Содержание к диссертации
Введение
1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Этиологические и эпизоотологические аспекты микоплазмоза свиней 9
1.2. Методы лабораторной диагностики микоплазмозов 14
1.2.1. Культивирование микоплазм на питательных средах 18
1.2.2. Серологические и иммунологические методы диагностики микоплазмоза 23
1.3. Чувствительность микоплазм к атибиотикам и лечение животных, больных микоплазмозом 32
1.4. Заключение 36
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 39
2.1. Материалы и методы 39
2.2. Изучение эпизоотической ситуации по микоплазмозу свиней и ассоциативным формам его проявления в хозяйствах Омской и Тюменской областей 42
2.3. Микробиологические методы диагностики микоплазмоза свиней 48
2.3.1. Индикация и идентификация микоплазм на питательных средах 48
2.3.2. Основные биологические свойства микоплазм 52
2.3.2.1. Морфологические свойства 52
2.3.2.2. Биохимические свойства 53
2.3.2.3. Патогенные свойства 56
2.4. Серологические методы диагностики микоплазмоза 58
2.4.1. Получение микоплазмозных антигенов и диагностических сывороток для РНИФ 58
2.4.1.1. Изучение специфичности и активности микоплазмозных анти генов и гипериммунных сывороток в РНИФ 61
2.4.2. Изготовление микоплазмозного эритроцитарного диагностикума (МЭД) для реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) 65
2.4.2.1. Изучение специфичности и активности МЭД в РИГА 67
2.4.3. Сравнительная оценка диагностической ценности микробиологического и серологических (РНИФ, РИГА) методов диагностики микоплазмоза свиней в производственных уловиях 69
2.4.3.1. Сравнительное изучение чувствительности микробиологического, серологического (РНИФ) экспресс-методов диагностики микоплазмоза свиней и метода полимеразной цепной реакции 85
2.5. Изыскание средств и методов лечения свиней при микоплазмозе, в том числе и ассоциированном с другими инфекциями 87
2.5.1. Определение чувствительности выделенных от свиней культур микоплазм к антибактериальным препаратам in vitro 87
2.5.2. Изучение различных схем лечения свиней при микоплазмозе и ассоциативных формах его проявления 91
2.5.3. Экономическое обоснование схем лечения 98
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 102
ВЫВОДЫ 110
ПРАКТИЧЕСІСИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 112
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 113
ПРИЛОЖЕНИЕ 138
- Методы лабораторной диагностики микоплазмозов
- Индикация и идентификация микоплазм на питательных средах
- Изготовление микоплазмозного эритроцитарного диагностикума (МЭД) для реакции непрямой гемагглютинации (РИГА)
Введение к работе
Актуальность темы. Развитие свиноводства на промышленной основе заострило в числе многих других проблему сохранения репродуктивных способностей маточного стада. Экономический ущерб от микоплазмоза обусловлен снижением массы тела животных, потерей племенных качеств, замедлением роста и развития, низкой оплатой корма, появлением заморышей, гибелью поросят и значительными затратами на лечение и оздоровительные мероприятия.
В данное время широко дискутируется вопрос о первостепенной роли микоплазм в патогенезе заболеваний со смешанной этиологией, их сочетанном действии с другими бактериями и вирусами. Общего ответа быть не может, но микоплазмы, являясь самостоятельной группой, в содружестве с другими микроорганизмами усиливают свое патогенное действие (Г.Г. Миллер, И.В. Раковская, В.Э. Березин, 1991; А.Я Пусто-вар, 1995; П.П. Фукс, 1995; С. Liu, RJ. Baier, XJ. Qu, 1997). Особое значение это явление приобрело в последние годы, т.к. в условиях хозяйств, особенно крупных, все чаще одновременно обнаруживаются не- . сколько инфекций. Микоплазмоз повышает восприимчивость свиней к вторичным инфекциям, что делает его течение более тяжелым, зачастую приводя к гибели.
Развитие техники и методов микоплазматологии лишь недавно позволило начать исследования по определению роли микоплазм в патологии органов воспроизводства свиней. Одновременно у свиней обнаружены уреаплазмы, их значение в патологии свиней изучено недостаточно.
