Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 8
1.1. Значение идентификации продукции 8
1.2. Методы определения видовой принадлежности мяса 10
Собственные исследования 22
2.1. Материалы и методы исследования 22
2.1.1. Материалы исследований 22
2.1.2. Методика идентификации мяса на основе иммунодиффузии 23
2.1.3. Выделение ДНК из нетермообработанных образцов баранины и козлятины с помощью тест-системы SureFood PREP Animal 25
2.1.4. Выделение ДНК из баранины и козлятины, подвергнутых термической обработке, с помощью тест-набора SureFood" PREP Animal X 26
2.1.5. Методика идентификации козлятины и баранины на основе ГЩР с последующей ДНК-гибридизацией 28
2.1.6. Модифицированная методика идентификации баранины и козлятины на основе амплификации с последующей гибридизацией 32
2.1.7. Методика идентификации баранины и козлятины с помощью ПЦР в режиме «реального времени» 33
2.2. Результаты исследований 34
2.2.1. Усовершенствование идентификации мяса мелкого рогатого скота на основе иммунодиффузии 34
2.2.2. Усовершенствование методов идентификации баранины и козлятины на основе ДНК диагностики 37
2.2.2.1. Усовершенствование методов идентификации баранины и козлятины на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией с использованием стандартизованных по международным требованиям тест-систем SureFood (Германия) 37
2.2.2.2. Разработка модифицированной методики идентификации баранины и козлятины на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией 40
2.2.2.3. Усовершенствование методов идентификации баранины и козлятины на основе ПНР в режиме «реального времени» 46
2.2.3. Сравнительный анализ методов идентификации баранины и козлятины при различных условиях температурной обработки 50
2.2.3.1. Влияние условий хранения баранины и козлятины на эффективность методов видовой идентификации на основе ДНК-диагностики и иммунодиффузии 50
2.2.3.2. Влияние термической обработки мяса на эффективность методов идентификации баранины и козлятины 62
3. Обсуждение результатов исследований 67
Выводы 82
Предложения для практики 83
Список литературы
- Методы определения видовой принадлежности мяса
- Методика идентификации мяса на основе иммунодиффузии
- Выделение ДНК из баранины и козлятины, подвергнутых термической обработке, с помощью тест-набора SureFood" PREP Animal X
- Усовершенствование методов идентификации баранины и козлятины на основе ДНК диагностики
Введение к работе
Актуальность темы.
Повышение защиты рынка от опасной и контрафактной продукции является одним из главных направлений реформы технического регулирования.
В этой связи разработка эффективных методов и тест-систем идентификации мяса способствует исключению из торговли недоброкачественной и фальсифицированной продукции, представляющей серьезную угрозу для здоровья населения.
Идентификация баранины и козлятины в сырье и продуктах питания, а также определение фальсифицирующих примесей, таких, например; как мышцы собаки, является одним из указанных направлений.
При идентификации используются различные методические подходы, основанные на органолептических, биохимических и гистологических показателях, электрофоретическом анализе белков (Хвыля СИ. и др., 1994; Писарева В.М., 1996; Кузнецова Т.Г., 1997; Kim Н. et al., 1986; Man I.M., 1990; Rehben H., 1990; Helle A. et al., 1996; Taylor H. et al. 2000).
Экспрессны и достаточно специфичны тест-системы на основе иммунологического анализа (Серегин И.Г. и др., 1997; Mecedo-Silva ., Bardos S.F., 2000).
Методы ДНК-диагностики показали себя весьма чувствительными и специфичными способами идентификации мяса, позволяющими проводить анализ термообработанных образцов (Комаров А.А., Обухов И.Л., 2000; Комаров А.А., 2001, Комарова И.Н.,2005; Chikuni К. et al, 1990; Hunt D.J., 1997; Kappes S.M. et al, 1997; Jamamato M. et al., 1998; Tortaglia M. et al., 1998; Buntjer J.B., LamineA., 1999; Lockhart D.J., Winzeler E.A., 2000.).
