Содержание к диссертации
Введение
Литературный обзор 8
Микробиологические аспекты порчи мяса 8
Роль глюкозы в метаболизме возбудителей порчи мяса 16
Применение биосенсоров для экспертизы качества и безопасности продуктов животного происхождения 24
Методология определения свежести мяса 36
Собственные исследования 46
Материалы и методы 46
Разработка метода подготовки проб для биосенсорного анализа свежести мяса 55
Изучение уровня глюкозы в мясе различной степени свежести 61
1 Определение уровня глюкозы в охлаждённом мясе 61
2 Изучение уровня глюкозы в замороженном мясе 71
3 Определение зависимости степени свежести мяса от концентрации глюкозы в мышечной ткани 79
Определение бактериальной контаминации мяса различной степени свежести в зависимости от глубины слоя исследуемого образца 81
1 Определение КМАФАнМ в зависимости от глубины среза охлаждённого мяса убойных животных 81
2 Определение КМАФАнМ в зависимости от глубины среза замороженного мяса убойных животных 91
Изучение санитарно-микробиологических показателей мяса убойных животных 99
1 Изучение санитарно-микробиологических показателей охлаждённого мяса убойных животных 99
Изучение санитарно-микробиологических показателей замороженного мяса убойных животных 112
Обсуждение результатов исследований 123
Выводы 132
Предложения для практики 135
Список литературы
- Микробиологические аспекты порчи мяса
- Применение биосенсоров для экспертизы качества и безопасности продуктов животного происхождения
- Разработка метода подготовки проб для биосенсорного анализа свежести мяса
- Определение бактериальной контаминации мяса различной степени свежести в зависимости от глубины слоя исследуемого образца
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время в нашей стране и во всем мире большое значение занимает проблема качества продуктов животного происхождения. Это вызвано возрастающим влиянием техногенных факторов на окружающую среду, сельскохозяйственные культуры и продуктивных животных.
Система ветеринарного контроля качества и безопасности мяса предусматривает, наряду с производственным контролем, проведение государственного контроля за соблюдением ветеринарно-санитарных правил и норм на всех стадиях убоя скота, разделки туш, переработки, хранения и реализации мяса.
Существующие национальные стандартные методы контроля степени свежести мяса (ГОСТ 23392-78. Мясо. Методы химического и микроскопического анализа свежести; ГОСТ 7269-79. Мясо. Методы отбора образцов и органолептические методы определения свежести) имеют низкую производительность, малую чувствительность и информативность, субъективны, в ряде случаев трудоёмки, дорогостоящи, требуют высококвалифицированного персонала и специальных лабораторий для проведения анализа.
Имеющиеся литературные сведения и данные лабораторных исследований свидетельствуют о расхождении и нестабильности результатов исследования на свежесть мяса, полученных по действующим стандартам. В этой связи возникает необходимость в разработке новых высокопроизводительных приборных методов определения качества мясного сырья, что в определённой степени будет способствовать получению более высокого качества мясных продуктов.
Также актуальным остается вопрос разработки экспресс-методов оценки степени свежести мяса и его безопасности. В настоящее время
весьма перспективными являются биосенсорные методы анализа для оперативного контроля качества продукции в пищевой промышленности и, в том числе, мясной отрасли. Современные биосенсорные анализаторы позволяют с высокой специфичностью и чувствительностью быстро определять химические вещества в биологических материалах. Наряду с этим, биосенсорные анализаторы портативны, относительно дешевы и могут быть использованы в автоматическом режиме. С помощью биосенсоров можно определять токсины, патогенные микроорганизмы, биогенные амины, гормоны, пестициды и другие органические и неорганические вещества.
Широкое использование биосенсорных анализаторов в
ветеринарно-санитарной экспертизе сдерживается слабым
финансированием отрасли, отсутствием доступных приборов и утверждённых методов анализа биологического материала.
Большое распространение в медицине и ветеринарии при диагностике диабета, а также при производстве пищевых продуктов получили амперометрические глюкозные биосенсорные анализаторы, основанные на использовании иммобилизированной глюкозооксидазы.
