Содержание к диссертации
Введение
1 Литературный обзор 8
1.1 Качество, безопасность и фальсификация продукции в условиях реформы технического регулирования
1.2 Идентификация сырья, продуктов животного и растительного происхождения. Методы исследования
1.3 Методы определения^ компонентного состава сырья и продукции животного и растительного происхождения .
1.4 Методы определения ГМИ 27
2 Собственные исследования 31
2.1 Материалы и методы 32
2.1.1 Методика определения видовой принадлежности мяса на основе иммунодиффузии (по Оухтерлони) 33
2.1.2 Методика определения видовой принадлежности мяса с использованием тест-систем иммунодиффузии серии ORBIT, РИМЕ, SOFT, PROFIT (США)
2.1.3 Модифицированная методика определения видовой принадлежности с использованием мембранных фильтров, ~. пропитанных отечественными преципитирующими сыворотками
2.1.4 Методика выделения ДНК с использованием детергента „~ СТАВ
2.1.5 Методика выделения и очистки ДНК с использованием ~,-детергента СТАВ и иммуномагнитосепарации
2.1.6 Методика определения^ компонентного состава на основе „^ ДНК-гибридизации с ДНК-зондами, меченными биотином
2.1.7 Методика идентификации мяса на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией с использованием тест- 37 систем SureFood
2.1.8 Модифицированная методика, определения компонентного состава сырья и продукции на основе амплификации с 39 последующей гибридизацией
2.1.9 Методика качественного определения ГМО на основе амплификации с последующей гибридизацией
2.1.10 Статистическая обработка результатов 40
2.2. Результаты исследований 40
2.2.1. Разработка схемы последовательного разделения белков и
ДНК, позволяющей проводить параллельное определение , ~ компонентного состава продукции на основе анализа белка
или нуклеиновых кислот
2.2.2 Разработка модифицированной методики определения ,-компонентного состава сырья и мясной продукции на основе иммунодиффузии Усовершенствование определения компонентного состава с применением отечественных преципитирующих сывороток 48
Модифицированная методика определения видовой принадлежности с использованием мембранных фильтров, s1 пропитанных отечественными преципитирующими сыворотками
Разработка модифицированной методики определения -компонентного состава на основе ДНК-зондов
Разработка модифицированной методики определения компонентного состава сырья и продукции на основе амплификации с последующей гибридизацией
Сравнительное изучение методов определения компонентного состава сырья, термообработанных и не 69
термообработанных полуфабрикатов
Обсуждение результатов 72
Выводы 82
Предложения для практики 84
Список литературы
- Идентификация сырья, продуктов животного и растительного происхождения. Методы исследования
- Методы определения^ компонентного состава сырья и продукции животного и растительного происхождения
- Методика определения видовой принадлежности мяса с использованием тест-систем иммунодиффузии серии ORBIT, РИМЕ, SOFT, PROFIT (США)
- Методика определения^ компонентного состава на основе „^ ДНК-гибридизации с ДНК-зондами, меченными биотином
Введение к работе
Актуальность темы В соответствии с Федеральным законом о «Техническом регулировании» производитель и продавец не должны вводить в заблуждение покупателя о составе своей продукции. Продукция должна отвечать всем требованиям технического регламента и соответствующего стандарта. Однако в некоторых случаях недобросовестные производители фальсифицируют продукцию.
В последние годы значительно увеличился ассортимент мясной продукции, в которой используются растительные добавки, при этом в качестве растительных компонентов могут применяться генно-модифицированные источники (ГМИ).
Объемы продукции, которая содержит компоненты животного и растительного происхождения, постоянно увеличиваются.
Продукция, содержащая белок или ДНК генно-модифицированных источников, должна соответствующим образом маркироваться. Сырье и продукция, содержащие компоненты животного и растительного происхождения, отличающиеся от декларированного содержания компонентов в нормативных документах (технические условия, международные национальные и отраслевые стандарты), являются фальсифицированными.
Подтверждение соответствия сырья и продукции нормативным документам является важным элементом Федерального закона «О техническом регулировании» и проводится на разных стадиях оборота продукции: от производства до реализации в торговых точках. Естественно, что хорошо оснащенные аккредитованные Испытательные лаборатории могут осуществлять контроль с помощью высокочувствительных и специфичных методов на стадиях сертификации и регистрации сырья и продукции. Однако практические лаборатории ветеринарно-санитарного контроля нуждаются также и в экспрессных скрининговых методах.
