Введение к работе
1.1. Актуальность проблемы. Лейкоз крупного рогатого скота -хроническая инфекционная болезнь опухолевой природы, наносящая значительный экономический ущерб животноводству и представляющая потенциальную опасность для генофонда племенного и молочного стада (Л.К. Эрнст, В.П. Шишков, 1984; В.М.Авилов, В.М.Нахмансон, 1995; М.З.Хайруллин, 1998; Ф.Ф Хисамутдинов, 1997; Н.И.Петров, 1997 и др.). Этиологическим агентом лейкоза является вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) - представитель семейства Retroviridae (Р.А.Кукайн и др., 1976; М.И.Парфанович и др., 1974; В.П.Шишков, 1977; В.А.Крикун, 1999; Miller et al., 1969; Ferrer et al., 1971; и др.) Благодаря наличию в своем составе уникального фермента - РНК-зависимой ДНК полимеразы (ревертазы), геном ВЛКРС может полностью или частично интегрироваться с геномом клетки-хозяина и долгое время существовать в форме провируса (Klintevoll, 1995). В этот период, который может продолжаться от нескольких месяцев до нескольких лет, у животных не наблюдается никаких признаков заболевания, включая отсутствие антител (Р.А.Кукайн и др., 1982; В.М.Нахмансон, 1986), поэтому особо важное значение приобретает выявление как специфических антител, так и самого вируса лейкоза (В.П.Шишков, Л.Г.Бурба, 1983; ПН.Смирнов, 1991; АВ.Валихов, 1992, 1994; Н.В.Кузнецова, 1997; Kleitevall et al., 1994; Oie, 1996). В последние годы в нашей стране и за рубежом разработаны и рекомендованы иммунологические методы (реакция диффузионной иммунопреципитации, реакция непрямой гемагглютинации, ELISA и др.) выявления животных, инфицированных ВЛКРС (Л.Г.Бурба, А.Ф.Валихов, 1976; А.Ф.Валихов и соавт., 1977; П.Н.Смирнов, 1991; А.Ф.Валихов, 1992; П.Н.Смирнов и соавт., 1996, 1997). Следует заметить, что каждая из этих реакций в отдельности выявляет неодинаковое число положительно реагирующих животных. Наиболее полное выявление инфицированных ретровирусом животных достигается путем комплексного исследования их с помощью разных методов (Г.Ф.Коромыслов и соавт., 1979). Перспективными лабораторными методами, которые также направлены на выявление антител к главному внутреннему белку р24 и к гликопротеиду (gp 51) оболочки ретровируса по мнению Burny et al., (1985,1988) являются реакция длительного связывания комплемента (РДСК) и иммуноферментный анализ (ИФА). Для получения антигенов вируса лейкоза используют культуры клеток эмбриона овцы (ПЭО), тимуса эмбриона коровы (ТЭК), селезенки эмбриона коровы (СЭК), персистентно продуцирующих вирус лейкоза (Л.Г.Бурба и соавт., 1976; В.А. Крикун, 1976). Перед исследователями в этом плане стоит задача поиска новых подходов в более полном выделениг; вирусспецифических белков из культуральных жидкостей при получении антигенов ВЛКРС, последующей их очистки с целью приготовления диагностических препаратов высокой специфичности. Важно выяснение оптимальных сроков культивирования после засева клеток, способы их
культивирования, концентрация клеточной взвеси на единицу объема, применение различных методов обогащения сред и схем культивирования.
Почти на протяжении века ученые многих стран проводили исследования по изучению этого заболевания и лишь 1969 год вошел в историю как год открытия вируса лейкоза крупного рогатого скота - ВЛКРС (Miller et al, 1969; Ferrer, 1980). В последующих работах детально изучена морфология и морфогенез вируса и установлена его онкогелная активность. Так, экспериментами на телятах доказана инфекционность и лейкозогенность ВЛКРС (Л.Г.Бурба и соавт., 1976; В.П.Шишков, 1977). Установлено также, что к ВЛКРС чувствительны овцы (Olsen et al, 1978, Л.Г.Бурба, А.А.Кунаков,1983), козы (Ressang, 1976), свиньи (Г.П.Ефремов с соавт., 1979). Однако остаются неизученными чувствительность к ВЛКРС лабораторных животных (кроликов) и возможность использования их для выделения, культивирования вируса, получения гетерологичных иммунных сывороток и других целей.