Однако актуальными остаются задачи оптимизации методов и тест-систем применительно к конкретным видам мяса, а также к различным образцам сырья и продукции. При этом задачи технического регулирования
4 предусматривают как внедрение уже известных стандартизованных по международным требованиям тест-систем идентификации, так и разработку новых методов и тест-систем, отвечающих международным стандартам.
Весьма важным является изучение влияния биологических и физико-химических факторов, возникающих при хранении и термической обработке мяса, на эффективность тех или иных методов и тест-систем идентификации.
Цель и задачи исследований.
Целью исследований являлось совершенствование определения видовой принадлежности баранины и козлятины на основе иммуно - и ДНК-диагностики.
В задачи исследований входило:
усовершенствовать идентификацию мяса мелкого рогатого скота на основе иммунодиагностики;
усовершенствовать методы идентификации баранины и козлятины на основе амплификации и ДНК - гибридизации, а также ПНР в режиме «реального времени»;
провести сравнительные исследования по определению специфичности и чувствительности методов и тест-систем на основе иммуно- и ДНК-диагностики для определения видовой принадлежности мяса в сырье и мясопродуктах;
провести сравнительный анализ влияния условий хранения и термической обработки баранины и козлятины на эффективность методов идентификации;
разработать методические рекомендации по определению видовой принадлежности мяса и мясопродуктов.
Научная новизна
Проведено совершенствование метода идентификации баранины и козлятины с использованием стандартизованных по международным требованиям тест-систем SOFT (США) на основе иммунодиффузии с пропитанными моноклональными антителами фильтрами. Методика
5 .. позволяет дифференцировать не термообработанную баранину от козлятины.
Определена чувствительность методики, которая составляла 5% в смеси с
другими видами животных, при этом время анализа сократилось в 1,5 раза.
Разработана модифицированная методика идентификации баранины и козлятины, включающая выделение ДНК с использованием протеолитичесих ферментов, иммуносепарацию, амплификацию ДНК с биотинилированными праймерами, гибридизацию меченных ампликонов с иммобилизованными ДНК-зондами и фотоколориметрическое детектирование гибридных молекул по интенсивности окрашивания после реакции с конъюгатом и субстратом.
Показана высокая чувствительность и специфичность метода на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией, позволяющего проводить идентификацию до 0,5% баранины или козлятины в сырье и продуктах питания, в том числе термообработанных.
Проведена валидация методов пробоподготовки с сорбентом «силико» и постановки ПНР в режиме «реального времени» (ПНР - РВ) с компонентами тест-систем SureFood для идентификации баранины и козлятины. Данная методика позволяет дифференцировать мышцы баранины, козлятины и собачатины и сократить время анализа в 3 раза.
Проведен сравнительный анализ влияния способов технологической обработки баранины и козлятины на эффективность методов идентификации и показано, что наиболее эффективными для идентификации как термообработанных, так и не термообработанных продуктов являются методы ДНК - диагностики.
Практическая ценность.
На основе проведённых исследований разработаны "Методические рекомендации по идентификации козлятины и баранины на основе иммунодиффузии", утверждённые Отделением ветеринарной медицины РАСХН 07.04.2008г.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:
- VI Международной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2007г.);
-заседании Ученого совета ВНИИВСГЭ (2008г.);
-межлабораторном совещании ВНИИВСГЭ (2008 г.).
Публикации Результаты исследований отражены в 4 научных статьях.
Структура и объем работы.
Диссертация состоит из введения, литературного обзора, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложений.
Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц и 10 рисунков. Список литературы включает 193 источника отечественных и зарубежных авторов.
Методы определения видовой принадлежности мяса
Для определения видовой принадлежности мяса применяют различные методы, основанные на органолептических, морфологических, биохимических, иммунологических критерия, а также анализе нуклеиновых кислот (27, 40, 46, 49, 53, 98, 120, 123, 124, 189-191, 193).
