Содержание к диссертации
Введение
Литературный обзор 8
1.1 Характеристика стафилококков 7
1.2 Staphylococcus aureus и другие возбудители мастита коров 12
1.3 Санитарное значение золотистого стафилококка в молоке и молочных продуктах 17
1.4 Методы индикации Staphylococcus aureus
1.4.1 Микробиологические методы 21
1.4.2 Методы ДНК - диагностики 26
2 Собственные исследования 35
2.1 Материалы и методы 35
2.1.1 Методы идентификации Staphylococcus aureus 35
2.1.2 Методы определения Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах 36
2.1.3 Метод дифференциального получения и индикации вегетативных и L - форм Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах 39
2.1.4 Методика выделения ДНК из Staphylococcus aureus 40
2.1.5 Включение метки в ДНК методом ник-трансляции 41
2.1.6 Получение и мечение ДНК-зондов в реакции амплификации 44
2.1.7 Методика ДНК-гибридизации на мембранных фильтрах с ДНК, меченной тритием 45
2.1.8 Методика ДНК-гибридизации на мембранных фильтрах с ДНК, меченной биотином 46
2.1.9 Методика гибридизации колоний 47
2.1.10 Методика полимеразной цепной реакции 48
2.1.11 Амплификация ДНК методом "рассеянной" затравки 49
2.1.12 Статистическая обработка результатов 50 з
2.2 Результаты исследований 51
2.2.1 Разработка методики ускоренной индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах на основе полимеразной цепной реакции 51
2.2.2 Разработка методики ускоренной индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах с использованием генных зондов 55
2.2.3 Идентификация бактерий на основе гомологии ДНК для ускоренной оценки микробных контаминации молока от коров, больных маститом 66
2.2.4 Оценка методов ДНК-диагностики для быстрой индикации Staphylococcus aureus при мониторинге молока и молочных продуктов 70
3 Обсуждение результатов 76
Выводы 88
Предложения для практики 90
Список литературы
- Санитарное значение золотистого стафилококка в молоке и молочных продуктах
- Методы определения Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах
- Методика ДНК-гибридизации на мембранных фильтрах с ДНК, меченной тритием
- Разработка методики ускоренной индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах с использованием генных зондов
Введение к работе
Актуальность темы. Одними из наиболее опасных возбудителен п плане возникновения пищевых токсикозов и токсикоинфекций являются стафилококки, листерии и сальмонеллы. Пищевые отравления людей при данных инфекциях возникают в случае употребления в пищу молока, молочных, мясных, рыбных и других продуктов, причем чаще всего они связаны с молочными продуктами (Поставин ВА, 1980; Логвинов Д.Д., 1992; Eshraghi Н., 1997; Pfleger R. etal, 2002).
Золотистый стафилококк широко распространен во внешней среде, может жить и размножаться в тканях молочной железы, на коже сосков и вымени и является основным возбудителем мастита у коров (Демидова Л.Д., 1997; ГаврилинА.С, 2002; Matsunaga Т. et. al, 1990; Fitzgerald J.R. el. al, 2000).
Заболевания людей, вызванные употреблением контаминированных золотистым стафилококком продуктов, обусловлены наличием в данных продуктах энтеротоксинов, которые вырабатываются стафилококками при определенных условиях.
Сырое молоко и молочные продукты всегда содержат то или иное количество стафилококков и поэтому они могут представлять опасность в плане возникновения стафилококковых интоксикаций (Коган Г.Ф. и др., 1990; Логвинов Д.Д., 1992).
Содержание Staphylococcus aureus в термически обработанном молоке и в молочных продуктах является одним из основных показателей безопасности и нормируется у нас в стране согласно требованиям СанПиН 2.3.2. 1078-01. Индикация Staphylococcus aureus определена в программе Государственного мониторинга сырья и продуктов. Большой объем исследований требует разработки быстрых и вместе с тем высокоспецифнчных и чувствительных методов индикации золотистого стафилококка. Поэтому разработка ускоренных методов определения золотистого стафилококка в молоке и мол< 'ЧЙбс '^РЛХЧ-'НЛ явліется
"$№9}
весьма актуальной, так как это позволяет своевременно выявлять продукты с высокой контаминацией и определять пути ее устранения.