Показано, что болезнь появляется в хозяйствах, в основном, после ввоза племенного молодняка из стад, неблагополучных по этому заболеванию (Л.Г.Бурба, 1979). Однако пути заражения, выделения и распространения ВЛКРС остаются еще мало изученными. Представляет большой интерес вертикальная (пренатальная) передача ВЛКРС от матери плоду. К началу наших исследований имелись лишь отдельные предварительные сообщения о внутриутробной передачи ВЛКРС плоду (Ferrer, 1976; Piper et al., 1979; В.М.Нахмансон и др.,1981), не изучены механизм и частота этого пути передачи вируса и степень значения его в плане оздоровления хозяйств от лейкозов.
Остается нерешенным вопрос о роли молозива и молока как факторов передачи ВЛКРС потомству и в образовании у телят колострального иммунитета. Не выяснена эпизоотологическая роль овец как источника распространения ВЛКРС горизонтальным путем. Имеются единичные сообщения о создании препаратов для активной специфической иммунопрофилактики крупного рогатого скота (М.И.Парфанович и соавт., 1980, 1981, 1982; В.М.Жданов и др., 1979, 1983; Л.Г.Бурба и др., 1981;. Р.А.Кукайн и соавт., 1980; Miller et al., 1978, 1983). Однако эти сообщения до последнего времени остаются дискутабельными и требуют дальнейшего экспериментального изучения.
Борьба с лейкозом крупного рогатого скота находилась в прямой зависимости от степени изученности данного заболевания и существующих методов распознавания болезни. Фактически, систематическая борьба с лейкозом крупного рогатого скота началась после разработки прижизненного гематологического метода диагностики - "лейкозного ключа" (Gotze et al., 1954). Путем гематологического исследования поголовья скота в хозяйствах, выявляли больных лейкозом и сдавали на мясо. Этим же методом выяснялась эпизоотическая ситуация по данной болезни. Впервые противолейкозные мероприятия на государственном уровне были проведены в Дании с 1959 по 1978 гг. В течение 5-6 лет было ликвидировано более 600 неблагополучных по
лейкозу ферм с убоем более 35 тыс. животных (Benfixeen, 1963, 1973; Fleusburg, 1982). В нашей стране с индустриальным типом ведения животноводства оздоровительные мероприятия имеют свои особенности, определяемые прежде всего высокой концентрацией поголовья в хозяйствах (А.Т.Шиков, 1975; Г.А.Симонян, 1984). Широкое распространение лейкозной инфекции, отсутствие достаточного количества здоровых животных для замены поголовья неблагополучных по лейкозу стад и средств для компенсирования убытков хозяйствам при ликвидации стад, вынудили разрабатывать в нашей стране более приемлемые методы оздоровления (Г.А.Симонян, 1985; В.А.Крикун с соавт., 1984; Г.А.Симонян с соавт., 1988, 1990; ЛГ.Бурба, 1985; В.П.Шишков и соавт., 1988; П.Н.Смирнов и соавт., 1989, 1991; Ю.А.Симоварт, 1991; Ф.Ф.Хисамутдинов, 1994,1996; М.З.Хайруллин, 1998).
В настоящее время почти во всех областях, краях и республиках РФ разрабатываются и утверждаются комплексные планы по профилактике и ликвидации лейкоза крупного рогатого скота (В.М.Авилов, 1990; В.А.Седов, 1990; В.М.Авилов, В.М.Нахмансон, 1995; Н.И.Петров, 1999). Эпизоотологическими наблюдениями была установлена прямая корреляция между частотой инфицированности животных ВЛКРС и числом выявляемых гематологически больных лейкозом животных. Наряду с общими закономерностями заноса и распространения ВЛКРС и общепринятыми методами проведения противолейкозных мероприятий, в каждом регионе и, даже хозяйстве, имеются свои особенности, вносящие коррективы в выяснения эпизоотической ситуация искоренения лейкоза.
Исходя из этого, представляет большой научный и практический интерес установить сроки оздоровления стад с использованием серологических методов в зависимости от степени пораженности поголовья лейкозом и ВЛКРС, породы животных, технологии ведения животноводства и методов осуществления противолейкозных мероприятий.