Морфологические критерии используются только в тех случаях, когда мясо представлено в виде туш, полутуш, четвертин и отрубов (30).
В этом случае для идентификации может служить анатомическое различие костей и внутренних органов, цвет и структура мышечной, жировой тканей и лимфатических узлов (1,5, 10, 27, 46, 55).
Морфологический метод идентификации мяса может быть применён только в тех случаях, когда имеются в наличии туши, полутуши, четвертины и отруба с сохранением характерных особенностей того или иного вида животного (30).
Для идентификации используют такие показатели, как морфологическое различие костей и внутренних органов, мышечной, жировой тканей и лимфатических узлов (1, 5,10, 46,27, 55).
Видовую принадлежность устанавливают по таким костям, как атлант, эпистрофей, грудные позвонки, крестцовая, бедренная, локтевая и лучевая кости, ребра, кости лонного сращения и кости запястья (1,9, 14, 27, 30, 49). Если отсутствуют целые кости, идентификацию проводят по распилам костей (5).
Такие внутренние органы, как язык, печень, селезенка, легкие и почки могут служить критериями при определении видовой принадлежности 1, 44).
Визуально или с использованием приборов, например люминоскопа, фотоколориметра, проводят идентификацию мяса по цвету мышечной ткани (15). Однако если мясо подвергалось многократному замораживанию и оттаиванию, то это затрудняет дифференциацию мяса по цвету мышечной ткани (27).
Окраска, запах жира, размеры лимфатических узлов также могут являться критериями при определении видовой принадлежности мяса (30). Следует учитывать, что эти критерии малодостоверны, так как могут быть разными в зависимости от пола, возраста и физиологического состояния животного (27).
Весьма достоверными при идентификации мяса показали себя гистологические методы с применением микроскопического анализа (2, 4, 38, 89, 101, 105).
Эти методы позволяют проводить не только идентификацию мяса, но и осуществлять контроль качества мясной продукции и определять фальсифицирующие примеси (38, 39, 75, 101).
Однако эти методы являются достаточно трудоёмкими и имеют существенные ограничения при идентификации мяса близкородственных видов животных, а также термообработанных мясных продуктов.
При определении видовой принадлежности мяса используются, хотя и весьма редко, физико-химические характеристики жира, как, например, температура плавления, йодное число и другие показатели. Эти характеристики зависят от соотношения в жире предельных и непредельных жирных кислот, содержания в жире триглицеридов (5, 24, 30,47, 157). Однако указанные показатели могут меняться от физиологического состояния животных, состава кормов и других факторов. Кроме того, эти критерии малопригодны для определения фальсификации различных жиров, так как замена одного жира на другой приводит к изменению физико-химических показателей.
Если используются нецелые туши или четвертины, а отдельные куски, то морфологические критерии становятся непригодными для идентификации мяса. Известно применение метода газовой хроматографии для идентификации мяса при определении углеводородов, циклобутанов и других химических соединений. Показано использование масс спектрометрический анализа для дифференциации сырого и термообработанного мяса. Однако эти методы являются весьма трудоемкими и не позволяют с полной достоверностью выявлять видовые различия (134, 165,181).
Из литературных источников известны данные по идентификации мяса на основании оптической плотности и спектра поглощения общего белка. Так, например, показана возможность дифференциации мышц свиньи, барана и собаки (54). Поскольку эти критерии также зависят от пола, кормления и физиологического состояния животных, приведенные показатели не являются специфичными при определении видовой принадлежности.
Показано применение метода электронного парамагнитного резонанса для выявления дифференцирующих показателей идентификации (172). Этот метод не нашел широкого применения в практике, так как требует дорогостоящих сложных приборов.
Для определения видовой принадлежности мяса и выявления фальсифицирующих примесей используются электрофоретические методы (изоэлектрофокусирование, диск-электрофорез). Показана возможность применения этих методов для идентификации мяса и рыбы (98, 136, 145, 155, 174-175,142, 146).
