапсидный антиген, который ответственен за продуцирование комплементсвязывающих, преципитирующих антител (Шуб-ладзе А.К. и соавт., 1974; Павловский В.В. и соавт., 1975; Вагапов P.M. и со-авт., 1979; Ванаг К.А. и соавт., 1979; Черкасский Б.Л.,1985). Установлен генетический полиморфизм гена нуклеопротеина вируса бешенства (Kissi В. et al.,I995).
Вирионы рабдовирусов имеют пуле- или бацилловидную форму, спиральный нуклеокапсид, окруженный белково-липидной оболочкой, с поверхностными выступами. На наружной поверхности вирусной частицы имеются выступы в виде шипов длиной 10 нм, которые прикреплены к двухслойной липидной оболочке (Каплан М.М. и соавт., 1966; Tordo N., 1996). При электрофорезе в полиакриламидном геле, содержащем додецилсульфат натрия, в составе вириона выявлены 4 мажорных и I минорный белковые компоненты с общей молекулярной массой 420-450 кД (Wunner W., 1988; Tordo N., 1988; Dietzschold В., 1996). Геномом является несегментированная одноцепочная негативно-спиральная РНК длиной около 12 тысяч пар оснований и молекулярной массой 3500-4600 кД, кодирующая пять основных белков: G, N, NS, М и L.
Вирионы содержат также РНК-зависимую РНК-полимеразу. Вирус име-ет плавучую плотность в CsCl-1,32 г/см . Вирион вируса бешенства содержит два основных антигена, один из которых представляет собой гликопротеин вирусной оболочки, второй - внутренний нуклеопротеид вириона (Дудников С.А. и соавт., 1997; Наумкина М.А. и соавт., 2000).
Полипептид с самой высокой относительной молекулярной массой (65-70 кД, 1800 молекул на вирион) оказался гликопротеином (G-белок), образующим шипы внешней оболочки. Он ответственен за продукцию вирус-нейтрализующих антител, антигемагллютининов и за формирование иммунитета к заражению вирусом бешенства. В связи с этим вируснейтрализую-щие антитела, направленные против гликопротеина (G-белка) вируса бешенства, являются важным компонентом иммунных реакций при бешенстве (Дудников С.А. и соавт., 1997; Dietzschold В. et al., 1986, 1996; Kissi В. et al., 1995). В то же время гликопротеин ВБ не выявлялся в мозге мышей, инфицированных уличным ВБ, но обнаруживался у мышей, зараженных штаммом CVS (Груздев К.Н., Недосеков В.В., 2001; Tsiang Н., 1983). Гликопротеин содержит три домена: N - концевой участок белка (эктодомен) расположен до позиции 439; трансмембранный домен локализован между 440 и 461 аминокислотами; С - концевой участок (эндодомен) расположен с 462 по 505 аминокислот. Экто- и эндодомены являются растворимыми фракциями гликопротеина. Основные функциональные регионы, включая нейтрализуемые эпитопы локализованы на эктодомене. Трансмембранный домен ацетилиро-ван и выполняет функцию внутриклеточного транспорта гликопротеина и формирования функциональной целостности белка, так как растворимые домены гликопротеина не способны индуцировать протективный иммунитет. Эктодомен играет ведущую роль в патогенезе болезни: в прикреплении вирионов к мембране клетки, как инициирующий шаг вирусной инфекции, и связывании с нейтрализующими антителами. По данным В. Dietzschold (1983), аргинин или лизин в позиции 333 являются ответственными за пато-генность ВБ и замена аргинина в позиции 333 на глютамин или изолейцин приводит к снижению патогенности в связи с отсутствием распознавания эпитопов оболочки вируса рецепторами клеток - хозяина (Morimoto К. et al., 1992; Gaudin Y., 1993). Установлено, что белок-G может иметь, по крайней мере, три различных состояния: нативное (N), обнаруженное на поверхности вириона при рН выше 7,0; активизированное (А) гидрофобное состояние, которое позволяет взаимодействовать с клеточной мембраной как первый шаг процесса слияния и бездействующее (www.cdc.gov/ncidod/dvrd/rabies).