Известно, что свежее охлажденное мясо убойных животных содержит определённое количество углеводов (гликогена и глюкозы), белков, жиров и других веществ. При нарушении температурных режимов хранения мяса под влиянием микрофлоры и автолитических процессов уменьшается содержание этих веществ и образуются вредные продукты распада.
Таким образом, практически по изменению биохимических показателей мяса можно судить о его доброкачественности. В этой связи при ветсанэкспертизе определённую помощь оказали бы соответствующие биосенсорные анализаторы, которые могли бы быстро и точно устанавливать концентрацию искомых веществ. К сожалению, на
данный момент не разработаны нормативы содержания веществ в мясе различной степени свежести.
В мясе одним из ведущих энергетических субстратов для роста и
развития микроорганизмов является глюкоза, и, вероятно, по степени её
* убыли можно судить о происходящих процессах порчи.
Цель и задачи исследований. Целью работы являлась разработка
ускоренного метода определения свежести мяса на основе использования
амперометрического глюкозного биосенсорного анализатора.
% В задачи исследований входило:
1. Разработать методические подходы к определению глюкозы в
мясе убойных животных с помощью биосенсорного анализатора.
2. Изучить содержание глюкозы в мясе убойных животных в
зависимости от топографии взятия образца и глубины исследуемого слоя.
3. Определить взаимосвязь уровня глюкозы в мясе убойных
* животных, его бактериальную обсеменённости и степени свежести.
4. Определить количественные уровни содержания глюкозы в
мясе различной степени свежести, которые можно использовать в
качестве критериев его свежести.
f 5. Разработать методические рекомендации по ускоренному
определению свежести мяса с использованием биосенсорного анализа.
Научная новизна. Впервые предложен метод биосенсорного анализа свежести мяса, основанный на определении концентрации глюкозы.
Изучена динамика изменения уровня глюкозы в охлаждённой и замороженной говядине, свинине и баранине в зависимости от степени свежести.
Изучены концентрация глюкозы и распространение санитарно значимых микроорганизмов в тушах убойных животных в зависимости от топографии взятия пробы.
Определены уровни глюкозы и общей бактериальной контаминации охлаждённого и замороженного мяса различной степени свежести в зависимости от глубины слоя исследуемого образца.
Установлена зависимость между количеством глюкозы, уровнем микробной контаминации и степенью свежести охлаждённого и замороженного мяса убойных животных.
Практическая ценность работы. На основании результатов исследований разработаны «Методические рекомендации по определению свежести мяса с использованием метода биосенсорного анализа» (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 2004 г.).
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:
4-ой Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции» (Москва, 2002 г);
5-ой Международной научно-технической конференции «Пища. Экология. Человек» (Москва, 2003);
XII Международном Московском конгрессе по болезням мелких домашних животных (Москва 2004 г.);
- 5-ой Международной научно-практической конференции
«Актуальные проблемы ветеринарной медицины, ветеринарно-
санитарного контроля и биологической безопасности
сельскохозяйственной продукции» (Москва, 2004).
Микробиологические аспекты порчи мяса
Известно, что во внутренних слоях мяса здорового животного непосредственно после убоя микроорганизмы вообще отсутствуют или встречаются единичные клетки (Borch Е. et al., 1996; Jay J. M., 2000).
При съёмке шкуры и разделке туш происходит обсеменение её поверхности микроорганизмами, которые в дальнейшем могут вызвать порчу продукта. Микрофлора поверхности мясных туш весьма разнообразна и зависит от многих причин: чистоты шкуры животного перед убоем, условий убоя и первичной обработки скота (метода съёма шкуры), соприкосновения с загрязнёнными инструментами (ножами), чистоты воздуха в цехе и т.д. В связи с этим количество микроорганизмов на 1 см2 площади поверхности мяса может колебаться в широких пределах (10 -10 и более). Upmann Matthias, Reuter Gerhard (1998) установили, что на поверхностях технологического оборудования по обработке свинины встречаются бактерии из семейства Enterobacteriaceae, что обусловило необходимость введения влажной санитарной обработки (Upmann Matthias, Reuter Gerhard, 1998).