Электрофоретические методы применяют также для определения примесей коровьего молока в овечьем, козьем молоке, а также в сырах.
Эти методы могут быть автоматизированы с помощью зарубежных и отечественных приборов. Идентификация близкородственных видов с помощью указанных методов осуществляется путем анализа особых маркерных белков.
Термообработанные мясные или рыбные продукты дифференцируют с помощью SDS- электрофореза.
Для идентификации мяса, рыбы и других продуктов используются методы.определения изоферментного состава, однако этот подход мало пригоден для практических целей (115).
Весьма специфичными для идентификации мяса и мясных продуктов являются иммунологические методы. Эти методы просты в исполнении и не требуют больших временных затрат (87).
Использование моноклональных антител значительно повышает специфичность анализа. С помощью моноклональных антител показана возможность проведения идентификации термообработанного мяса крупного рогатого скота, свиньи, овцы, лошади и оленя (120).
Метод иммунодиффузии на агаре с использованием бумажных дисков с иммобилизованными на них антисыворотками, антигенами и эталонными образцами антигенов позволяет проводить идентификацию- свинины, говядины, мяса птицы (54).
Разработан метод качественного определения белков различных видов мяса с применением реакции преципитации в жидкой фазе (113).
Весьма перспективным для- идентификации представляется иммуноферментный анализ (ИФА) и особенно его твердофазная модификация (ELISA) (54). Чувствительность тест-систем на основе ИФА позволяет выявлять до 0,1% определяемого вида мяса в смешанных фаршевых системах (19, 142).
Определение видовой принадлежности мяса с помощью различных иммунологических методов показано в работах отечественных и зарубежных авторов (6, 102,132, 177,178).
К недостаткам иммунологических методов можно отнести снижение специфичности вследствие термообработки белков и изменению антигенной структуры (54,118). Ренатурацию белков можно провести с помощью диализа или химическим способом (117, 118, 143, 144). Однако указанные обработки не приводят к полному восстановлению специфичности идентификации.
Получены видоспецифичные антигены из ткани надпочечников коровы, овцы, свиньи, лошади и человека, способные сохранять специфичность после термообработки при 120С в течение 30 мин. Результаты исследований показали возможность использования сывороток к термостабильному антигену для видовой идентификации тканей различных животных (147).
Различные факторы (вид используемых твердофазных систем, методы экстракции белков и другие) также влияют на специфичность идентификации (70, 79, 87, 95, 130, 142, 179).
Разрабатываемые препараты для постановки иммуноферментных тестов не всегда соответствуют декларируемым характеристикам (141). Вследствие этого можно заключить, что все тест-системы иммунодиагностики необходимо подвергать стандартизации и подтверждению соответствия.
Наибольшей специфичностью и чувствительностью обладают методы диагностики нуклеиновых кислот (ДНК-гибридизация, амплификация, секвинирование) (103, 104,138,167).
Методика идентификации мяса на основе иммунодиффузии
Для выделения ДНК образцы гомогенизировали и переносили в пробирку типа Эппендорф объемом 1,5 мл.
Очистку ДНК проводили с помощью протеиназы К путем добавления к исходному раствору 2 мл воды для ПЦР и тщательно перемешивали. Можно было готовить протеиназу К заранее и хранить при - 20С.
В пробирку добавляли 400 мл лизирующего буфера и 40 мкл протеиназы, содержимое пробирки перемешивали на вортексе.
Пробирку помещали в термомиксер и инкубировали при 52С в течение 30 мин при непрерывном встряхивании.
Пробирку центрифугировали в течение 2 мин при 12000 об/мин для отделения нелизированных компонентов. Надосадочную жидкость переносили в чистую пробирку Эппендорфа на 1,5 мл.
В пробирку добавляли 200 мкл связывающего буфера и перемешивали. Содержимое пробирки переносили на фильтр, который предварительно помещали в центрифужную пробирку на 2 мл. Инкубировали при комнатной температуре в течение 1 мин. Центрифугировали при 12000 об/мин в течение 2 мин. Фильтрат удаляли, а фильтр помещали обратно в центрифужную пробирку.