1.2. Цель и задачи исследований. Целью нашей работы явилось научно-теоретическое обоснование и экспериментальная проработка важнейших иммунологических аспектов передачи вируса и антител потомству от коров, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, совершенствование методов и средств диагностики, мер борьбы и профилактики заболевания.
В соответствии с целью были сформулированы следующие задачи:
1.2.1. Разработать новые технологии культивирования перевиваемых
клеточных линий, хронически инфицированных вирусом лейкоза крупного
рогатого скота, для получения гликопротеидного и полипептидного антигенов
ВЛКРС для постановки серологических реакций.
1.2.2. Разработка и усовершенствование лабораторных .методов
диагностики лейкоза:
- провести исследования по выяснению чувствительности к ВЛКРС овец и кроликов и возможности использования их в качестве биологической модели
в биопробе для выявления ВЛКРС в различных материалах, содержащих этот вирус;
- разработать новые иммунологические методы - РДСК и ИФА для
выявления специфических антител в сыворотке крови инфицированных
ретровирусом коров и провести сравнительное изучение их чувствительности с
РИД, а также гематологическим методом;
1.2.3. Изучить иммунологические аспекты передачи вируса и антител
потомству от коров и овец, инфицированных вирусом лейкоза крупного
рогатого скота:
изучить пренатальное заражение телят и ягнят, родившихся от матерей, больных лейкозом или только инфицированных ВЛКРС, и выяснить механизм внутриутробной передачи вируса лейкоза от коров и овец потомству;
определить роль молозива и молока как факторов передачи ВЛКРС телятам и ягнятам, образование и напряженность колострального иммунитета у телят.
-
Изучить возможность получения иммуногенного для телят и обладающего защитным действием инактивированного препарата из ВЛКРС, накопленного в перевиваемой культуре клеток ПЭО.
-
Изучить особенности распространения онкорновирусной инфекции и лейкоза крупного рогатого скота в различных территориально-географических зонах Республики Башкортостан и на основе полученных данных разработать и реализовать в условиях производства комплексную научно-обоснованную систему оздоровительно-профилактических мероприятий по лейкозу.
1.3. Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые отработаны условия и сроки стационарного и роллерного культивирования линии клеток ПЭО, ТЭК и СЭК-продуцентов ВЛКРС, предложены оптимальные концентрации клеточной взвеси, объемы питательной среды и методы их обогащения. Были изучены и предложены для производства препаративного количества диагностикумов ВЛКРС благоприятные режимы культивирования и питания клеток с использованием микроносителей, выяснены возможности культивированы клеточных линий в условиях суспензии. При этом была осуществлена разработка технологии культивирования клеток с периодической сменой среды, позволяющая сократить расход дорогостоящей сыворотки крови эмбрионов коров и заменить ее сыворотками крови овец, телят, лошадей, коров. Проведена оценка эффективности осаждения белков ВЛКРС из культуральных жидкостей сульфатом аммония, полиэтиленгликолем, методом фазовых систем при различных режимах центрифугирования в сравнении с ультрафильтрацией. Были изучены и предложены оптимальные методы осаждения и центрифугирования (без применения дорогостоящих импортных ультрацентрнфуг), очистки, концентрирования ВЛКРС и дана сравнительная оценка продукции антигенов вируса лейкоза клетками ПЭО, ТЭК и СЭК при различных методах и режимах. Разработаны методы обнаружения
специфических антител - РДСК и ИФА с применением в качестве антигена гликопротеид 51 ретровируса, изучена их специфичность и активность по сравнению с РОД, а также гематологическим методом выявления больных животных. Предложено использование кроликов как чувствительной биологической модели для выделения ВЛКРС из материала (кровь, суспензия органов и тканей), содержащего вирус. Экспериментально доказано пренатальное заражение телят, родившихся от коров, инфицированных ВЛКРС, и установлено, что частота внутриутробной передачи ВЛКРС от матери плоду зависит от стадии болезни и наблюдается, в основном, при клинико-морфологическом проявлении лейкозов у матерей. Показано, что степень внутриутробной передачи вируса лейкоза плодам среди животных отдельных семейств была существенной, пренатальное заражение отмечалось у дочек и внучек, а также у телят, родившихся от одной и той же матери, в течение нескольких отелов. Пренатальное заражение телят происходит посредством лимфоцитов матери, содержащих ВЛКРС, проникающих через плаценту в различные сроки развития плода. При заражении плода на ранней стадии развития до образования компетентной иммунной системы отмечается толерантность организма плода ВЛКРС.
