Введение к работе
Актуальность темы. Болезнь Марека (БМ) - инфекционное, высоко контагиозное, хроническое заболевание кур, широко распространенное во всем мире, характеризующееся развитием массовых лимфоидных новообразований, снижением иммунитета и гибелью птицы (Ш.К. Куляшбекова и соавт., 2001).
Возбудитель относиться к семейству Herpesviridae, роду Mardivirus. Патогенным для кур является вирус первого серотипа. Вирусы второго и третьего серотипов для кур не патогенны и используются для изготовления вакцин.
Диагностика болезни основана на оценке патологоанатомических признаков, подтвержденных гистологическими методами. Окончательный диагноз устанавливается лабораторными методами, согласно ГОСТ 25586-83, предусматривающему, в частности, обнаружение антигенов вируса в РДП, выделение вируса и идентификацию в чувствительных биологических системах (куриные эмбрионы и культуры клеток).
В связи с тем, что стандартные методы диагностики трудоемки, продолжительны по времени и требуют значительных экономических затрат, большое распространение получает диагностика на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), как более чувствительная и оперативная. Однако, существующие методики постановки ПЦР не позволяют проводить дифференциацию различных серотипов вируса в одной реакции (R.F. Silva, 1992; Y. Becker et all, 1993), либо требуют проведения реакции в режиме «nested»-ПЦР (С.В. Полехин, 2002), что связанно с необходимостью использования дополнительных пар праймеров.
Учитывая нестабильность ДНК вируса в пробах биоматериала, большое значение имеет соблюдение жестких условий их отбора, транспортировки и хранения при пониженных температурах.
Поскольку различные серотипы ВБМ имеют сходные антигенные детерминанты, затрудняющие серотипирование, возникает необходимость разработки методов, позволяющих оперативно определять серотип циркулирующего вируса.
Основной причиной возникновения вспышек БМ считают низкую эффективность проведенной вакцинации, обусловленную нарушением условий транспортировки и хранения вакцинного препарата, процессов оттаивания и разведения, временных интервалов между разведением и введением вакцины птице (Р.Н. Коровин и соавт., 2001). Также эффективность вакцинации против БМ, в той или иной степени зависит от наличия и циркуляции других инфекционных агентов (вирусы инфекционной анемии птиц, инфекционной бурсальной болезни и др.).
Используемые в настоящее время методы контроля качества проведенной вакцинации требуют наличия определенных реагентов (антигенов вируса, моно-клональных антивидовых антител), недоступных большинству диагностических лабораторий (Е.И. Ярыгина, 2005).
Таким образом, в настоящее время возникает потребность в методах, позволяющих не только оперативно осуществлять диагностику болезни, но и определять генотип соответствующего серотипа вируса, а также проводить оценку качества проведенной иммунизации на конкретной популяции птицы и изучать влияние сочетанных инфекций на проявление БМ.
Цель исследований. Разработать различные варианты ПЦР для выявления и идентификации вируса болезни Марека (ВБМ), позволяющий осуществлять контроль эффективности специфической профилактики болезни Марека.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
-
Разработать метод отбора и хранения материала, обеспечивающие его пригодность для генодиагностических исследований, в условиях птицефабрики.
-
Провести подбор праймеров и оптимальных параметров проведения диагностической ПЦР, определить ее чувствительность и специфичность, типировать соответствующие серотипы вируса при помощи ПЦР-ПДРФ анализа, а также оценить возможность ее использования при контроле качества вакцинации птицы.
-
Разработать количественную ПЦР в режиме «реального времени» и определить возможность ее использования для предварительной оценки качества вакцинных препаратов.
-
Изучить пригодность методов генодиагностики для оценки эффективности специфической профилактики БМ в эпизоотических очагах, с ассоциированным течением инфекций, вызванных адено- и герпесвирусами птиц.
Научная новизна. Разработан метод отбора и хранения материала для генодиагностических исследований, адаптированный к полевым условиям.
Разработана диагностическая ПЦР, где в качестве мишени использована последовательность гена gpC ВБМ, позволяющая определить серотип вируса при помощи ПЦР-ПДРФ анализа; показана возможность ее использования при контроле качества вакцинации птицы.
Разработана количественная ПЦР в режиме «реального времени» и определена возможность ее использования для предварительной оценки качества вакцинных препаратов.
В производственных условиях установлено влияние сочетанного течения адено- и герпесвирусных инфекций птиц на интенсивность проявления БМ.
Научная новизна подтверждена патентом Российской Федерации.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследований создают перспективы использования ПЦР не только в диагностике БМ, но и в системе мер противоэпизоотических мероприятий при данной болезни. Полученные данные расширяют современные представления о факторах, способствующих снижению уровня эффективности вакцинации птиц против БМ.
Материалы диссертации использованы при составлении методических рекомендаций «Оценка эффективности качества вакцинации против болезни Марека с использованием методов генодиагностики», утвержденных ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО Россельхозакадемии, подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока», отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (прот. №1 от 12.03.2007).
Разработанная система отбора биоматериала для ПЦР исследований может найти широкое применение в практической деятельности.
Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на: Международной научной конференции молодых ученых «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных» (Владимир, 2004); VI Сибирской ветеринарной конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» (Новосибирск, 2006); III Российской конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2006);
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликованы 8 научных статей, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК Минобразования РФ («Сибирский вестник сельскохозяйственной науки»).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 105 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов, практических предложений, списка литературы, приложения. Диссертация иллюстрирована 18 рисунками и 10 таблицами, список литературы включает 227 источников.
Внедрение результатов исследований. Материалы диссертации использованы при составлении методических рекомендаций: «Оценка эффективности вакцинации кур против болезни Марека с использованием методов генодиагностики», утвержденных Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО Россельхозакадемии и подсекцией «Проблемы инфекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» секции инфекционной патологии отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол №1 от 12.03.2007г.)
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Разработка и оценка возможностей использования методов генодиагностики при контроле эффективности специфической профилактики болезни Марека.
-
Результаты изучения влияния аденовирусного гепатита и инфекционного ларинготрахеита на проявление болезни Марека у птиц, вакцинированной против БМ, в эпизоотических очагах, в том числе при ассоциированном течении болезней.