Лабораторная диагностика микоплазмозов и уреаплазмозов требует усовершенствования, так как при выделении возбудителей этих болезней используют сложные микробиологические и культуральные методы, пока еще не доступные для большинства лабораторий (Фукс П.П., Калашник Н.В., Герус Г.Б., 1995; Гречухин, А.Н., 1997).
В связи с этим весьма актуальным является проведение своевременной диагностики микоплазмоза в ассоциации с сопутствующими микроорганизмами, что позволит выявлять больных животных, носителей и разрабатывать меры по борьбе с этим заболеванием. Все это послужило основанием для проведения данных исследований.
Цель работы. Усовершенствовать экспресс-методы диагностики микоплазмоза свиней, в том числе при ассоциативных формах его проявления и разработать схемы лечения больных животных.
Задачи исследований:
- изучить эпизоотическую ситуацию по микоплазмозу свиней и ассоциативным формам его проявления в хозяйствах Омской и Тюменской областей;
- изучить культуральные, морфологические, биохимические и патогенные свойства выделенных от свиней микоплазм;
- разработать и испытать в производственных условиях экспресс-методы диагностики микоплазмоза свиней и его ассоциативных форм проявления, а также эффективные и рациональные схемы лечения, дать им экономическое обоснование.
Научная новизна. Выявлена широкая распространенность в хозяйствах Омской и Тюменской областей микоплазмоза свиней, в том числе в ассоциациях с некоторыми другими инфекциями. Изучены основные свойства микоплазм, выделенных от свиней. Усовершенствованы экспресс-методы диагностики микоплазмоза: микробиологический — с помощью специальных питательных сред для индикации и идентификации микоплазм и уреаплазм и серологические - для выявления микоплазм и их антигенов в биоматериале, а также антител в сыворотке крови с помощью РНИФ и РНГА.
Получены приоритетные справки № 2007135196 / 13 (038479) от 21.09.2007 на способ получения микоплазмозных диагностических сывороток для реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) путем гипериммунизации кроликов и № 2007135195 / 15 (038478) от 21.09.2007 на способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) при микоплазмозе свиней, а также уведомления о положительном результате формальной экспертизы от 07.11.2007 г.
Разработаны научно-обоснованные рациональные схемы лечения свиней при микоплазмозе с учетом его ассоциативных форм.
Теоретическая и практическая значимость работы. Материалы диссертации вносят определенный вклад в развитие науки мико-плазмологиии и микропаразитоценологии.
Разработанные методики дают возможность получать микоплаз-мозные антигены и антисыворотки для РНИФ и эритроцитарный диаг-ностикум для РНГА. Применение экспресс-методов диагностики, отраженных в методических рекомендациях «Экспресс-методы диагностики микоплазмоза свиней» позволит своевременно выявлять больных животных и микоплазмоносителей, и разрабатывать меры борьбы и профилактики, контролировать эпизоотическую обстановку по данной инфекции. Применение разработанных схем лечения при микоплазмозе свиней, в том числе и в ассоциации с другими инфекциями, создаст условия для более эффективного проведения мероприятий по борьбе с данной болезнью.
Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ, 2006 г. «Научные и практические проблемы ветеринарной медицины, животноводства и перспективы их решения» (Омск, 2006), Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины продуктивных и непродуктивных животных» (Омск, 2006, СО РАСХН ВНИИБТЖ), Международной научной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болез ней, общих для людей и животных» (Ульяновск УГСХА, 2006 г), Межрегиональной научно-практической конференции «Патология сельскохозяйственных животных и пути её профилактики» (Омск, 2007, СО РАСХН ВНИИБТЖ), 14-ой научной конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ, 2008 г. «Проблемы ветеринарной и зоотехнической наук и пути их решения» (Омск, 2008), 7-ой Межрегиональной научно-практической конференции «Диагностика, лечение и профилактика болезней животных в условиях Сибири и Урала» (Омск, 2008, СО РАСХН ВНИИБТЖ).
Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 7 научных статей, в том числе одна в научном журнале, рекомендованном ВАК Минобразования РФ («Ветеринарная патология»).
