Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 6
1.1. Идентификация мяса и мясной продукции 6
1.1.1. Метод электорофоретического разделения белков: принципы и использование в экспертизе пищевых продуктов . 11
1.1.2. Энзимологические методы 15
1.2 Иммунологические и молекулярногенетические методы идентификации продукции. 18
2. Собственные исследования 44
2.1. Цель и задачи исследования 44
2.2. Объекты и методы исследования 44
2.2.1 Методика выделения ДНК из мяса крупного рогатого скота.
2.2.2. Мечение биотином бактериальных ДНК методом ник-трансляции 45
2.2.3. Мечение ДНК методом «рассеянной затравки» 45
2.2.4. Методика получения меченых ДНК зондов с помощью полимеразной цепной реакции 47
2.2.5. Методика точечной ДНК-гибридизации на мембранных фильтрах с биотинилированной ДНК 48
2.2.6. Методика гибридизации нуклеиновых кислот с тритиевои меткой 49
2.2.7. Методика полимеразной цепной реакции 50
2.2.8. Методика определения видовой принадлежности мяса методом иммунодиффузии в геле 51
2.2.9. Статистическая обработка результатов
2.3 Результаты исследований 53
2.3.1. Разработка модификаций методов определения видовой принадлежности мяса и мясопродуктов на основе ПЦР 53
2.3.1.1. Разработка метода идентификации говядины на основе ПЦР и электрофоретического разделения амплификатов 53
2.3.1.2. Разработка модификации метода количественного определения ДНК говядины на основе ПЦР с меченными нуклеозидтрифосфатами
2.3.2. Разработка модификаци методов определения видовой принадлежности мяса крупного рогатого скота на основе ДНК-зондов 61
2.3.3. Разработка тест-системы видовой принадлежности мяса и субпродуктов первой категории на основе реакции иммунодиффузии в геле 68
2.3.4. Приборная реализация методов идентификации мяса 70
2.3.4.1. Автоматизация методов идентификации мяса 70
2.3.5. Разработка тест-систем идентификации мяса для стационарных и полевых условий 76
2.3.5.1. Приборная реализация методов идентификации для нестационарных условий 76
3. Обсуждение результатов 82
4. Предложения для практики 92
Выводы 93
Список литературы 95
Приложение
- Метод электорофоретического разделения белков: принципы и использование в экспертизе пищевых продуктов
- Мечение биотином бактериальных ДНК методом ник-трансляции
- Разработка модификаций методов определения видовой принадлежности мяса и мясопродуктов на основе ПЦР
- Разработка тест-системы видовой принадлежности мяса и субпродуктов первой категории на основе реакции иммунодиффузии в геле
Метод электорофоретического разделения белков: принципы и использование в экспертизе пищевых продуктов
Согласно международным стандартам, исследования по ветеринарно-санитарной экспертизе мяса должны применяться на каждой ступени производства, начиная с ферм. Ответственность за безопасность и качество произведенного мяса разделяется между производителем и контролирующими органами.
Стабилизация продовольственного рынка не может быть решена без реализации системы мер в области обеспечения конкурентной способности пищевой продукции и продовольственного сырья.
Наилучших результатов в создании и выпуске конкурентно способной продукции можно достичь путем создания систем сертификации, отвечающих требованиям международных стандартов.
Это нужно еще и потому, что в связи с изменениями характера отечественного рынка за последние годы принимаются меры по интеграции российской экономики в мировую. Для этого необходимо максимально учитывать требования, предъявляемые к России при вступлении во Всероссийскую торговую организации (ВТО).
С этой целью технические регламенты не должны оказывать на торговлю более ограничительных воздействий, чем это необходимо для достижения законных целей, принимая в расчет риски, которые возникали бы при их невыполнении. Такими законными целями, являются, в частности, требования национальной безопасности; предотвращения обманной практики; защита здоровья или безопасности людей, жизни или здоровья животных или растений, либо охраны окружающей среды.