13 настоящее время существует достаточно много тестов выявления Staphylococcus aureus, основанных на методах бактериологического анализа, серологических методах и методах генной диагностики. Наиболее специфичными и чувствительными тестами зарекомендовали себя методы ДИК-диагностики. Они позволяют проводить анализ без предварительного обогащения материала в присутствии близкородственной микрофлоры (Гинзбург Л.Л., 1999; Hill W. et. al, 1983; Moseley S.L. et. al, 1989; Gannon V.P. et. al, 1992; Hashimoto Y., 1995; Myllys V. et. al, 1997; Khan MA. et. al, 1998; Raimundo O. et. al, 1999; Lange С et. al, 1999; Capurro Л. et. al, 1999; Edingloh M. et. al, 1999; Giese S.B. et. al, 2000).
Из литературных источников известно о применении методов на основе ДНК - диагностики для индикации Staphylococcus aureus, однако актуальным остается совершенствование методов и тест-систем индикации, разработка оптимальных вариантов, адаптация их к проведению анализа конкретных объектов (Khan М.А. et. al, 1998).
Большое значение, наряду с индикацией золотистого стафилококка в
продуктах питания, придается вопросам их выявления в молоке коров на
фермах при диагностике мастита, так как они являются наиболее
опасными возбудителями. Однако, учитывая тот факт, что кроме
золотистого стафилококка возбудителями мастита являются и другие
микроорганизмы (стрептококки, . эшерихии, псевдомонады,
коринебактерин, микоплазмы и др.) (Карташова В.М., 1973; Карташова
В.М. и др., 1988; Демидова Л.Д., 1997; Гаврнлин А.С., 2002; Erskine RJ. et.
al., 1987; Fang W. et. al, 1993), при изучении этиологии мастита важным
является проведение идентификации всего спектра возбудителей. При
этом большое разнообразие видов возбудителей, относящихся к разным
родам и семействам, а также масштабность предполагаемых исследований
требуют создания '.ускоренных скрининговых методов идентификации
»* t-« »,, і
микроорганизмов в молоке от коров, больных маститом. Эту задачу можно также решить с помощью одного из методов ДНК-диагностики, а имении» метода, основанного на изучении гомологии ДНК.
Цель и задачи исследований. Целью исследований являлась разработка методов и тест-систем индикации Staphylococcus aureus па основе ДНК-диагностики в молоке и молочных продуктах.
В задачи исследований входило:
-
Разработать методику ускоренной индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах на основе полимеразнои цепной реакции.
-
Разработать методику ускоренной индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах с использованием генных зондов.
3. Провести идентификацию бактерий на основе гомологии ДНК
для ускоренной оценки микробных контаминации молока от коров,
больных маститом.
-
Провести оценку методов ДНК-диагностики для быстрой индикации Staphylococcus aureus при мониторинге молока и молочных продуктов.
-
Разработать методические рекомендации по индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах на основе ДНК-диагностики.
Научная новизна. Отработаны условия выделения ДНК и параметры проведения полимеразнои цепной реакции при индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах.
Разработаны методики индикации Staphylococcus aureus с использованием генных зондов, меченных биотипом, в молоке, сметане, твороге, сыре.
6 Определены чувствительность и специфичность методов индикации
Staphylococcus nureus в молоке и молочных продуктах на основе ПЦР и
ДІIK-I іібрндіпаціш с трнтиевон и биотиновой метками.
Проведена оценка методов ДНК-диагностики для быстрой
индикации Staphylococcus aureus при мониторинге молока и молочных
продуктов.
І'азрабоїана методика идентификации бактерии на основе
гомологии ДИК для ускоренной оценки микробных контаминации
молока от коров, больных маститом.
Практическая ценность. Па основании результатов исследовании разработаны:
- Методические рекомендации по индикации Staphylococcus aureus в
молоке и молочных продуктах на основе ДПК-диагностики (утверждены
Отделением ветеринарной медицины РЛСХН, 10.12.2003 г.).