Установлено, что телята и ягнята, родившиеся от больных лейкозом или инфицированных ВЛКРС матерей, при подсосном методе выращивания получали с молозивом антитела, предохраняющих их от заражения в течение 4-5 месяцев при совместном содержании с инфицированными животными. Среди телят с колостральным иммунитетом 60% животных предохранялось от заражения после подкожного введения им ВЛКР.
Овцы, у которых после заражения ВЛКРС развивался инфекционный процесс без клинико-морфологического проявления лейкоза, не передавали пренатально вирус ягнятам. У овец не отмечали горизонтальной (контактной) передачи ВЛКРС при длительном совместном содержании здоровых и инфицированных животных.
Показана способность инактивированного ВЛКРС, накопленного в перевиваемой культуре клеток ПЭО, вызвать у телят иммунную реакцию и устойчивость к заражению вирулентным вирусом.
Изучены особенности распространения болезни, выявлены тенденции проявления эпизоотического процесса лейкоза в районах Республики Башкортостан. Установлены причины неодинаковой пораженности животноводческих ферм и тенденции к широкому распространению ВЛКРС и болезни. Изучена степень прогрессивного нарастания числа больных и инфицированных ВЛКРС животных в зависимости от их возраста. Усовершенствована система различных вариантов оздоровления неблагополучных по лейкозу хозяйств в зависимости от степени поражения стад, включая организационно-хозяйственные и специальные ветеринарпо-санитарные мероприятия с учетом категории хозяйств. Показана эффективность использования в системе противолейкозных мероприятий методов раннего выявления инфицированных и больных лейкозом животных.
1.4. Практическая значимость работы. Крупномасштабные
комплексные эпизоотологические, клинико-серологические,
экспериментальные исследования позволили разработать и внедрить следующие практические предложения:
- разработана и освоена технология серийного производства антигена
ВЛКРС путем усовершенствования культивирования клеток-продуцентов
вируса лейкоза, применения новых питательных сред, использования
сывороток крови различных видов животных при культивировании хронически
инфицированных ВЛКРС клеток. Эти данные вошли в следующие разработки:
"Методические рекомендации по использованию сыворотки крови молодняка
крупного рогатого скота, свободного от ретровируса лейкоза для наработки
гликопротеидного антигена" (одобрены Ученым Советом ВИЭВ 4.04.1983г);
"Методика по изготовлению и контролю гликопротеидного антигена вируса
лейкоза крупного рогатого скота для постановки реакции иммунодиффузии"
(утв. ВАСХНИЛ, 1991); "Авторское свидетельство № 1378113 "Способ
получения антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота для
диагностических целей" (1987);
разработаны, усовершенствованы и освоены лабораторные методы (РИД, РДСК, ИФА) для выявления специфических антител в сыворотке крови инфицированных ретровирусом животных. Рассмотрены и утверждены секцией отделения ветеринарии ВАСХНИЛ "Временные методические рекомендации постановки реакции длительного связывания комплемента в микрообъемах (РДСКМ) для серологической диагностики онкорновирусной инфекции, ассоциированной с лейкозами крупного рогатого скота" (Москва, 1981), "Методика по изготовлению и контролю гликопротеинового антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота для постановки реакции иммунодиффузии" (утв. Ученым Советом ВИЭВ, Москва, 1987), "Методические рекомендации по постановке реакции иммунной диффузии в агаровом геле" (утв. методической комиссией БГАУ, Уфа, 1998); "Временное наставление по применению РДСК для выявления специфических антител к возбудителю лейкоза (в порядке производственной апробации)"- (утв. Департаментом ветеринарии МСХиП РФ 30 августа1999 г.); "Временное наставление по применению набора компонентов для выявления методом ИФА специфических антител к возбудителю лейкоза (в порядке производственной апробации)" - (утв. Департаментом ветеринарии МСХиП РФ 30 сентября 1999 г.).