Члены ВТО должны способствовать использованию согласованных санитарных и фитосанитарных мер на основе международных стандартов, предписаний и рекомендаций, разработанных соответствующими международными организациями, включая Комиссию «Кодекс
Алимснтариус», Международное бюро по эпизоотии и соответствующие международные и региональные организации, действующие в рамках Международной конвенции по защите растений, без предъявления при этом членами требований внести изменения в их соответствующий уровень охраны жизни или здоровья людей, животных или растений.
При этом признается, что развивающиеся страны-члены могут сталкиваться с трудностями в плане соблюдения санитарных и фитосанитарных мер импортирующих стран- членов и, как следствие, в доступе к рынкам, а также выработки и применения санитарных или фитосанитарных мер в пределах собственных территорий.
С целью гармонизации санитарных и фитосанитарных мер государства должны основывать свои санитарные или фитосанитарные меры на международных стандартах, предписаниях или рекомендатщях, когда таковые имеются.
Разработка критериев и методов оценки безопасности и качества продовольственного сырья и продукции животного происхождения является одним из важных элементов стандартизации и сертификации указанной продукции. Под качеством сельскохозяйственного сырья и продукции понимается совокупность свойств, обеспечивающих её питательную ценность и безопасность для здоровья потребителя, надежность состава и сохранение потребительских свойств (Renand G., 1993). Безопасность продукции означает отсутствие токсичного, канцерогенного, мутагенного или иного неблагоприятного воздействия её на организм человека.
Ветеринарно-санитарная оценка животноводческой продукции и ветеринарно-санитарная экспертиза проводится на основе ветеринарно-санитарных правил. В настоящее время разработан проект Правил (ВетПиН 13.7.1-2000), который в целом соответствует международным требованиям. В правилах определены более совершенные методы исследований, например методы идентификации мяса и мясопродуктов на основе ДНК-диагностики. Способы определения показателей безопасности и качества продовольственного сырья и продуктов питания, приведенные в 13 томе «Кодекса Алиментариус» основаны на органолептических, физико-химических, биохимических, иммунологических, микробиологических и других методах анализа. Различают арбитражные методы количественного анализа и скрининговые методы с качественной оценкой показателей (Ludke H.,Bargholz J, 1993).
Методы определения показателей безопасности и качества животноводческой продукции в России нормированы соответствующими ГОСТами и другими нормативными документами (Татулов Ю., 1997). Методы исследования, указанные в этих документах в основном базируются на тех же научно-методических подходах, что и международные методы контроля. Однако имеются отличия в плане чувствительности, процедурах пробоподготовки и проведения анализа.
Фасльсификация может рассматриваться как действия, направленные на ухудшение потребительских свойств товара или уменьшение его количества при сохранении наиболее характерных, но не существенных для его использования по назначению свойств (Писарева, 1996 ).
Мясо и продукты его переработки - колбасные изделия, мясокопчености, консервы, полуфабрикаты относятся к наиболее ценным продуктам питания, поэтому они попадают в разряд наиболее часто фальсифицируемых продуктов. Критерии идентификации мяса и мясных продуктов изложены в соответствующих нормативных документах («Мясо Технические условия и методы анализа» 1997, «Колбасы Технические условия и методы анализа» 1997, «Консервы мясные Технические условия» 1997). При идентификации могут использоваться органолептические, морфологические, биохимические, иммунологические и молекулярно-биологические критерии.
Мечение биотином бактериальных ДНК методом ник-трансляции
Число циклов амплификации обуславливается содержанием в образце искомой нуклеотидной последовательности. Чем больше число циклов, тем выше чувствительность метода индикации. Обычно, при ПЦР диагностике используется 20-50 циклов.
Оптимальной матрицей для ПЦР является ДНК, выделенная из нативных образцов обычными методами (Wolf C.,Rentsch J.,Hubner P., 1999). В большей степени для этих целей используют методики с гуанидинтиоизоционатом (Грибанов О.П., и др., 1997; Boom R., Sol С, 1999). Эффективность амплификации такой ДНК обычно выше, чем ДНК, выделенной из фиксированных образцов.