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:
Международной конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (г. Щелково, 2000 г.);
Международной конференции молодых ученых «Научные основы технологии производства ветеринарных биопрепаратов» ШШТиПП IWCXH (г. Щелково, 2001 г.);
Международной научной конференции «Биотехнология па рубеже двух тысячелетни» (г. Саранск, 2001 г.);
4-й Международной научно-технической конференции «Пиша. Экология. Человек.» (г. Москва, 2001 г.);
заседании Ученого совета ВНИИВСГЭ (2003 г.);
межлабораторном совещании ВНИИВСГЭ (2003 г.).
Основные положения выносимые на защиту,
Условия выделения ДНК и параметры проведения полимеразноп цепной реакции при индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах.
Методики индикации Staphylococcus aureus в молоке, сметане, твороге, сыре с использованием генных зондов, меченных биотипом и тритием.
Чувствительность и специфичность методов индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах на основе ПЦР и ДНК-гибридизации с тритиевой и биотиновой метками.
- Результаты сравнительной оценки методов ДНК-диагностики для
быстрой индикации Staphylococcus aureus при мониторинге молока и
молочных продуктов.
- Методика идентификации бактерий на основе гомологии ДНК для
ускоренной оценки микробных контаминации молока от коров,
больных маститом.
Публикации. Результаты исследований отражены в 5 научных статьях.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложений.
Санитарное значение золотистого стафилококка в молоке и молочных продуктах
Наиболее важными и частыми возбудителями являются стафилококки, стрептококки серогрупп В, С, Е, эшерихии, псевдомонады, коринебактерии, микоплазмы, кампилобактерии и др.
Однако принято считать, что основными возбудителями мастита являются патогенные стафилококки и стрептококки, которые наиболее часто выделяются из молока и секрета вымени больных коров и могут вызвать заболевание в 90% случаев, при этом стафилококки выявляются в 22,9-59,5% случаев, а стрептококки - 11,7-47,1% (30, 45, 63, 88, 95, 199).
Молоко, полученное от коров, больных субклиническим и клиническим маститом содержит стафилококки, в том числе золотистые. По данным ряда авторов, золотистый стафилококк является наиболее частым возбудителем среди всех стафилококков и на его долю приходится от 9,6 до 89% случаев (63, 95, 37, 14, 23), причем мастит, вызываемый золотистым стафилококком является наиболее опасным, так как его трудно ликвидировать (128). Это объясняется тем, что золотистый стафилококк более устойчив к действию антибиотиков, способен паразитировать внутри клеток (L-форма), поэтому требуется длительное время для подавления инфекции в стаде (114), чаще отмечаются рецидивы заболевания (96, 114, 127, 170).
Анализ данных литературы показал, что в зависимости от формы мастита процент выделения золотистых стафилококков изменяется. Так, некоторые исследователи отмечали, что при субклиническом мастите золотистый стафилококк был причиной воспаления в 24,4%-35,24% случаев (95, 194, 205), тогда как при клинической форме - 40,55-47,0% (88, 194, 23).
Опасность золотистого стафилококка для .молочной железы коров заключается в том, что в отличие от стрептококка он содержится в окружающей среде, на коже сосков вымени, доильном оборудовании, руках доярок и при соответствующих условиях способен проникать в молочную железу. При попадании внутрь вымени золотистый стафилококк способен не только проникать в эпителиальные клетки, выстилающие молочную железу и секретирующие молоко, но и размножаться в них (89, 38).
Установлено, что среди различных этиологических агентов S.aureus остается наиболее важной причиной мастита, т.е. бактериальной инфекцией, которая вызывает мягкое воспаление и понижение молочной продуктивности, но без проявления явных признаков болезни (152), что является опасным в плане бесконтрольного поступления золотистых стафилококков в молоко.