На мясоперерабатывающих предприятиях с прогрессивной технологией первичной обработки при хорошем санитарном состоянии производства, когда большое внимание уделяется мойке и дезинфекции оборудования и инвентаря, количество микроорганизмов на 1 см поверхности туш не превышает 104 клеток. Мясо, вырабатываемое с такой бактериальной обсеменённостью, считается благополучным в микробиологическом отношении, но при условии отсутствия патогенных и токсигенных микроорганизмов (Drosinos Е. Н., 1994).
В мясе и мясопродуктах, хранящихся или обрабатывающихся без специальной защиты, практически всегда имеются условия для развития микроорганизмов. В зависимости от состава микрофлоры и условий окружающей среды, а также от состояния продукта скорость и характер превращений компонентов тканей мяса могут быть весьма различными (Gardner G. А., 1966).
Белки мышечной и соединительной ткани обычно подвергаются воздействию ферментов, выделяемых микроорганизмами во внешнюю среду. Продукты гидролитического распада белков мяса являются источником питания микроорганизмов. Такие бактерии, как Clostridium, Pseudomonas, Bacillus и ряд других содержат протеолитические ферментные системы, быстро гидролизирующие белки с образованием растворимых пептидов и аминокислот. В гнилостном разложении белков мяса могут принимать участие одновременно и последовательно аэробные и анаэробные микроорганизмы. Обычно в начальной стадии гнилостного распада на поверхности мяса развиваются аэробные микроорганизмы, а позднее - строгие анаэробы (Dainty R. Н., 1996).
Накопление кислых продуктов в процессе автолитических превращений тканевых компонентов мяса создаёт неблагоприятные условия для каталитического действия протеолитических ферментов некоторых микроорганизмов. Гнилостный распад белков, вызываемый ферментными системами микробов, может протекать по-разному в зависимости от свойств разлагающихся белков, внешний условий и вида микроорганизмов. Многие микроорганизмы способны своими ферментными системами катализировать распад свободных аминокислот или малых пептидов (Markus Richter et. al., 1998).
Микрофлора, контаминирующая поверхность мяса при первичной обработке туш, обычно представлена десятками родов бактерий, плесневых грибов, дрожжей и актиномицетов. Наиболее часто встречаются неспоровые грамотрицательные палочки родов Pseudomonas, Aeromonas, Moraxella, Acinetobacter, Flavobacterium, Escherichia, Proteus; грамположительные неспоровые палочки родов Lactobacillus, Brochothrix, спорообразующие аэробы рода Bacillus и анаэробы рода Clostridium (Larpent Jean-Paul, 2000). Также там часто обнаруживаются грамположительные кокковые формы родов Micrococcus и Staphylococcus; иногда бактерии, вызывающие инфекционные заболевания (Pichner Rohtraud, 2000). ІЩ Из плесневых грибов на мясе главным образом встречаются семейство мукоровых (Mucor, Rhizopus, Thamnidium) и группа несовершенных грибов (многие виды Penicillium, Sporotrichum, Cladosporium, Trichoderma, Aspergillus и др.). Дрожжи представлены родами Torulopsis, Rhodotula, актиномицеты и родственные организмы в основном родами Cory neb acterium, Arthrobacter, Actinomyces (Coates K. J. etal, 1995). Установлено, что если мясные туши после первичной обработки не охлаждать, то на их поверхности могут быстро развиваться мезофильные и психротрофные бактерии. Совместное развитие мезофильной и , психротрофной микрофлоры приводит к очень быстрой порче мяса, особенно если преобладают психротрофные бактерии рода Pseudomonas или мезофильные рода Proteus (Scott J. Н., Nealson К. Н., 1994).
Стефановым И. (1997) на основании исследований 320 проб мяса в 32,5 % проб был выделен Pseudomonas aeruginosa. Наибольший процент (34,3 %) отмечен в сырых котлетах, несколько реже — в парном мясе (30,8 %). Автор допускает, что Pseudomonas aeruginosa может быть причиной порчи мяса, что, в свою очередь, может вызвать массовые случаи токсикоинфекций и заболевания отдельных лиц, употреблявших мясо.