На практике температурные режимы и их продолжительность подбираются опытным путём при использовании положительных и отрицательных контролей. Температура отжига зависит от длины праймеров и их ГЦ-состава. Она определяется по формуле: 4С х (Г+Ц)+ 2С х (А+Т)- 3 (Шибата Д.К., 1999). Длительный начальный нагрев (5 мин при 95С) обеспечивает полную денатурацию всех молекул ДНК. Последующая денатурация в каждом цикле занимает меньший промежуток времени (45-60 секунд). Необходимое время элонгации определяется размером амплифицируемого участка. Считается, что элонгация участка длиной 1000 нуклеотидных пар занимает 1 мин.
Детектирование амплифицированной ДНК осуществляется с помощью различных методов, причем три наиболее распространенных из них: гель-электрофорез, дот-блот-гибридизация и блот- гибридизация по Саузерну. Для получения наиболее точных результатов используется секвенирование амплификатов.
Для правильной интерпретации результатов очень важным является выбор контролей. В каждом анализе необходимы как минимум бланк-контроль, положительный и отрицательный контроли. Бланк-контроль содержит все компоненты, за исключением ДНК матрицы. Положительный контроль с эталонной ДНК матрицей берётся в максимальной и минимальной концентрациях. Это позволяет определить чувствительность и эффективность амплификации. Отрицательный контроль включает заведомо известную ДНК, не имеющую сайтов для используемых праймеров. Отсутствие амплификации в различных контролях может интерпретироваться вследствии ингибирования фермента, деградации ДНК матрицы или её недостаточной концентрацией.
Наряду с интерпретацией конечного результата амплификации по принципу «да» «нет», возможно проведение количественного ПНР анализа (Шибата Д.К., 1999). С этой целью готовят последовательные десятикратные разведения ДНК матрицы и проводят амплификацию в условиях максимальной чувствительности. Число циклов ПЦР при этом может достигать 50. Такой анализ позволяет оценить минимальное число последовательностей мишени в препарате, поскольку при достаточно сильном разведении амплификация должна прекратиться. Если параллельно проводить амплификацию искомой последовательности, то можно определить соотношение между числом клеток и числом последовательностей мишеней.
Широкое применение ПЦР в лабораторной практике ограничивается возможностью загрязнения исследуемых объектов посторонними ДНК, что может привести к ложноположительным результатам. Для предупреждения появления артефактов необходимо оснащение лабораторий соответствующим оборудованием и упорядочение процесса анализа. Необходимо разделить этапы пробоподготовки, постановки ПЦР и детектирование конечного результата.
Широкое использование ПЦР сдерживается также тем, что хотя сама процедура ПЦР автоматизирована, этапы пробоподготовки и детектирования конечного результата в существующих модификациях проводятся вручную и достаточно трудоемки. Для преодоления этих трудностей необходимо как создание специальных автоматизированных приборов, аналогичных современным биохимическим анализаторам, так и разработка тест-систем ускоренного рутинного анализа на основе ПЦР. Работы в этом направлении проводятся в настоящее время. Так, в частности, создана оптимизированная система, позволяющая хранить все реагенты ПЦР в лиофилизировашюй форме в одной пробирке типа Eppendorf (Innis М.А., 1990; Persing D.H., 1993; HayashiK., 1994).
В последние годы интенсивно разрабатывается новая технология ДНК-диагностики, называемая «ДНК-микрочипами». Традиционные методы генной диагностики работают на основе принципа «один ген в одном эксперименте» и вследствии этого, получить цельную картину функций генома очень трудно. Микрочиповая технология позволяет проводить мониторинг всего генома на одном единственном чипе. На различных микроносителях (стекло, нейлоновые мембраны, гели) помещаются образцы ДНК с известной последовательностью в форме точек даиметром 200-300 микрон. После этого исследуемая ДНК метится (обычно флуоресцентной меткой) и гибридизуется с ДНК иммобилизованными в виде точкек. Результаты гибридизации оцениваются флуориметрически с компьютерной обработкой данных.
Методы генной диагностики, могут быть автоматизированы на различных этапах проведения анализа (Heinzelmann R., 1999).