Исследования показывают, что почти каждая вторая корова имеет на коже вымени золотистого стафилококка, не вызывающего заболевание, но являющегося потенциальным его возбудителем. Стафилококки более сильно, чем другие возбудители мастита, поражают ткани вымени, так как они вырабатывают токсины, которые разрушают эпителиальные клетки, выстилающие молочные протоки. В ряде случаев молочные протоки закупориваются сгустками, состоящими из бактерий, фибрина и лейкоцитов, что связано с а- токсинами стафилококков, расширяющими кровеносные сосуды вымени (13, 15, 39, 45).
Ряд авторов изучал возникновение повреждений молочной железы у нетелей, вызываемых стафилококковым маститом. Было определено, что ткани из четвертей, инфицированных S.aureus, хуже развивались, содержали значительно меньше альвеолярного эпителия и больше межальвеолярной стромы. При внутривыменных инфекциях S.aureus в отдельных четвертях вымени обнаруживали макро- и микроскопические абсцессы. Это ведет к нарушению развития молочной железы и секреторных тканей и, следовательно, снижению молочной продуктивности в будущем (39, 201).
Роль коагулазоположительных стафилококков в этиологии воспаления молочной железы значительно возрастает, что, очевидно, связано с увеличением поголовья коров в стаде, в результате чего возникают условия для массового перезаражения животных (35).
В последние годы у коров наблюдается увеличение числа случаев мастита стафилококковой этиологии. Это объясняется тем фактом, что в результате беспорядочного и неправильного применения антибиотических препаратов для лечения коров, больных маститом, у стафилококков выработалась устойчивость к их действию (23). Так, ряд исследователей отмечал, что эффективность лечения коров при мастите, вызываемом золотистыми стафилококками, была В пределах 60%, тогда как при стрептококках - 90-100% (114, 180). - Маститы, вызываемые золотистыми стафилококками, возникают как в лактационный, так и в сухостойный периоды. При этом в лактацию его выделяли в 29,66%, а в сухостой - 40,66% случаев (23).
Длительно протекающие после отела инфекции чаще вызывались коагулазоположительными стафилококками (83,3%), чем другими микроорганизмами (23, 196).
Анализ данных литературы показывает, что с годами увеличивается число случаев мастита у коров, вызванного золотистым стафилококком. Так, если в 70-е годы их число при клиническом и субклиническом мастите составляло 26,52 и 34,40% от числа всех выделенных возбудителей, то уже в 90-е годы - 53,85 и 46,31% соответственно (23). Все это указывает на недостаточно эффективную борьбу со стафилококковыми маститами.
Золотистый стафилококк присутствует в вымени не только больных маститом, но и здоровых коров-бактерионосителей, которые постоянно выделяют его с .молоком и поэтому являются потенциальным источником инфекции. По некоторым данным, доля коагулазоположительных стафилококков от общего числа выделенных микроорганизмов из молока здоровых коров составляла 3,5% (63), а по другим - 24,4% (23, 37).
Установлено, что носительство в вымени здоровых коров коагулазоположительных стафилококков или стрептококков в течение 1-2 месяцев завершалось развитием субклинического или клинического мастита (63).
Таким образом, данные проведенных исследований показывают, что золотистый стафилококк имеет широкое распространение среди коров, как при мастите, так и без него, что обуславливает его попадание в молоко.
Мастит стрептококковой этиологии (возбудитель Str.agalactiae) трудноизлечим и легко передается от одной коровы к другой. Больное животное считают основным его источником, так как выделить этот стрептококк из объектов окружающей среды не удалось.
На долю мастита стрептококковой этиологии приходится 30-48% от числа коров, больных маститом бактериального происхождения. Кроме Str.agalactiae выделяют также стрептококки серогрупп С (Str.disgalactiae), Е (Str.uberis), A (Str.pyogenes) (41, 46, 15).
Методы определения Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах
Бактериальные клетки лизировали в буфере, содержащем 4М гуанидинтиоизоционата, ЮОмМ трис-HCl, рН 7,5; 2-меркаптоэтанол в конечной концентрации 2%. Лизис проводили в течение 5-20 мин, при 65С. Суспензию лнзируемых клеток шприцевали пять раз. Дальнейшую очистку ДНК проводили в градиенте плотности хлористого цезия или с использованием сорбентов.