Применение биосенсоров для экспертизы качества и безопасности продуктов животного происхождения
В последние годы возрастает интерес к использованию биосенсорного анализа для оперативного контроля качества продукции в пищевой промышленности и, в том числе, мясной отрасли. Актуальным остается вопрос экспресс-методов оценки свежести, срока хранения, порчи и зараженности продуктов.
Существующие в настоящее время методы анализа чаще всего многостадийны, недостаточно чувствительны, дорогостоящи и требуют больших затрат времени или высококвалифицированного персонала. Весьма перспективным в настоящий момент является разработка биосенсорных методов анализа и конструирование приборов, удовлетворяющих требованиям, предъявляемым к современным (# анализаторам: экспрессность, безреактивность, высокая чувствительность, портативность, относительная дешевизна и др.
Важными характеристиками электрохимических биосенсоров, основанных на амперометрических преобразователях, является селективность, линейность шкалы (т.е. линейная зависимость выходного аналогового сигнала от содержания определяемого компонента) и высокая чувствительность измерении в достаточно широком диапазоне концентраций аналита.
Turner A.P.F. (1988) дал определение термину химический сенсор: устройство, избирательно реагирующие на конкретный химический объект л путем химической реакции и которое можно использовать для качественного или количественного определения аналита.
Очевидно, что такое определение охватывает все сенсоры, основанные на химических реакциях, в том числе высокоспецифические и чувствительные биохимические и биологические реакции для специфического распознавания.
В любом химическом сенсоре есть два основных компонента. В первую очередь, это тот блок, где происходит собственно химическая реакция, и, во-вторых, это преобразователь (трансдьюсер). Результатом химической реакции является сигнал - изменение цвета, флуоресценция, изменение поверхностного электрического потенциала, поток электронов, выделение тепла или изменение колебательной частоты кристалла. Преобразователь откликается на этот сигнал и преобразует величину сигнала в данные о количестве аналита (Tran Minh С, 1993).
По типу преобразователя все химические сенсоры можно разделить на следующие группы:
1. Электрохимические. Потенциометрические сенсоры (ионоселективные электроды, ионоселективные транзисторы (ИСЭ и ИСПТ)) и вольт- и амперометрические сенсоры, включая твердые электролитические газовые сенсоры. Полупроводниковые газовые сенсоры также могут быть включены в эту категорию, хотя механизм их действия не включает химическую реакцию.
2. Оптические. В оптических сенсорах спектроскопическое определение связано с химической реакцией. Оптические сенсоры часто называют «оптодами», и в будущем использование оптических волокон будет повсеместным. Оптические измерения используются во многих биосенсорах. В зависимости от типа оптических сенсоров, в них измеряют поглощение, отражение или люминесценцию.
3. Масс-чувствительные. Этот тип сенсоров основан на использовании пьезоэлектрического эффекта. Сюда включают такие устройства, как акустоволновые поверхностные сенсоры (ПАВ-сенсоры), основанные на использовании пьезоэлектрического эффекта и особенно полезные в качестве газовых сенсоров.
4. Тепло-чувствительные. Сенсоры, относящиеся к этой группе, называют также калориметрическими. Их действие основано на регистрации с помощью преобразователя — например, термистора или платинового термометра - теплового эффекта химической реакции с участием аналита.
Разработка метода подготовки проб для биосенсорного анализа свежести мяса
Общепринятый метод (ГОСТ 7269-79) подготовки проб при органолептической оценке мяса в тесте определения прозрачности и аромата бульона заключается сначала в приготовлении фарша, а затем после смешивания с дистиллированной водой подвергают нагреванию до 80-85 С в кипящей водяной бане. Эта методика субъективна и имеет низкую производительность.
Анализируя существующие методы пробоподготовки при ф\ исследовании мяса на свежесть, мы пришли к выводу, что стандартный метод не подходит для биосенсорного анализа глюкозы, так как при приготовлении экстракта производится разбавление образца мяса в 5 раз, к тому же получаемые большие объёмы экстракта (80 мл) не требуются.