Так, экстрактор ДНК готовит ДНК для блотов из 8 проб тканей за три часа. В этом приборе можно очистить ДНК через цикл протеолитического лизиса клеток, экстракцией белков фенолом и хлороформом, осадить ДНК этанолом и осуществить фильтрацию очищенной ДНК. Преимущество экстрактора - возможность обрабатывать одновременно много проб и уменьшение доли ручного труда. Ручные методы подготовки ДНК часто ведут к разрывам нитей и к загрязнению нуклеазами. Можно ожидать, что будут разработаны экстракторы ДНК, которые основаны па еще более простых процедурах, позволяющих обрабатывать ежедневно сотни проб.
Синтезатор ДНК синтезирует олигопуклеотиды со скоростью синтеза 12-15 минут за один цикл (Caruthers М.Н., 1985). В этом аппарате используется связанный с твердой подложкой нуклеозид для инициации последовательной сборки олигомера (в направлении от 3-го к 5-му концу) из активированных производных нуклеозидов. Модифицированные остатки, включая обнаруживаемые и восстанавливаемые остатки, могут включаться в синтезируемую нить. Этот прибор необходим для синтеза многих проб ДНК.
Для проведения реакции ПНР разработаны отечественные и зарубежные образцы термоциклеров, позволяющие с различной скоростью осуществлять амплификацию нуклеиновых кислот (Saiki R.K., et. al., 1988).
Автоматизацию большого числа обычных биохимических процедур, включая рестриктазный анализ и реакции секвенирования ДНК, можно проводить с помощью специальных роботов. Робот оперирует с платой для микротитрования на 96 ячеек, расположенной на столике с контролируемой температурой, и проводит 24 энзиматических реакций секвенирования ДНК за 45 минут (Wilson A. et. al, 1988).
Разработка модификаций методов определения видовой принадлежности мяса и мясопродуктов на основе ПЦР
В качестве источника антител использовали диагностические, преципитирующие сыворотки к белкам крови крупного и мелкого рогатого скота, свиньи, курицы и индейки. Исследуемыми объектами служили пробы говядины, свинины, баранины, мяса птицы (куриное, индюшиное), смешанных видов фарша, а также субпродуктов говяжьих, бараньих и куриных. Навеску исследуемого образца измельчали, экстрагировали белки и использовали в реакции преципитации. Постановку реакции преципитации в геле и учет результатов осуществляли по Оухтерлони. Анализ полученных результатов показал, возможность определения видовой принадлежности мяса и субпродуктов с помощью реакции преципитации в геле. Время подготовки материала составляло 30-60 мин, а учет результатов в течение 24 часов.
Из данных представленных в таблице 6 видно, что диагностические сыворотки, преципитирующие белки разных видов животных и птицы, специфичны и позволяют установить видовую принаждежность мяса и субпродуктов по результатам реакции преципитации в геле. При этом в смешанном фарше с помощью реакции преципитации были выявлены белки всех видов животных и птицы, мясо которых входило в его состав. Таблица 6.
Внедрение разработанных методов и тест-систем, определение показателей безопасности и качества объектов ветеринарно-санитарного контроля должно основываться на двух направлениях. Первое направление это автоматизация методов и тест-систем с компьютерной обработкой результатов исследования. Это направление может быть использовано в стационарных, соответственно оборудованных лабораториях, как для проведения массовых мониторинговых анализов, так и качестве арбитражной оценки объектов исследований.
Вторым направлением является направление, связанное с проведением анализов внестационарных условий. Оно должо базироваться на экспрессной скрининговой оценке, с последующим подтверждением результатов анализов в стационарных условиях.
Разработанные методы ДНК-диагностики включают в себя сходные операции предварительной обработки проб, дозирования ингридиентов тест-систем, термостатированной инкубации, иимобилизации на фильтрах, отмывки неспецифического связывания и детектирования конечного результата с помощью фотометра или жидкостного сцинтилляционного счетчика.
Вследствие этого, автоматизация методов может осуществляться при использовании общих приборов.