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 138 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 39 таблицами и 13 рисунками. Список литературы включает 218 источников, в том числе 90 зарубежных авторов.
Внедрение результатов исследований. Результаты исследований для практического применения отражены в методических рекомендациях: «Экспресс — методы диагностики микоплазмоза свиней» (Утверждены Ученым советом ИВМ ФГОУ ВПО ОмГАУ, протокол № 9 от 28.05.2008 г., секцией животноводства Центра научного обеспечения АПК Министерства сельского хозяйства и продовольствия Омской области, протокол № 4 от 05.06.2008 г. и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, протокол № 2 от 30 июня 2008 г.).
Материалы диссертации внедряются в хозяйствах Омской и Тюменской областей и используются в учебном процессе кафедр эпизоотологии и инфекционных болезней; микробиологии, вирусологии и иммунологии института ветеринарной медицины ОмГАУ; институте повышения квалификации руководителей и специалистов АПК ОмГАУ, а также в курсе лекций Тюменского института переподготовки кадров агробизнеса.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Распространение микоплазмоза свиней и ассоциативных форм его проявления в хозяйствах Омской и Тюменской областей.
2. Усовершенствованные экспресс-методы диагностики микоплазмоза свиней.
3. Результаты экспериментального изучения различных схем лечения и методы лабораторного контроля их эффективности при ми-коплазмозе свиней и ассоциативных формах его проявления.
Методы лабораторной диагностики микоплазмозов
Расширение ареала распространения микоплазмозов среди животных, птиц и человека является основной предпосылкой для разработки более чувствительных и специфичных средств и методов диагностики этого заболевания. Быстрое и своевременное распознавание микоплазмозов является решающим моментом в проведении комплекса эпизоотологических, ветеринарно-санитарных и профилактических мероприятий, направленных на локализацию и предупреждение дальнейшего распространения болезни. Непосредственное выделение мико-плазм от больных животных при естественных и экспериментальных инфекциях удается осуществить с большим трудом и, в основном, в остром периоде болезни.
Однако, используемые для выделения микоплазм методы, обладая рядом определенных преимуществ (специфичность, воспроизводимость), не лишены и существенных недостатков (низкая чувствительность, трудоемкость и продолжительность исследования). Поэтому совершенствование средств и методов диагностики микоплазмозов остается актуальной проблемой.
Биоматериал для микоплазмологического исследования берут ех tempore. При необходимости транспортировки его помещают в термос со льдом, хранят в течение нескольких часов при температуре 4С, для более длительного хранения материал помещают в холодильник при минус 20С. Материал из носовой полости, гортани, трахеи, наружных половых органов берут ватным тампоном. Из внутренних органов и тканей делают гомогенизат в фосфатном буфере или в жидкой питательной среде. Чрезмерно измельчать ткани нежелательно, так как при этом освобождаются лизолейцин, лектин и другие энзимы, ингибирую-щие рост микоплазм (Kaklamanis et al., 1969; Rashid, Jordan, 1978).
Э.А. Шегидевич (1976) предложил схему исследования патологического материала на наличие микоплазм без применения ингибиторов - пенициллина и уксуснокислого таллия. Для очистки исследуемых объектов от бактериальных контаминантов целесообразно использовать физические методы - фильтрацию и центрифугирование, которые в прошлом с успехом применяли исследователи, изучавшие перипневмо-нию крупного рогатого скота, плевропневмонию коз, агалактию овец и коз и т.д. При выделении микоплазм необходимо проводить полный бактериологический анализ исследуемого объекта, используя для этого набор питательных сред различных прописей. Эта методику приняли за основу многие ученые, занимавшиеся изучением микоплазмоза сельскохозяйственных животных.
Для обнаружения микоплазм в мазках-отпечатках, а также в мазках, приготовленных из культур, их окрашивают по Романовскому — Гимзе. Возбудитель при световой микроскопии выглядит в виде кокков, бипо-ляров, перстневидных и сферических образований, а также может иметь звездчатую, нитевидную форму (А.Я. Пустовар и др., 1978; А.А. Ата-мась, 1986; Г.Ф. Коромыслов и др., 1987).