Нуклеопротеин (N-белок) (относит, молекул, масса 57 кД, 1750 молекул на вирион) является группоспецифическим антигеном для всех лиссавиру-сов, выделенных на различных континентах. Он обнаруживается методом флуоресцирующих антител (МФА) - в реакциях связывания комплемента (РСК) и диффузионной преципитации (РДП), играет важную роль в формировании клеточного иммунитета. Нуклеопротеин вызывает образование в организме комплементсвязывающих и преципитирующих антител. Результаты современных исследований позволяют предполагать, что N-белок является основным антигеном, обладающим способностью стимулировать перекрестные реакции между вирусами бешенства и различными родственными ему вирусами (Груздев К.Н., Недосеков В.В., 2001; Ertl С, 1989, 1991; Frederic I. et al., 1998; Yang J. et al., 1998).
Материалы и методы исследований
В опытах применяли 2 штамма вируса бешенства (ВБ): вакцинный -"Овечий" ГНКИ (линия штамма Pasteur) и стандартный - CVS.
В работе использовали: 4 овцы массой 40-45 кг, 25 белых крыс массой 20-25 г., 1000 белых мышей беспородных массой 6-7 г, и 100 - линии BALB/c -массой 12-14 г.
В опытах in vivo применяли клеточную культуру NGUK-1 (Авцын А.В. и соавт., 1984), перевиваемые миеломные клетки SP 2/0 - Ag 4.1. Для поддержания роста культуры клеток NGUK-1 использовали среды Игла-MEM и RPMI-1640, рН 7,2-7,4 с 3%-ным глютамином, 10 % фетальной сывороткой крови КРС. В культуральную среду добавляли пенициллин - 100 ЕД/мл и стрептомицин -1 мг/мл.
В экспериментах использовали калибровочный набор белков для электрофореза (Pharmacia Biotech, USA), содержащий фосфорилазу Б мышц кролика (94000 Д), бычий сывороточный альбумин (67000 Д), овальбумин (43000 Д), карбоангидразу эритроцитов быка (30000 Д), ингибитор трипсина из бобов сои (20100 Д), альфа лактоальбумин (14400 Д), сахарозу, блокирующий раствор "NEW LAV BLOT I R2", 5X ("Sanofi diagnostics pasteur, France") и др.
В работе применяли следующие химические вещества: акриламид, аммоний надсернокислый, ацетон, бромфеноловый синий, гидроксид аммония, гидроксид натрия, глицерин, додецилсульфат натрия (Sigma, USA), изопро-пиловый спирт, кислоту аминоуксусную (глицин), краситель Понсо С, Ку-масси ярко-голубой R-250, лимонную кислоту, метиловый спирт, серноватисто-кислый натрий (тиосульфат натрия), спирт этиловый ректификованный 96%, твин-20 ("Ferak", Берлин), трис(гидроксиметил) аминометан, трихло-руксусную кислоту, уксусную кислоту, фенол, формалин, хлороформ, эфир, 2-меркаптоэтанол, 3,3 -диаминобензидин тетрагидрохлорид, N,N,Nf,N -тетраметилендиамин ("Reanal", Венгрия), Ы,Ы -метиленбисакриламид и др.
Исследовано 12 проб патологического материала (головной мозг), из них 4 - от сельскохозяйственных, 3 - от домашних и 5 - от диких животных, поступившего в различные годы из неблагополучных по бешенству районов Республики Татарстан. В опытах исследовали также 77 образцов сывороток крови овец, иммунизированных антигеном возбудителя бешенства.
Контролями в опытах служили суспензии головного мозга интактных белых мышей (контрольный отрицательный антиген), а так же иммуноглобулины (Ig) сывороток крови неиммунизированных животных.
В качестве контрольного положительного антигена использовали мозг белых мышей, зараженных вирусом бешенства (ВБ), штамм «Овечий» ГНКИ, в качестве гетерологичного антигена - мозг мышей, зараженных вирусом болезни Ауески (ВБА), штамм ВГНКИ.
Все контрольные и испытуемые образцы готовили в виде 10%-ной суспензии мозга на 0,85%-ном растворе NaCl с добавлением пенициллина и стрептомицина. Антигены предварительно осветляли центрифугированием при 800 g в течение 15 мин, инактивировали при 56 С в течение 30 мин.
В работе использовали диагностические наборы, разработанные во ВНИВИ (г. Казань): «Флуоресцирующий антирабический глобулин» (ТУ 9388-012-00492374-99), зарегистрированный в РФ № Р 066-1-4.9-0567 и сертифицированный № РОСС RU. ФВ 01. В 12858 и «Набор препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом иммуноферментного анализа (ИФА)» (ТУ 9388-083-00008064-98), зарегистрированный в РФ № р 066-1-4.9-0588 и сертифицированный № РОСС RU. ФВ 01. В 12857.