В связи с этим актуальным является разработка и совершенствование методов, позволяющих проводить определение компонентного состава на основе анализа белка или ДНК при скрининговых или арбитражных исследованиях. Наиболее перспективными в этом направлении являются методы ДНК- и иммунодиагностики (И.Н. Комарова, 2004; A.M. Смирнов и др., 2005; В.В. Светличкин, 2005; С. Huang, Т.М. Pan, 2005).
Цель и задачи исследований Целью исследований являлось совершенствование определения компонентного состава сырья и продуктов животного и растительного происхождения.
В задачи исследований входило:
• разработать методику последовательного разделения белков и ДНК, позволяющую проводить параллельное определение компонентного состава продукции на основе анализа белка или нуклеиновых кислот;
• усовершенствовать методику определения компонентного состава сырья и продукции на основе иммунодиффузии для идентификации животных и растительных компонентов;
• усовершенствовать методику определения растительных и животных компонентов на основе ДНК-зондов;
• усовершенствовать методику определения компонентного состава сырья и продукции на основе амплификации с последующей ДНКгибридизацией; провести сравнительное изучение методов определения компонентного состава сырья, термообработанных и нетермообработанных полуфабрикатов и мясных изделий, содержащих животные и растительные компоненты.
Научная новизна Предложены усовершенствованные методы идентификации растительных и животных компонентов продукции на основе анализа белка методами иммунодиффузии и на основе ДНК методом гибридизации нуклеиновых кислот со специфическими ДНК-зондами, а также с помощью модифицированной методики на основе амплификации, позволяющей выявлять животные и растительные компоненты, включая компоненты из генномодифицированных источников. При этом разработана модификация метода иммунодиффузии с фильтрами, пропитанными отечественными сыворотками, расширяющая спектр определяемых компонентов, включающий растительные белки, оленину, конину, лосятину, и позволяющая проводить идентификацию в нетермообработанных полуфабрикатах с чувствительностью 4%.
Усовершенствована методика определения растительных и животных компонентов на основе ДНК-гибридизации на мембранных фильтрах с биотинилированными зондами с чувствительностью 1%.
Усовершенствована методика определения компонентного состава продуктов, состоящих из ингредиентов животного и растительного происхождения, на основе ПЦР, включающая ускоренную пробоподготовку с применением детергента СТАВ (цетилтриметиламмониум бромида) и иммуномагнитосепарации, амплификацию ДНК и детектирование ампликонов по имму но ферментному типу с чувствительностью определения ДНК животного происхождения и Д1Ж ГМИ растений 0,1%.
Проведена сравнительная оценка методов, показавшая высокз^ ю чувствительность методов на основе ПЦР, а также специфичность, позволяющих проводить анализ в смешанных фаршах, полуфабрикатах и термообработанных мясорастительных колбасах.
Практическая ценность На основании результатов исследований разработаны:
•Методические рекомендации по определению состава сырья и продукции, состоящих из мясных и растительных компонентов с помощью реакции ДНК и иммунодиагностики (утверждены отделением ветеринарной медицины РАСХН
07.04.2008 г. Рощупкина Л.В.) Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:
• Международной научно-производственной конференции, посвященной 100- летию со дня рождения профессора Авророва А.А. (Воронеж, 2006 г.);
• Международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2007 г.);
• межлабораторном совещании ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии (2009 г.).
Публикации Результаты исследований отражены в 4 научных статьях, из них 2 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Идентификация сырья, продуктов животного и растительного происхождения. Методы исследования
Идентификация сырья и продукции является важным элементом при подтверждении ее соответствия нормативным документам (технические регламенты, стандарты). Не соответствие сырья или продукции указанным параметрам идентификации является введением в заблуждение потребителя (12, 66, 33). Фальсификация продукции - это несоответствие компонентного состава нормативным документам, по которым она изготовлена. При этом может происходить ухудшение потребительских свойств товара и наиболее свойственных ему характеристик (49, 54).