Нами был отработан метод подготовки проб мяса для биосенсорного анализа с применением ручного механического пресса. Суть метода заключается в асептическом выделении мясного сока из кусочка исследуемого мяса массой 5-7 г с помощью механического пресса. Было установлено, что для определения концентрации глюкозы в исследуемом мясе с помощью амперометрического биосенсора требуется всего лишь 20 мкл мясного сока. При этом выделяющегося при прессовании мяса сока в количестве 0,8-1,2 мл вполне достаточно для определения уровня глюкозы в исследуемом мясе в 3-5-кратной повторности.
В этой связи нами были проведены исследования по изысканию оптимальных условий пробоподготовки образцов мяса с применением механического пресса для получения мясного сока с целью дальнейшего анализа глюкозы биосенсорным анализатором. В качестве контроля применяли стандартный метод, в котором, готовили мясной экстракт. Результаты проведённых исследований в табл. 1.
Результаты проведённых исследований, представленных в табл. 1, позволяют установить, что, независимо от способа подготовки пробы, концентрация глюкозы в мясе, определяемая биосенсорным анализатором, практически одинакова и имеет высокий коэффициент корреляции. Вместе с этим установлено, что способ, заключающийся в исследовании мясного сока, менее трудоёмок и в этой связи более предпочтителен для биосенсорного анализа. Следующим этапом разработки пробоподготовки для биосенсорного анализа глюкозы в мясе стало определение массы выделенного мясного сока при различной степени измельчения исследуемых образцов. Результаты проведённых исследований представлены в табл. 2.
Анализ результатов проведённых исследований, представленных в таблице 2, позволил установить, что масса выделившегося мясного сока из охлаждённой и замороженной говядины, свинины и баранины практически не зависит от топографии отбора образца. В то же время из исследуемых образцов замороженного мяса количество полученного мясного сока было примерно в 5-6 раз больше, чем из охлаждённого мяса, что вероятно связано с разрушением целостности структуры мышечной ткани при замораживании.
Установлено, что количество выделяемого мясного сока из исследуемых образцов мяса обратно пропорционально степени измельчения образца. Так, в образцах фарша из охлаждённого мяса масса мясного сока была в 2,5 - 3,2 раза меньше, чем в образцах, подготовленных одним куском.
В то же время в образцах из замороженного мяса, полученных в виде фарша, масса мясного сока было в 1,2 — 1,5 раза меньше, чем в образцах, подготовленных одним куском, что, вероятно, также связано с криодеструктивными процессами при замораживании и размораживании.
При подготовке образца в виде фарша происходит выделение мяса через отверстия механического пресса, что затрудняет процесс компрессии и последующий отбор мясного сока для биосенсорного исследования.
Следующим этапом нашей работы было определение чувствительности биосенсорного метода определения глюкозы. Для выполнения этой задачи были проведены эксперименты на серийных разведениях глюкозы в стерильной дистиллированной воде.
Определение бактериальной контаминации мяса различной степени свежести в зависимости от глубины слоя исследуемого образца
Различают два пути микробной контаминации мяса убойных животных: экзогенная и эндогенная.
Экзогенная контаминация мяса - попадание микроорганизмов на поверхность мяса, происходящая на всех стадиях технологической обработки, начиная с момента убоя (процесс обескровливания, съемки шкуры, извлечения внутренних органов, зачистки). Источниками экзогенного загрязнения могут являться инструменты и оборудование, руки, а также одежда работников, воздух производственных помещений и др.
Эндогенная контаминация мяса (бактериемия, септицемия, абсцессы, гнойно-воспалительные процессы) происходит, по данным Бутко М.П. и Костенко Ю.Г. (1994), при инфекционных заболеваниях, в частности при сальмонеллёзе, инфицирование мяса происходит при жизни животного.
Попавшие микроорганизмы при благоприятных условиях начинают усиленно размножаться, вызывая тем самым различные органолептические и биохимические изменения (Larpent Jean-Paul, 2000).
Гниение мяса может происходить как при доступе воздуха, так и при отсутствии контакта с ним и при одинаковых условиях хранения зависит от исходной микробиологической обсемененности, величины рН мяса, содержания воды в поверхностных слоях (мясо с признаками PSE). Одновременное или последовательное действие различных аэробных и анаэробных микроорганизмов приводит к гидролизу белков мяса с образованием полипептидов разной молекулярной массы и свободных аминокислот. Дальнейшее превращение аминокислот, катализируемое ферментами гнилостной микрофлоры, сопровождается образованием аммиака, оксида углерода и сероводорода, накоплением в мясе органических веществ различной химической природы (жирных кислот, кето- и оксикислот, меркаптанов, сероводорода, при распаде тирозина и триптофана возможно образование индола, скатола, крезола) (Моисеева Е.Л., 1988).