На центрифужный фильтр добавляли 550 мкл буфера для промывки и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 1 мин для промывки ДНК. Фильтрат удаляли, а фильтр помещали обратно в центрифужную пробирку и повторяли промывку еще раз.
После повторной промывки фильтр помещали обратно в пробирку и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 2 мин, для того чтобы удалить остатки буфера для промывки с фильтра.
Для последующего элюирования ДНК готовили горячий элюирующий буфер путем нагревания в термомиксере при 52С. Для каждой исследуемой пробы необходимо было готовить 105 мкл буфера (с учетом испарения).
В чистую прозрачную центрифужную пробирку на 1,5 мл помещали сухой фильтр с исследуемым материалом и наносили на фильтр 100 мкл горячего элюирующего буфера. Инкубировали при комнатной температуре в течение 3 мин. Центрифугировали при 10000 об/мин в течение 2 мин. Отбрасывали центрифужный фильтр. При небольшом содержании ДНК в исследуемой пробе объем элюирующего буфера уменьшали. Минимальный объем элюирующего буфера - 50 мкл. Выделенная и очищенная ДНК была готова для постановки амплификации.
Выделение ДНК из баранины и козлятины, подвергнутых термической обработке, с помощью тест-набора SureFood PREP Animal X.
Для выделения ДНК образцы гомогенизировали и переносили в пробирку типа Эппендорф объемом 1,5 мл. Очистку ДНК проводили с помощью протеиназы К путем добавления к исходному раствору 2 мл воды для ПЦР и тщательно перемешивали. Можно было готовить протеиназу К заранее и хранить при - 20С.
В пробирку добавляли 400 мл лизирующего буфера и 40 мкл протеиназы, содержимое пробирки перемешивали на вортексе. Пробирку помещали в термомиксер и инкубировали при 52С в течение 30 мин при непрерывном встряхивании. Пробирку центрифугировали в течение 2 мин при 12000 об/мин для отделения нелизированных компонентов. Надосадочную жидкость переносили в чистую пробирку Эппендорфа на 1,5 мл. Пробирку помещали в термомиксер и инкубировали при 65С в течение 30 мин при непрерывном встряхивании. Если содержимое пробирки было мутное, пробирку центрифугировали в течение 2 мин при 12000 об/мин для отделения нелизированных компонентов. Надосадочную жидкость переносили в чистую пробирку Эппендорфа на 1,5 мл. В пробирку добавляли 200 мкл связывающего буфера и хорошо перемешивали на вортексе.
Содержимое пробирки переносили на фильтр, который предварительно помещали в центрифужную пробирку на 2 мл. Инкубировали при комнатной температуре в течение 1 мин. Центрифугировали при 12000 об/мин в течение 2 мин. Фильтрат удаляли, а фильтр помещали обратно в центрифужную пробирку.
Готовили буфер для промывки, для этого к исходному раствору добавляли 30 мл 99,8% этанола, закрывали крышку и тщательно перемешивали раствор. Готовый раствор хранили с плотно закрытой крышкой.
Готовили буфер для промывки, для этого к исходному раствору добавляли 42 мл 99,8% этанола, закрывали крышку и тщательно перемешивали раствор. Готовый раствор хранили с плотно закрытой крышкой. На центрифужный фильтр добавляли 550 мкл буфера для промывки и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 1 мин для промывки ДНК. Фильтрат удаляли, а фильтр помещали обратно в центрифужную пробирку.
Пробирку центрифугировали при 12000 об/мин в течение 2 мин для того, чтобы удалить остатки буфера для промывки с фильтра.
Для последующего элюирования ДНК готовили горячий элюирующий буфер путем нагревания в термомиксере при 52С. Для каждой исследуемой пробы необходимо было готовить 105 мкл буфера ( с учетом испарения).