При очистке в градиенте плотности в пробирку объемом 1,5 мл добавляли раствор хлористого цезия 5,7М и наслаивали раствор ДНК. Проводили центрифугирование при 20000g в течение 12 часов при 20С на роторе SW55. Полосу ДНК отбирали и диализовали. Очистку от хлористого цезия проводили диализом.
При очистке с использованием сорбентов NucleoS или ЭкстраГен лизированные клетки добавляли в пробирку с сорбентом. Содержимое пробирки перемешивали на роторе в течение 10 мин, затем центрифугировали 10 секунд при 5000g, осторожно удаляли надосадочную жидкость. К осадку добавляли 300 мкл промывающего реагента, тщательно перемешивали и центрифугировали в течение 10 сек при комнатной температуре при 5000g. Супернатант осторожно удаляли, к осадку добавляли 1 мл рабочего раствора солевого буфера приготовленного по следующей схеме: содержимое флаконов с солевым буфером вносили в мерный цилиндр, доводили бидистиллированной водой до метки 100 мл, затем 96% этанолом до метки 300 мл и перемешивали. Полученный раствор хранили в герметично закрытой посуде при температуре 2-8С в течение 2 месяцев.
После добавления солевого буфера содержимое пробирки перемешивали до получения гомогенной суспензии и центрифугировали 10 секунд при 5000g при комнатной температуре. Супернатант осторожно удаляли. Отмывку солевым буфером проводили дважды. После этого, осадок подсушивали при температуре 65С, не более 3 мин. Затем вносили 100 мкл элюирующего буфера. Суспендировали содержимое пробирки на вортексе 5-10 секунд, до получения гомогенной суспензии, после чего инкубировали 10-15 минут при комнатной температуре, или 3-4 мин при 65С. Проводили повторное суспендирование и центрифугировали 2 мин при 12000 g при комнатной температуре. Супернатант, содержащий ДНК, переносили в чистую пробирку и хранили при температуре минус 20С до использования.
Реакцию радиоактивного мечения ДНК бактериальных клеток методом ник-трансляции (51), проводили в следующем порядке: 20 мкл метки 3Н dHTO высушивали под вакуумом при комнатной температуре. Затем добавляли инкубационную смесь в объеме 50 мкл.
Инкубационная смесь состояла из: 5 мкл буфера (10х) для ник-трансляции; 10 мкл ДНК-фрагмента (100-300нм); 3 мкл не меченых dHTO (по 1нм каждого нуклеотида); 1 мкл ДНКазы (ОДмкг/мл); 1 мкл ДНК-полимеразы 1 Е. coli (3-5 ЕД).
Смесь перемешивали встряхиванием и инкубировали 2 часа при 15С. Реакцию останавливали добавлением 2 мкл 0,5М этилендиаминтетрауксусной кислоты - ЭДТЛ. С помощью осаждения 10% ТХУ (трихлоруксусной кислотой) определяли процентное содержание Н dHTO, включившихся в ДНК. Для этого наносили известный объем (до 10 мкл) пробы в центр диска из стекловолокна (ватман GF/C, диаметр диска 2,4 см). Пробу такого же объема вносили в пробирку, содержащую 100 мкл раствора ДНК из спермы лосося (500 мкг/мл в 20 мМ ЭДТА). Добавляли 5 мл охлажденной во льду 10%-ной ТХУ, размешивали и охлаждали во льду в течение 15 минут. Собирали осадок, отфильтровывали раствор через другой диск из стекловолокна. Промывали фильтр 6 раз 5 мл охлажденной во льду 10% ТХУ, затем добавляли 5 мл 95%-ного этанола. Высушивали оба фильтра под лампой накаливания. Помещали фильтры в сцинтилляционные флаконы,
Просчитывали радиоактивность в сцинтилляционной жидкости на основе толуола. На первом фильтре измеряли общую радиоактивность в пробе, на втором - радиоактивность, включенную в нуклеиновые кислоты.
С помощью этой процедуры количественно осаждаются нуклеиновые кислоты длиной 20 нуклеотидов.