Для автоматизации методов индикации и идентификации на основе ДНК-диагностики нами использовано разработанное ранее экспериментальное устройство автоматического анализа биологических проб (Светличкин В.В.,1994). Общий вид и блок схема устройства представлены на рис. 6, 7. Устройство состоит из блока предварительной подготовки проб и блока детектирования. Блок подготовки проб вьтполнен в виде термостатируемой камеры, внутри которой находятся сменные модули для твердых подложек (хмембранных фильтров) или емкостей с растворами. В сменных модулях проводятся операции предварительной обработки проб: термостатируемая инкубация, фильтрация, иммобилизация или фиксация на фильтрах. В блок предварительной обработки проб входит система фильтрации и вакуумный насос. Все ингредиенты подаются с помощью автоматического дозатора. После проведения всех операций в кюветы с фильтрами дозируется сцинтилляционный раствор, и фильтры анализируются фотоумножителем. Все операции могут программироваться с помощью компьютера.
Для реализации методов идентификации вида мяса нами создан коплект технических средств, включающий пробоотборник, укладку полевого анализа и детектирующее устройство с автономным источником питания.
На рис.8 представлен общий вид укладки, состоящей из трех блоков, соединенных в одну систему. Общий вес укладки 12 кг.
В состав первого блока (рис.9) входит: 1) автоматический дозатор с наконечниками; 2) системы для иммобилизации ДНК на фильтры.; 3) комплект фильтров; 4) комплект стандартных фильтров с эталонной ДНК; 5) пробирки с ДНК зондами; 6) флаконы для соответствующих реагентов и компонентов; 7) плата для проведения анализа; 8) пинцет.
Второй блок (рис.10) представляет собой термостат (1), работающий от автономного источника питания 12В (2) с температурными режимами реакции гибридизации, денатурации ДНК и фиксации ДІЖ на фильтры.
Третий блок (рис.11) включает в себя: комплект запасных частей с емкостями для хранения реагентов и использования, включая флаконы для изотопного анализа (1), емкости для слива отработанных жидкостей (2), а также два пассивных холодильника для длительного хранения реагентов и зондов (3), запасные ингредиенты для идентификации (4).
Разработка тест-системы видовой принадлежности мяса и субпродуктов первой категории на основе реакции иммунодиффузии в геле
За последние годы достигнуты существенные успехи в области разработки новых методов ДНК и иммунодиагностики диагностики с использованием автоматизированных систем, в том числе и с компьютерным управлением. С помощью последних, возможно осуществлять массовые исследования, уменьшить при этом использование ручного труда и персонала. В целом ряде случаев автоматизированные микробиологические комплексы обеспечивают более высокую точность, чувствительность и скорость но сравнению с рутинными анализами (Родин В.И., 2000).
Для автоматизированных систем характерны следующие особенности: точность и быстрота проводимых исследований; автоматизация всех этапов исследований; способность одновременно обрабатывать большое количество проб; постоянное расширение ассортимента проводимых исследований; в ряде случаев большая чувствительность по сравнению с традиционными рутинными методами анализа.
Методы генной диагностики, обладающие высокой чувствительностью и специфичностью, а также быстродействием, являются надежным инструментом в определении одного из важных показателей качества -определению видовой принадлежности мяса. Наиболее часто используемые в практике методы генной диагностики: гибридизация нуклеиновых кислот и амплификация генов, позволяют проводить индикацию и видовую идентификацию в различных смесях. Как было отмечено рядом авторов, внедрение методов генной диагностики в широкую практику, связано с разработкой методов и приборов автоматизированного анализа (Lopresti D.P. et. al., 1997,Chen Shu, et.al., 1998). Автоматизация большого числа различных процедур ДНК-диагностики возможно при использовании специальных роботов.
Новые вычислительные системы с процессорами, обеспечивающими быстрый поиск данных, конструируются специально, чтобы обеспечить выполнение огромных вычислительных задач поисков подобия последовательностей, а также наборов последовательностей в базах данных, которые будут содержать миллиарды байт информации. Эти процессоры будут полезны для анализа данных при определении последовательности ДНК. Новая вычислительная техника и программы будут важным компонентом в автоматизации и масштабном анализе необходимом для будущих приборов, использующих методы диагностики ДНК. Эти приборы и методы уже начинают применяться для диагностики ДНК.
В продолжение работ по приборной реализации методов ДНК-диагностики (Светличкин В.В. и др. 1988, Квятковская А.Ю., 1998) нами проведены исследования по разработке автоматизированных систем определения видовой принадлежности мяса. Было проанализировано несколько схем с использованием биотиновой и изотопной метки. При этом использовались схемы, в которых метка включалась в исследуемые нуклеиновые кислоты в процессе анализа и схемы, в которых были использованы предварительно меченные генные маркеры.