В чистую прозрачную центрифужную пробирку на 1,5 мл помещали сухой фильтр с исследуемым материалом и вносили на фильтр 100 мкл горячего элюирующего буфера. Инкубировали при комнатной температуре в течение 2 мин. Центрифугировали при 10000 об/мин в течение 2 мин. Отбрасывали центрифужный фильтр.
Выделение ДНК из баранины и козлятины, подвергнутых термической обработке, с помощью тест-набора SureFood" PREP Animal X
Обсуждая результаты изучения научной и технической литературы, можно отметить, что концепция технического регулирования коренным образом изменила подход к обеспечению безопасности и качества продуктов питания. Повышение эффективности защиты рынка от опасной продукции стало одной из основных целей проходящей в настоящее время реформы технического регулирования.
Важным элементом подтверждения соответствия продукции, согласно Федеральному закону «О техническом регулировании», является ее идентификация, которая призвана не допустить попадания потребителю недоброкачественной или фальсифицированной продукции, что имеет большое санитарно-гигиеническое значение. Закон предполагает «установление обязательных требований только в отношении защиты жизни и здоровья людей, животных и растений, защиты имущества, охраны окружающей среды и предупреждение действий, вводящих в заблуждение потребителей».
В соответствии с Федеральным законом «О техническом регулировании», безопасность - это состояние, при котором отсутствует недопустимый риск, связанный с причинением вреда жизни или здоровью граждан, имуществу физических или юридических лиц, государственному или муниципальному имуществу, окружающей среде, жизни или здоровью животных и растений». Это определение соответствует общепринятой международной терминологии (ИСО/МЭК 2, п. 2.5).
Установление и регулирование обязательных требований к продукции и процессам производства является одним из инструментов государственного регулирования экономики. Система применения обязательных технических требований является предметом регулирования международного права, в том числе в многосторонних торговых соглашениях в рамках Всемирной торговой организации (ВТО). Соблюдение принципов в области технического регулирования является одним из основных условий вступления России в ВТО. Россия подписала основные международные документы, отражающие принципы технического регулирования -«Соглашение по техническим барьерам в торговле», «Соглашение по применению санитарных и фитосанитарных мер».
Проверки, проводимые Центрами стандартизации и метрологии, выявили по некоторым видам продукции, значительный процент некачественных и фальсифицированных товаров.
Это приводит к нарушению интересов потребителей, гарантированных законодательством страны, и, в конечном итоге, к разочарованию в возможностях государства защитить их права, пассивности потребителей как граждан, и- членов общества и другим негативным политическим и экономическим последствиям.
Учитывая социальную и политическую значимость проблемы обеспечения безопасности продукции для населения, государство должно формировать правила в этом вопросе, формируя минимально необходимые для обеспечения безопасности требования к продукции. При этом, государство способно объективно представлять интересы.общества в целом и защищать отдельных его представителей в условиях рынка. Это положение нашло отражение в статье 74 Конституции страны, Гражданском Кодексе Российской Федерации, Федеральном законе "О техническом регулировании", в котором требования безопасности рассматриваются как обязательные и устанавливаются в технических регламентах - документах законодательного статуса.
Федеральный закон «О техническом регулировании» создал основу для проведения государственной реформы технического регулирования, которая затрагивает все механизмы формирования системы обязательных требований; оценки соответствия, процедур контроля и надзора, аккредитации и сертификации. Закон определяет осуществление работ по созданию и совершенствованию научно-обоснованных и соответствующих международным требованиям технических регламентов, стандартов, процедур подтверждения соответствия, методов и тест-систем, обеспечивающих безопасность и качество продукции, в том числе продовольственного сырья и продуктов животного происхождения.
Одним из важных условий получения высококачественной животноводческой продукции является создание эффективной системы ветеринарно-санитарного контроля за качеством и безопасностью сырья животного происхождения, что обеспечивает защиту здоровья людей, сельскохозяйственных животных, охрану окружающей среды (3, 10, 42, 50, 51,64,70,71).