показана чувствительность кроликов к вирусу лейкоза крупного рогатого скота и возможность использования их для выделения вируса из материала от инфицированных животных и длительного культивирования его в организме гетерологичных животных;
- установлена внутриутробная передача вируса лейкоза телятам и степень
их инфицированности, которая связана со стадией и тяжестью болезни у
матери, что подтвердила необходимость удаления из хозяйств коров с высоким
лимфоцитозом, как животных с повышенным риском внутриутробной передачи
вируса потомству;
установлена продолжительность пассивного (колострального) иммунитета у телят и ягнят, родившихся от матерей, больных лейкозами, :понтанно или экспериментально инфицированных ретровирусом и дана количественная характеристика титра антител в динамике с использованием РИД, РДСК. Путем скармливания телятам в первые дни жизни молозива, :одержащего колостральные антитела против ВЛКРС, можно трофилактировать их заражение вирусом лейкоза в течение 4-5 месяцев. Изолированное выращивание телят, свободных от ретровируса, но родившихся эт инфицированных ретровирусом матерей до исчезновения колостральпых штител, является одним из мер борьбы с лейкозами крупного рогатого скота.
Полученные новые научные данные и данные эпизоотологических наблюдений по выяснению причин появления и распространения вирусной анфекции, эффективности оздоровительных противолейкозных мероприятий позволили разработать и внедрить в производство: "Программу профилактики л борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в хозяйствах, промышленных дамплексах и станциях искусственного осеменения Калужской области на 1983-1988 гг" (одобрена коллегией управления сельского хозяйства Калужского эблисполкома. Калуга, 1983)"; "План организационно-хозяйственных, 5етеринарно-санитарных и специальных мероприятий по профилактике и ликвидации лейкоза крупного рогатого скота в хозяйствах Республики Башкортостан на 1997-2000 годы" (согласовано Заместителем Министра :ельского хозяйства и продовольствия и утв. Начальником Управления зетеринарии МСХиП Республики Башкортостан).
1.5. Основные положения диссертации выносимые на защиту.
1. Результаты разработки технологий культивирования перевиваемых
іиний клеток, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, для
толучения гликопротеидного и полипептидного антигенов ВЛКРС с целью
тостановки серологических реакций.
2. Результаты разработки РДСК и непрямого варианта
шмуноферментного анализа (ИФА) для выявления специфических антител к
ЗЛКРС в сыворотке крови крупного рогатого скота и их сравнительная оценка
: РИД, а также гематологическим методом.
3. Результаты изучения чувствительности к ВЛКРС телят, овец и
сроликов и возможности использования их в качестве биологической модели
іля выявления вируса в патологическом материале.
-
Пути и факторы передачи ВЛКРС и их значение в эпизоотическом іроцессе лейкоза крупного рогатого скота.
-
Особенности распространения онкорнавирусной инфекции и лейкоза срупного рогатого скота в различных административно-географических зонах 'еспубликиБашкортостан.
-
Нучно-обоснованная усовершенствованная система борьбы с лейкозом срупного рогатого скота, результаты её испытания в модельном районе РБ.
1.6. Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены и одобрены на научных конференциях и симпозиумах: Всесоюзной научной конференции "Распознавание и меры борьбы с лейкозом человека и животных" (Белая Церковь, 1982); Республиканской научно-производственной конференции "Современные проблемы профилактики и лечения зоонозных заболеваний и лейкозов" (Гродно, 1982); II съезде гематологов и трансфузиологов, Москва, 1985; Республиканской научно-производственной конференции "Диагностика, профилактика и борьба с лейкозом крупного рогатого скота (Персиановка, 1986); Республиканской конференции "Теоретические и практические вопросы ветеринарии" (Тарту, 1987-1990); Республиканской конференции "Ветеринарная медицина, экономические, социальные и экологические проблемы" (Харьков, 1990); Республиканской конференции "Состояние и пути развития животноводства в Республике Башкортостан" (Уфа, 1994, 1995, 1997, 1998).
-
Публикации. По теме диссертации опубликовано 58 научных работ, в том числе монография: Вирус лейкоза крупного рогатого скота (культуральные, инфекционные и иммуногенные свойства), Уфа, 1999, 152 с.
-
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы из источников и приложений.
Материал изложен на страницах машинописного текста, иллюстри-
рован таблицами и рисунками.