Схемы, включающие предварительно меченые ДНК-зонды, более просты, как с точки зрения автоматизации, так и с точки методического обеспечения, однако имеют большую длительность анализа.
Трудности, имеющие место в схемах, в которых метка вносится в процессе анализа, связаны с включением метки, с выделением меченных нуклеиновых кислот пригодных для последующей ДНК-гибридизации, а также с совмещением этапов выделения ДНК и непосредственно амплификации. Кроме того, существуют определенные трудности в иммобилизации эталонных олигонуклеотидов, определяющих специфическую индикацию в процессе гибридизации. Однако эти трудности, как показывают исследования ряда авторов, могут быть преодолены и данное направление также имеет определенные перспективы (Lopresti D.P. et. al., 1997,ChenS., et.al, 1998).
Как показали исследования, предварительные этапы всех схем определения показателей безопасности могут быть автоматизированы с помощью одних и тех же модулей, и отличаться только конечным этапом детектирования.
Системы с биотинилированними маркерами имеют предпочтение в плане безопасности работ.
Для реализации методов определения вида мяса в полевых условиях нами создан комплект тест-систем и технических средств. Укладка позволяла проводить все этапы пробоподготовки, связанные с выделением и иммобилизацией ДНК, проведением ДНК-гибридизации. Регистрация конечного результата проводилась визуально по интенсивности окрашивания пятен с гибридными молекулами. Пассивные холодильники укладки позволяли хранить необходимые реагенты тест-систем биотестирования и ДНК гибридизации. Результаты исследований показали возможность определения видовой принадлежности мяса в полевых условиях с помощью разработанного комплекта технических средств и тест-систем.
Разработанные автоматизированные системы и комплект технических средств могут быть использованы в практике ветеринарно-санитарного контроля.
Среди иммунологических методов анализа наибольшее распространение получили способы коаглютинации, иммунофлуоресценции и в особенности метод твердофазного иммуноферментного анализа - ИФА, (ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay) (Езерская Е.Я.,Галочкин В.А 1999). Методы ИФА на наш взгляд наиболее перспективны из иммунологических методов для определения видовой принадлежности мяса и мясопродуктов. Однако, они требуют определенного оборудования и могут применяться в специализированных лабораториях.
Для широкой ветеринарной практики представляют интерес более простые методы иммунопреципитации и иммунодиффузии.
Показано использование методов иммунопреципитации для определения видовой принадлежности. Для этого применяли наборы соответствующих преципитирующих и нормальных сывороток разных видов животных (коровы, лошади, свиньи, овцы, козы, собаки, кошки и др.) (Серегин И.Г. и др., 1997). Реакция преципитации в жидкости не пригодна для исследования мутных вытяжек. По этому в наших исследованиях мы предприняли попытку ипользовать метод иммунодиффузии в геле (Ouchterlony О. 1958).
Нами была разработана тест-система определения видовой принадлежности мяса и субпродуктов первой категории на основе иммунодиффузии в геле.
Тест-система позволяет проводить анализ в течение 24 часов. При этом процедура анализа проста и не требует сложной приборной реализации. Для осуществления методики необходимы чашки Петри, дозаторы и термостат. Реакция может проходить и при комнатной температуре. Состав тестсистемы на основе иммунодиффузии позволяет компоновать ее в укладке полевой индикации. Проведенный сравнительный анализ разработанных тест-систем показал возможность их использования для определения видовой принадлежности мяса в различных объектах исследований.
Тест-системы на основе ДНК-зондов и иммунодиффузии в геле перспективны при проведении ускоренного анализа в мало оснащенных приборами лабораториях (на рынках и в полевых условиях).
Тест-системы на основе ПЦР имеют преимущества в плане чувствительности и возможности проведения количественного анализа и вследствии этого могут быть использованы при орбитражных исследованиях. Кроме того, методика на основе ПЦР позволяет анализировать термически обработанную продукцию, что определяет исключительность данных систем при исследовании колбас, консервов и другой продукции, подвергнутой термической обработке.