Ник-транелированную ДНК разделяли от невключившихся 3Н сіНТФ на микроколонке с сефадексом G-50 обычной хроматографией. Приготовляли колонку с сефадексом G-50 в подходящей 5 мл стеклянной пробирке. Промывали колонку несколькими объемами буфера ТЕ (рН 8,0). Наносили на колонку пробу ДНК (в объеме 200 мкл). Промывали пробирку, в которой находилась ДНК, приблизительно 100 мкл буфера ТЕ (рН 8,0) так, чтобы скорость потока составляла около 0,5 мл/мин.
В Эппендорфовские пробирки собирали 12-15 фракций по 0,5 мл. ДНК не включается в гранулы сефадекса и выходит в исключенном объеме (обычно составляющем 30% общего объема колонки). Таким образом, первый пик радиоактивности дают нуклеотиды, включенные в ДНК, а следующий за ним пик - свободные Н сІНТФ. Процент 3Н (1НТФ, включившихся в ДНК, определяли путем изменения радиоактивности пробы до и после гельфильтрации. Собирали радиоактивные фракции, составляющие первый пик, и хранили их при минус 20С.
В случае мечения бактериальных ДНК биотином (73, 77), в находящуюся во льду микроцентрифужную пробирку на 0,5 мл вносили следующие реактивы: ДНК 1мкт, 10-кратный объем буфера для ник-трансляции (ЮхНК) - 5 мкл, 5 мкл холодных дезоксинуклеозидгрифосфатов; вода до конечного объема 50 мкл, 0,4 мМ bio -7-dATO 2,5 мкл, ДНКаза 1 (0,4-1,0 нг/мкг ДНК) 2 мкл, ДНК-полимераза 1 (4 ЕД.) 2 мкл. Буфер ЮхНК содержал: 500 мМтрис-HCl, рН 7,6; 50 мМ MgCb, 10 мМ 2-меркаптоэтанол. Все компоненты перемешивали аккуратным встряхиванием пробирки и инкубировали 2 часа при 15С. Реакцию останавливали добавлением 5 мкл стоп-буфера (300 мМ ЭДТА, рН 8,0). Не включившиеся нуклеотиды удаляли при помощи хроматографии на сефадексе.
Методика ДНК-гибридизации на мембранных фильтрах с ДНК, меченной тритием
Несмотря на достаточно большое количество работ, связанных с созданием и совершенствованием методов обнаружения стафилококков в молоке и молочных продуктах, существует реальная необходимость разработки ускоренных, высокочувствительных и специфичных методов индикации указанных возбудителей. Эта актуальность обусловлена необходимостью гармонизации критериев и методов оценки безопасности и качества продуктов питания с международными требованиями. В соответствии с международными требованиями следует проводить большое количество мониторинговых исследований тех или иных производств и продуктов, В связи с большим объемом мониторинговых исследований, применяемые методы должны быть экс пресен ы и отвечать международным стандартам по специфичности и чувствительности. Указанным требованиям вполне соответствуют методы на основе генной диагностики.
За рубежом с использованием ПЦР и ДНК-зондов успешно применяются тест-системы для определения в продовольственном сырье и продуктах питания таких возбудителей как E.coli-157, листерий, кампилобактерий, стафилококков и других возбудителей (112, 117, 131, 133, 138, 142, 144, 149, 154, 156, 157, 166, 175, 202). При этом, несмотря на имеющиеся методики и тест-системы, постоянно проводятся исследования по их совершенствованию: применяются более специфичные нуклеотидные последовательности, модифицируются этапы пробоподготовки и проведения анализа, появляются новые методические подходы, как например, микрочиповые технологии.
В соответствии с нормами СанПиН 2.3.2. 1078-01 в молоке и молочных продуктах требуется определять Staphylococcus aureus, поэтому при разработке методики ускоренного контроля в качестве праймеров были выбраны следующие нуклеотидные последовательности ДНК Staphylococcus aureus: Sa442-1 (5 -AAT CTT TGT CGG TAC ACG ATA TTC TTC ACG-З ), позиция с 5 no 34; Sa442-2 (5 -CGT GAG ATT TGA GAT AAT АСА АСА-З ), позиция с 83 по 112.