В экспериментах применяли диагностические антитела против иммуноглобулинов барана и белой мыши, меченные пероксидазой и флуоресцинизо-тиоционатом, производства НИИЭиМ им. Н.Ф. Гамалеи (Москва).
В процессе работы использовали следующее оборудование: спектрофотометр СФ-46, сканирующий спектрофотометр "Titertek multiskan" фирмы "Flow laboratories" (Финляндия), люминесцентный микроскоп ЛЮМАМ-И2, фотоэлектроколориметр КФК-2, термостат, холодильные установки, инвертированный микроскоп, СОг-инкубатор, аппараты для вертикального гель-электрофореза (АВГЭ-1) ("Хийу Калур", Таллин), весы аналитические АДВ-200М, иономер универсальный ЭВ-74, магнитную мешалку, микропипетки автоматические «Ленпипет», ультрацентрифугу «Beckman L-5» и др.
Разработка диагностических препаратов для выявления и идентификации вируса бешенства на основе моноклональных антител (МКА)
Перспективным в диагностике бешенства является применение моноклональных антител (МКА), обладающих моноспецифичностью, по сравнению с поликлональными антисыворотками, и позволяющих проводить дифференциацию штаммов рабического вируса (Ботвинкин А.Д., Селимов М.А. и др., 1992; Кузьмин И.В., Лукашенко З.С., 1998; Селимов М.А., Ботвинкин А.Д. и др., 1994 и др.).
Целью исследований являлась разработка технологии получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к глико- и нуклеопротеинам вакцинного штамма рабического вируса и изучение возможности их применения для идентификации возбудителя бешенства. Общая схема получения МКА представлена на рис. 1, которая включает следующие этапы: 1) подготовку и слияние иммунных спленоцитов и миеломных клеток; 2) тестирование гибридом с целью отбора клонов, продуцирующих антитела; 3) получение культур гибридомных клеток для накопления МКА; 4) использование МКА по целевому назначению.
При получении МКА к антигену возбудителя бешенства мы руководствовались приведенной схемой. Первой стадией в получении гибридом является получение селезеночных иммунных В-лимфоцитов, служащих родительскими клетками для слияния с миеломной культурой. Важным условием для получения антителопродуцирующих гибридом является изыскание оптимальной схемы иммунизации доноров спленоцитов - линейных мышей, эффективность которых определяется, в частности, активностью и специфичностью иммунизирующего антигена.
Для получения культурального вируса бешенства проводили заражение культуры клеток невриномы Гассерова узла крысы (NGUK - 1) путем внесения 10%-ной суспензии мозга белых мышей, инфицированных вирусом бешенства, штамм "Овечий" ГНКИ, с титром инфекционности не менее 5 lg LD50/MJI, В суспензию клеточной культуры в концентрации 5x105 кл/мл в соотношении 1:1. Всего проведено 10 пассажей. Зараженность культуры клеток контролировали по МФА, а наличие вируса в культуральной жидкости - методом ИФА. Суспензию зараженных клеток подвергали трехкратному замораживанию-оттаиванию и низкоскоростному центрифугированию при 800 g в течение 15 мин. Для дальнейшей очистки и концентрирования использовали культуральный вирус с титром инфекционности не ниже 51gLD50/Mn.
Схема получения и применения очищенного и концентрированного ВБ, штамм «Овечий» ГНКИ и его основных структурных белков представлены на рис. 2.
С целью выделения вирусных частиц из супернатанта, очистки и концентрирования испытывали три метода: осаждение вируса ацетатом цинка по F. Sokol (1975), 2,5 %-ным полиэтиленгликолем (ПЭГ) М 6000, а также ультрацентрифугирование (УЦФ) по В. Dietzschold (1996) с нашими модификациями.
Осаждение рабического вируса ацетатом цинка проводили 1М раствором, рН 5,0, в соотношении 50 : 1. Смесь выдерживали при +4 С в течение 60 мин., образующийся преципитат собирали центрифугированием при 1000 g в течение 40 мин. Надосадочную жидкость удаляли, осадок ресуспен-дировали в насыщенном растворе двунатриевой соли этилендиаминатетраук-сусной кислоты (ЭДТА), рН 7,8. Объем раствора ЭДТА составлял не менее 1,25% от исходного объема вируссодержащей жидкости.