Одним из важных микробиологических показателей степени свежести мяса является количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ).
Результаты изучения КМАФАнМ в образцах охлажденного свежего мяса на различной глубине представлены в табл. 13.
Анализ результатов проведённых исследований, представленных в таблице 13, позволил установить, что в охлаждённом свежем мясе в зависимости от глубины исследуемого слоя и топографии отбора образца КМАФАнМ составляло: для говядины от (4,9±0,3)х104 до (2,8±0,3)х102 КОЕ/г, для свинины (4,3±0,3)х104 - (2,5±0,2)х102 КОЕ/г, для баранины (3,9±0,4)х104- (2,7±0,2)х102 КОЕ/г.
Установлено, что в исследованных образцах поверхностного слоя до (0,5 см) свежего охлаждённого мяса у зареза КМАФАнМ составляло в пределах (3,9±0,4)х104 - (4,9±0,3)х104 КОЕ/г. Наряду с этим, при исследовании образцов охлаждённого мяса у зареза на глубине от 0,5 см до 2,0 см КМАФАнМ находилось на уровне: для говядины (4,1±0,3)х102 -(6,6±0,3)х102 КОЕ/г, для свинины (3,8±0,2)х102 - (8,3±0,4)х102 КОЕ/г, для баранины (3,6±0,3)х102 - (6,9±0,5)х102 КОЕ/г.
Анализ результатов микробиологических исследований охлаждённого свежего мяса в поверхностном слое в области лопатки позволил обнаружить, что КМАФАнМ у говядины, свинины и баранины составило (6Д±0,4)х103 КОЕ/г, (2,2±0,2)х103 КОЕ/г, (4,3±0,3)х103 КОЕ/г соответственно. В то же время, при исследовании образцов охлаждённого мяса в области лопатки на глубине от 0,5. см до 2,0 см КМАФАнМ находилось на уровне: для говядины (2,8±0,3)х10 - (4,8±0,3)х10 КОЕ/г, для свинины (2,5±0,2)х10 - (3,1±0,3)х10 КОЕ/г, для баранины (2,7±0,2)х102 - (5,2±0,4)х102 КОЕ/г.
Установлено, что в поверхностных слоях (до 0,5 см) исследованных образцов свежего охлаждённого мяса в области бедра КМАФАнМ в говядине, свинине и баранине составило (6,9±0,5)х10 КОЕ/г, (4,1±0,5)х10 КОЕ/г, (3,7±0,3)х103 КОЕ/г соответственно. Наряду с этим, при исследовании образцов охлаждённого мяса в области бедра на глубине от 0,5 см до 2,0 см КМАФАнМ находилось на уровне: для говядины (ЗД±0,2)хЮ2 - (4,4±0,2)х102 КОЕ/г, для свинины (2,8±0,4)х102 -(3,3±0,2)хЮ2КОЕ/г, для баранины (3,4±0,2)х102- (4,3±0,4)х102КОЕ/г.
Анализ результатов проведённых исследований, представленных в таблице 13, позволил определить закономерность снижения КМАФАнМ в образцах мяса в зависимости от глубины исследуемого слоя. Так, КМАФАнМ в глубоких слоях говядины было в 120 раз меньше, чем в поверхностном слое, для свинины - в 113 раз, для баранины в 108 раз. При этом установлено, что, несмотря на органолептические показатели, характерные для свежего мяса, количество микроорганизмов в поверхностном слое образцов свежего охлаждённого мяса, взятых у зареза, превышало санитарно-гигиенические нормы в 39 — 49 раз.
Таким образом, можно заключить, что в поверхностном слое охлаждённого свежего мяса отмечается наибольшее количество контаминирующих микроорганизмов, что имеет существенное значение для сохранения его свежести в процессе хранения.