Для подавления бактериальной флоры при первичном посеве биоматериала П.М. Митрофанов (1982) рекомендует добавлять к питательным средам пенициллин в дозе 1000 ЕД/мл и ацетат таллия (в конечной концентрации 1:2000), а для исключения роста, L-форм бактерий проводить 3-5 последовательных пассажей выделенных культур с 5-дневными интервалами на сывороточных питательных средах без ингибиторов для восстановления исходных форм бактерий. R. Yamamoto et al. (1971) для подавления роста посторонней микрофлоры использовали канамицина сульфат (2 мкг/мл), а Н. Фриис (1971) с этой целью применял среду с добавлением бацитрацина и метициллина в концентрации 0,15 мг/мл. Позже Фриис (1975) предложил более простую и эффективную среду из модифицированного солевого раствора Хэнкса, PPLO-бульона и сердечно-мозгового настоя Дифко, дрожжевого экстракта, бацитрацина и сыворотки крови поросят.
В.А. Атамась (1986) для диагностики микоплазмоза свиней рекомендует применять выделение культуры возбудителя на специальных питательных средах, после чего проводить идентификацию в реакции ингибиции роста типоспецифическими антисыворотками в РА или РСК.
С.Н. Борхениус, О.А. Чернова, (1989) предлагают следующие методы для обнаружения и идентификации микоплазм: посев на специ 17 альные среды, электронная микроскопия, люминесцентная микроскопия в сочетании с окраской ДНК, обычная световая микроскопия с авторадиографией, введение Б-метилпуриндезоксирибозида (БМПДР) непосредственно в культуральную среду, иммунологические с использованием нефракционированных антисывороток, поли- и моноклональных антител, гибридизационные с использованием РНК - и ДНК - зондов.
С. Gil-Juarez, В.А. Calderon, J. Montero, A. Yanez, L. Cedillo (1996, Мексика) индикацию микоплазм осуществляли культуральным методом, а видовую идентификацию проводили с помощью полимеразной цепной реакции. Т. Schaeverbeke, Н. Renaudin (1997, Франция) также производили систематическое детектирование микоплазм с помощью культурального метода и ПЦР, при этом в каждой исследуемой пробе проводили также и титрацию возбудителя в патологическом материале.
Необходимость комплексной диагностики обусловлена недостаточной эффективностью отдельных методов исследования при первичном установлении этой болезни, трудностью выделения и культивирования возбудителя (Х.З. Гаффаров, 1970; К.А. Дорофеев, 1963; Э.А. Шегидевич с соавт., 1972; Treszczynsky, Piloszec, 1976).
Индикация и идентификация микоплазм на питательных средах
Для прижизненной диагностики микоплазмоза свиней на питательных средах брали для исследования цервико-вагинальные смывы и соскобы со слизистой оболочки влагалища у супоросных свиноматок, а также после опороса, суставную жидкость из пораженных суставов, носовые истечения у поросят различных возрастных групп; для посмертной диагностики - паренхиматозные органы (печень, почки, селезенку, легкие, сердце, лимфатические узлы), а также абортированные плоды.
Для культивирования посевов использовали стандартные (МПА, МПБ), а также специальные диагностические жидкие и плотные питательные среды для индикации и идентификации глюкозоферменти-рующих, аргининзависимых микоплазм и уреаплазм, разработанные ИВМ ОмГАУ совместно с Омским НИИ природно-очаговых инфекций Роспотребнадзора.
Посевы на средах инкубировали при температуре 37С в течение 48-96 часов, учет роста проводили визуально по изменению цвета среды (рис.4).
В процессе своей жизнедеятельности микоплазмы ферментируют глюкозу, аргинин или гидролизуют мочевину, содержащуюся в среде. В результате этого сдвигается рН среды, а входящий индикатор меняет ее цвет. Данные питательные среды также содержат в своем составе ингибиторы, которые препятствуют росту сопутствующей микрофлоры.