В процессе проведенных исследований были отработаны параметры полимеразной цепной реакции с использованием данных праймеров. Оптимальные режимы амплификации для соответствующих этапов были следующими: 1) денатурация - 95С, 2) отжиг - 55С, 3) элонгация - 72С. Снижение температуры отжига приводило к уменьшению специфичности индикации. Использование указаных праймеров и параметров ПЦР позволило специфично выявлять ДНК S.aureus.
Этап выделения матричных ДНК из бактерий контаминируюших молоко и молочные продукты является очень важным. На этом этапе используют различные способы выделения с применением лизирующих, депротеинпзирующих агентов (гуанидинизоционата, протеиназ, органических растворителей). Очистку ДНК проводят с помощью сорбентов (98, 105, 115, 153, 174,178,187).
Для выделения ДНК необходимо провести разрушение клеток с использованием различных детергентов.-Депротеинизацию ДНК проводят, как правило, с помощью хлороформа, а ее осаждение - различными спиртами (обычно изопропанолом). Эндогенные нуклеазы необходимо инактивнровать сразу после лизиса клеток. Для этого лизат смешивают с ингибиторами нуклеаз. РНК удаляют с помощью РНКазы или частично при осаждении ДНК изопропанолом (168).
Для дополнительной депротеинизацип используются различные реагенты, например, проназа или протеиназа (73, 84).
В основном различные модификации процедуры выделения ДНК на основе метода Мармура занимают 1-2 дня, но имеются ускоренные способы выделения ДНК. Например, с помощью фенольного метода (84). При этом клетки лизируют саркозилом и горячим фенолом. Быстрый фенольный метод требует значительно меньше времени, чем метод с использованием протеиназы К, однако он несколько более трудоемок, и в полученных препаратах ДНК может присутствовать незначительное количество белка, что может сказываться на корректной интерпретации результатов с биотинилированнымн ДНК.
Описана также процедура одновременного выделения РНК и ДНК (S3). Чтобы минимизировать деградацию РНК при сохранении высокомолекулярной ДНК, используют замороженный фенол. Дальнейшую очистку и разделение РНК и ДНК проводят центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия. Этим методом удается получать препараты ДНК достаточно высокого качества, пригодные для Саузерн-гибридизации. Однако процедура очень длительна, трудоемка и связана с применением специального оборудования (высокоскоростные центрифуги).
В последнее время появились работы по выделению ДНК с использованием гуанидинтиоизоционата (83, 86).
Гуанидинтиоизоционат - очень сильный денатурирующий агент, который используется как для лизиса клеток, так и для денатурации всех клеточных белков, в том числе нуклеаз.
При использовании высокоспецифичных ДНК-зондов с целью видовой индикации, как правило, не требуется тщательной очистки ДНК-мишеней. Для этих целей используют различные модификации ускоренных методов получения полуочищенных препаратов ДНК (121, 122).
Нами было проанализировано несколько вариантов выделения и очистки ДНК S.aureus из молока и молочных продуктов. При этом в зависимости от консистенции той или иной продукции подбирались оптимальные схемы выделения бактерий.
Разработка методики ускоренной индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах с использованием генных зондов
Пробоподготовка для тест-систем индикации с использованием генных зондов отличалась в зависимости от применяемой метки.
Для биотиновой метки очистку ДНК проводили с использованием органических растворителей (хлороформа или фенола). В случае тритиевой метки из проб выделяли бактериальные клетки, обрабатывали лизостафином и протеиназой.
Чувствительность индикации с применением генных зондов была на два - три порядка ниже и составляла 10 - 10 клеток в пробе, чем при использовании методики ПЦР. Эти данные согласуются с литературными при определении порога чувствительности индикации бактерий на основе ДНК-гибридизации { 133, 142, 144, 149, 175).
Повышение чувствительности метода до 10-100 клеток в пробе удавалось получать при предварительном подращивании бактерий на твердых или жидких питательных средах.