Идентификация продукции является первым этапом подтверждения ее соответствия заявленным документа, в результате которой устанавливается тождественность характеристик продукции ее основным признакам.
Мясо является высокоценным продуктом питания животного происхождения, содержащим биологически полноценные легкоусвояемые белки, а также другие пищевые компоненты, необходимые организму человека (25, 69, 82, 184, 185). Оно наиболее часто подвергается фальсификации (подмена одного вида мяса другим, введение в состав мясопродуктов различных растительных белков и т.д.), вследствие чего разработка методов идентификации мяса и мясопродуктов является важной задачей при их ветеринарно-санитарной экспертизе.
Известны случаи подмены баранины и свинины мясом собак и некоторыми видами диких животных, крольчатину (зайчатину) фальсифицируют мясом кошек, говядину подменяют кониной и т.д. (25, 30). В мясопродуктах производят замену дорогостоящего мясного сырья от жвачных животных или свинины на мясо птицы, имеющее более низкую стоимость (53, 155, 158, 183). Замена одних животных белков на другие может вызвать аллергическую реакцию, вплоть до анафилаксии (142, 175). Кроме того, фальсификация видовой принадлежности мясного сырья и мясных продуктов имеет национальный и религиозный аспекты (136, 145, 150).
Учитывая вышесказанное, разработка и внедрение доступных и эффективных методов идентификации и обнаружения фальсификаций мяса и мясных продуктов и, в частности, определение видовой принадлежности баранины и козлятины имеет большое значение для обеспечения требований качества и безопасности данной продукции.
Дифференциальными признаками при идентификации мяса и мясопродуктов могут служить органолептические (внешний вид, цвет, запах), анатомо-морфологические (анатомическое различие костей, мышц), биохимические и физико-химические показатели мяса и жира (температура плавления жира, йодное число, качественное и количественное определение гликогена и др.), реакция преципитации, а также генетические особенности тканей, свойственные данному виду животных (10, 14, 17, 40, 46, 49, 53, 98, 120, 123, 124, 189-191, 193).
Органолептические и анатомо-морфологические признаки являются самыми простыми и при определенных условиях могут служить надежными критериями видовой принадлежности мяса (10, 14, 46). В то же время при технологической переработке сырья оно может, терять характерные органолептические и морфологические признаки, зависящие также от пола и возраста животного, его упитанности и других причин (5,27,49).
Анатомо-морфологические признаки используются в том случае, когда исследуются части туши и тканей, не подвергнутых технологической переработке, в том числе при наличии костей, имеющих характерные отличия у различных видов животных (1-го шейного позвонка, эпистрофея, грудных позвонков, ребер, поясничных позвонков, плечевой кости и др.).
Усовершенствование методов идентификации баранины и козлятины на основе ДНК диагностики
ПЦР-амплификацию ДНК проводили с помощью биотинилированных праймеров и полученные ампликоны гибридизовали со специфическими меченными ДНК-зондами. Детектирование гибридных молекул осуществляли по иммуноферментному типу после реакции с субстратом и красителем визуально или с помощью фотометра.
В результате проведенных исследований установлена высокая чувствительность и специфичность данного метода, который позволял идентифицировать до 0,5% баранины и козлятины в фаршевой смеси. При этом перекрестных реакций между ДНК, выделенной из козлятины и баранины, и ДНК мышц собаки не наблюдалось.
Хотя тест-набор серии SureFood позволял с высокой чувствительностью и специфичностью проводить идентификацию баранины и козлятины, однако пробоподготовка при этом включала много этапов с использованием дорогостоящих препаратов протеиназы К и хроматографических колонок для очистки ДНК.
С целью оптимизации способа идентификации баранины и козлятины нами разработана модифицированная методика на основе ДНК-гибридизации.