Для более подробного изучения культуральных свойств микоплазм, культуры, выросшие на жидких питательных средах, пересевали на аналогичные плотные среды, содержащие 1,3% агара Дифко. Для этого 3 капли инокулята (бульонной культуры) микоплазм по 20 мкл в капле наносили на поверхность агара, не делая штрихового посева, и подсушивали при комнатной температуре. Посевы инкубировали в термостате при температуре 37-38С в течение 5 суток. Чашки просматривали под малым увеличением микроскопа (х 45-70) через 24-72 часа и на 5-е сутки инкубации.
Изготовление микоплазмозного эритроцитарного диагностикума (МЭД) для реакции непрямой гемагглютинации (РИГА)
Приготовление микоплазмозного эритроцитарного диагностикума (МЭД) проходит в несколько этапов:
- дробная формалинизация эритроцитов барана;
- получение антигена из трех культур микоплазм;
- сенсибилизация формалинизированных эритроцитов антигеном;
- трехкратное отмывание диагностикума буферным раствором. На первом этапе взяли кровь у барана-донора, дефибринировали и
развели 1:1 буферным физиологическим раствором рН - 7,2 (0,137 М NaCl и 0,001 М двузамещенный фосфорно-кислый калий на 1л дистиллированной воды).
Для фиксации эритроцитов к 100 мл 50% взвеси эритроцитов барана добавляли 20% - й раствор формальдегида порциями в возрастающих объемах, через каждые 15 минут: 6, 7, 8, 9 и 10 мл. Смесь постоянно перемешивали на водяной бане при температуре 70С до получения темно-коричневого цвета. После окончания формалинизации взвесь эритроцитов 4-кратно отмывали фосфатно-буферным раствором рН - 7,2 путем центрифугирования при 3000 об/минут в течение 2-5 минут и ресуспендировали в 400 мл того же буфера. Из осадка приготовили 10% рабочую взвесь на буферном физиологическом растворе с содержанием 0,3 % 20% - го раствора формальдегида. При данном способе фиксации эритроциты сохраняют свои сорбционные свойства в течение 5 лет.
Второй этап приготовления эритроцитарного диагностикума - получение антигена (сенситина), который должен обладать способностью адсорбироваться на эритроцитах. В качестве сенситинов использовали корпускулярные антигены микоплазм, выделенных от свиней (М. hyo-synoviae, М. hyorhinis и Ureaplasma sp.). Микоплазмы культивировали на трех жидких питательных средах: среда для индикации глюкозофер-ментирующих микоплазм, аргининзависимых микоплазм и уреаплазм.
Культуры микоплазм отмывали от питательных сред путем центрифугирования при 6000 об/минут в течение одного часа. Осадки трех культур после трехкратного ресуспензирования и последующего центрифугирования смешали в равных количествах и развели 1:10 физиологическим раствором. Полученную смесь антигенов прогревали на водяной бане при 70С в течение 30 минут и использовали для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов.
На третьем этапе 3%-ую взвесь формалинизированных эритроцитов (предварительно трехкратно отмытых ФБР рН 7,2 от формальдегида при 3000 об/мин) сенсибилизировали в соотношении 2:1 (2V антигена: IV эритроцитов). Сенсибилизацию проводили на водяной бане при температуре 70С в течение 30 минут, перемешивая взвесь, каждые 5 минут. За 10 минут до конца сенсибилизации для закрепления сенсити-на на эритроцитах добавляли 1% формальдегида.
Четвертый этап приготовления МЭД предусматривает трехкратное отмывание нагруженных антигеном эритроцитов от несвязавшихся сенситинов фосфатно-буферным солевым раствором с рН-7,2 путем центрифугирования при 3000 об/минут, и ресуспендирование в этом же растворе, доводя до первоначальной 3% концентрации. После этого использовали МЭД для постановки РИГА макрометодом в объеме 0,5 мл на полистироловьгх планшетах.
Постановку РНГА проводили по следующей методике: испытуемые сыворотки, после освобождения от неспецифических гемагглюти-нинов путем инактивации в течение 20 минут при 56С, разводили в двукратной последовательности фосфатно-буферным раствором (рН-6,4), начиная с 1:25. К каждому разведению добавляли по одной капле (0,05 мл) эритроцитарного диагностикума, тщательно перемешивали встряхиванием и оставляли при комнатной температуре на 1,5-2 часа.