Использование жидких питательных сред при подращивании упрощало схему анализа и сокращало время постановки эксперимента, так как известно, что скорость роста клеток в жидкой среде выше, чем в твердой (12, 22, 58). Кроме того, при этом не требуется подращивать бактерии до высоких концентраций, как это необходимо для образования видимых колоний на твердых питательных средах. В этом случае можно использовать, как тритиевую, так и биоти новую метки, так как условия пробоподготовки позволяют иммобилизировать искомые образцы в виде точек.
При подращивании на твердых питательных средах на наш взгляд более целесообразно концентрировать бактерии на фильтрах, помещенных на эти среды, и использовать схему гибридизации колоний. Указанная схема по нашим и литературным данным (25, 80, 72) значительно сокращает время проведения анализа.
Как было уже сказано, кроме основных возбудителей мастита стафилококков и стрептококков в этиологии этого заболевания принимают участие и другие микроорганизмы: эшернхии, кори небактерии, псевдомонады, а также микоплазмы. Для разработки ускоренного метода анализа молока, от коров больных маститом на микробную контаминацию нами был выбран подход на основе определения гомологии ДНК, так как известно, использование данного подхода для ускоренной идентификации микроорганизмов различных таксономических групп (47, 52, 53).
Результаты проведенных нами исследований показали, что уровень гомологии исследуемых ДНК соответствовал литературным данным по уровню гомологии внутри рода и между представителями разных родов и семейств. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможности идентификации бактерий в исследуемых образцах молока и молочных продуктов.
Для ускоренной оценки спектра возбудителей при мастите нами предложена тест-система на основе гибридизации ДНК. Она включает тест-набор для ускоренного выделения ДНК бактерий, тест-набор для мечения ДНК методом ник-трансляции, фильтры с эталонными иммобилизованными ДНК и тест-набор для проведения гибридизации ДНК с тритиевой меткой.
Предложенная методика значительно сокращает время анализа по сравнению с микробиологическими методами исследования.
Метод определения гомологии ДНК на основе ДНК-ДНК гибридизации хорошо зарекомендовал себя в систематике бактерий. Он используется как для уточнения систематики генетического родства между уже описанными группами, так и при установлении таксономического статуса новых форм. Высокая чувствительность и избирательность позволяет использовать его также для идентификации вновь выделяемых штаммов бактерий. Разработанные ускоренные модификации этого метода позволят проводить скрининг большого количества проб молока и молочных продуков за короткий промежуток времени, Это даст возможность следить за изменениями качественного состава микрофлоры, происходящими под воздействием различных факторов.
Дальнейшая идентификация должна осуществляться с использованием классических схем анализа на основе гомологии ДНК с выделенными и очищенными нуклеиновыми кислотами. При этом первый этап на основе разработанных ускоренных методов позволит значительно сократить число эталонных ДНК.
Кроме того, разработанные ускоренные методы и тест-системы на основе гомологии ДНК могут быть использованы при выявлении конкретных возбудителей в качестве первого скринингового этапа, что позволит в дальнейшем значительно сократить число специфичных тестов на основе классического микробиологического анализа или с применением высокоспецифичных генных зондов и праймеров.
Нами проведены исследования по оценке методов ДНК-диагностики для индикации S.aureus в образцах молока и молочных продуктов, отобранных для сертификации и мониторинга.
Результаты испытаний методами ДНК-диагностики в основном коррелировали с данными бактериологического анализа. Отрицательные результаты по индикации S.aureus бактериологическим методом предположительно могли быть объяснены тем, что в этих образцах присутствовали L- формы S.aureus.
Это предположение было подтверждено путем проведения модельных экспериментов с искусственно контаМинированными вегетативными и L формами S.aureus образцами молока и молочных продуктов. L-формы получали путем воздействия антибиотиков на культуру S.aureus по методу Павловой И.Б. (62). Методы ДНК-диагностики позволяли проводить индикацию вегетативных и L- форм а после длительной инкубации посевов в условиях реверсии L- форм наличие S.aureus было установлено и бактериологическим анализом.