Мясо гомогенизировали с 10 мл нагретого до 65С СТАВ-буфера. Гомогенат инкубировали при температуре 65С 30 мин. Остатки разрушенных тканей осаждали центрифугированием в течение 2 мин при 500g. К супернатанту добавляли равный объем хлороформа и встряхивали в течение 10 мин. Центрифугировали 5 мин при 500g. Отбирали верхнюю водную фазу и еще раз повторяли обработку хлороформом. К полученному объему раствора ДНК добавляли двойной объем охлажденного до 0С этанола и осаждали ДНК центрифугированием при 5 000 g в течение 10 мин, осадок ДНК подсушивали и растворяли в дистиллированной воде.
При анализе термообработанных продуктов проводили экстракцию ДНК с помощью СТАВ-буфера, однократную депротеинизацию изопропанолом и дальнейшую очистку ДНК проводили с компонентами набора SureFood. Выделенные ДНК амплифицировали с неспецифическими гексануклеотидными меченными биотином праймерами, полученные ампликоны гибридизовали со специфичными ДНК-зондами из тест-набора SureFood и детектирование гибридных молекул проводили после реакции с коньюгатом и субстратом фотоколориметрированием.
Как показали наши исследования, выход ДНК по модифицированной методике был на уровне с препаратами ДНК, полученными при использовании тест-набора SureFood. При этом соотношения оптических плотностей Е 260/280 и Е 260/230 свидетельствовали о достаточной очистке ДНК.
Были получены результаты, показавшие высокую специфичность идентификации баранины и козлятины по модифицированной методике и корреляцию результатов с результатами при использовании тест-набора SureFood. Разработанная модифицированная методика позволяет оптимизировать пробоподготовку при идентификации, сократив при этом в 1,5 раза количество этапов пробоподготовки и исключив использование дорогостоящих препаратов К протеиназы, а для сырых продуктов и хроматографических колонок.
Неспецифическая амплификация с гексануклеотидными праймерами и последующая гибридизация со специфическими ДНК-зондами позволяют проводить одновременно идентификацию баранины и козлятины из одной пробы. При этом перекрестных реакций не наблюдалось.
Идентификацию баранины и козлятины с помощью ПЦР « в режиме реального времени» проводили после выделения ДНК магнитосорбцией в мультиплексной системе с реагентами SureFood. Как показали наши исследования, положительный результат дифференциации баранины от козлятины, а также от мышц собаки наблюдался как в отношение сырой продукции, так и термообработанной. Применение иммуномагнитосорбции для выделения ДНК значительно повышает скорость анализа, при этом время реакции на порядок ниже, чем при использовании метода иммунодиффузии, и в 2-3 раза меньше чем при использовании амплификации с последующей гибридизацией.
В задачи наших исследований также входило изучение влияния различных факторов внешней среды (длительное хранение, низко- и высокотемпературная обработка) на чувствительность и специфичность методов определения видовой принадлежности баранины и козлятины на основе иммуно- и ДНК-диагностики.
Как известно, различные условия хранения и обработки мясного сырья могут существенно влиять на его физико-химические свойства, и, соответственно, на чувствительность и специфичность методов определения видовой принадлежности мяса. Так, при замораживании образующиеся кристаллы льда вызывают структурные изменения белковых молекул и нуклеиновых кислот (20). При последующей дефростации мяса происходит нарушение целостности мышечных волокон, потеря мясного сока и части водорастворимых белков, высвобождение внутриклеточных энзимов, что может существенно влиять на физико-химическое состояние продукта (44) и, как следствие, на эффективность методов идентификации.
Как показали наши исследования, чувствительность методов определения видовой принадлежности баранины и козлятины с помощью иммунодиффузии составляла 5% в фаршевой смеси и оставалась таковой до двукратного замораживания и размораживания. Однако с увеличением количества данных процедур до четырех чувствительность иммунологического метода снижалась в два раза, а затем, пропорционально числу замораживания и дефростации, достигала в конце эксперимента 45-50% обнаружения вида мяса в фаршевой смеси, причем сходная картина наблюдалась как в отношение баранины, так и козлятины.