Наиболее часто подвергаются фальсификации мясные и рыбные полуфабрикаты, мясная и рыбная готовая продукция. Данная продукция является источником высоко усвояемого животного белка с оптимальным соотношением незаменимых аминокислот, поэтому при ее фальсификации могут проявляться негативные последствия, отражающиеся на здоровье человека (23, 33).
При идентификации сырья и продуктов животного и растительного происхождения используются различные методы: молекулярно-генетические, морфологические, органолептические, биохимические, иммунологические, физико-химические (определение йодного числа жира, показатели рефракции, реакция преципитации) (10). Идентифицирование сырья и термообработанного мяса с помощью масс спектрометрического анализа или электронного парамагнитного резонанса, хотя и являются достаточно чувствительными методами, однако, представляются малоспецифичными (13). Кроме того, и масс спектрометрический анализ, и метод электронного парамагнитного резонанса достаточно сложны и требуют специального оборудования.
При идентификации используется определение межвидовых различий мышечной ткани животных с помощью гистологических методов, которые позволяют не только проводить идентификацию, но и определять содержание различных примесей тканей другого вида животных и растений (82-83). Получены данные по дифференциации общего белка мышц собаки, свиньи, барана, установленные путем изучения спектра поглощения белка (53). Эта дифференциация объясняется различным содержанием в белках аминокислот финилаланина, триптофана и тирозина.
Гистологический микроструктурный анализ является одним из методов, с помощью которого можно проводить оценку качества сырья, используемого в перерабатывающих производствах мясного, рыбного направления; определять составные части фарша и их количественное соотношение; обнаруживать в колбасных изделиях и рубленых полуфабрикатах различные добавки; оценивать санитарные показатели используемого сырья и готовой продукции (2, 38, 82).
Электрофоретические методы позволяют проводить идентификацию по нативным и денатурированным белкам. Использование автоматизированных приборов для этих методов обеспечивает быстрое разделение белков и стандартные условия постановки реакции (17, 54). Разработаны различные модификации этих методов.
Наиболее эффективным для идентификации сырья и термообработанных мясных или рыбных продуктов (мясные консервы, колбасы, сосиски) является метод электрофореза с додецилсульфатом натрия - SDS-электрофорез (17, 54). Этот метод позволяет проводить идентификацию компонентов как животного, так и растительного происхождения и дает возможность обнаруживать до 0,02% фальсифицирующих примесей.
Наличие тех или иных ферментов в тканях животных является характеристикой, используемой при идентификации (54).
Разработан национальный стандарт ГОСТ Р 52 723-2007 «Продукты пищевые и корма. Экспресс-метод определения сырьевого состава (молекулярный)». Однако в этом стандарте используется только метод ГШР для определения генома свиньи, курицы, сои, картофеля, кукурузы. Методика ПЦР относительно дорогостоящая и требует специального оборудования. Кроме того, в данном стандарте не охвачены все возможные ингредиенты для определения компонентного состава (18).
Наиболее специфичными при идентификации являются иммунологические методы (иммуноферментные, иммуноэлектрофоретические, иммунохроматографические, иммунодиффузные и др.), а также методы ДНК-диагностики (116, 141,143).
В иммунных тестах применяются моноклональные антитела, повышающие специфичность метода (134).
Наиболее чувствительными и специфичными являются молекулярно-генетические методы для идентификации сырья и продукции животного и растительного происхождения. Наиболее часто используются методы ПЦР ДНК-гибридизации (34-36, 41, 46, 78, 84, 89, 108, 116, 119, 125-127, 130-131, 143,150-152,155, 160,162-163).
Была разработана тест-система «БИТ» для определения ДНК жвачных животных на основе ПЦР. Чувствительность метода - 10 копий ДНК, а специфичность - 100% (35). Тест-система позволяет проводить определение ДНК как в сырье, так и в термообработанной продукции.
Методы определения^ компонентного состава сырья и продукции животного и растительного происхождения
В настоящее время широко используются многокомпонентные полуфабрикаты и продукция, содержащие ингредиенты животного и растительного происхождения. Причем в качестве растительных компонентов часто выступают различные линии генно-модифицированной продукции (90, 92, 95-96, 124, 137-138). Производство таких изделий не запрещено законом, их состав регламентируется техническими условиями или отраслевыми и национальными стандартами. При этом компонентный состав должен строго соответствовать указанным документам, в противном случае потребитель будет введен в заблуждение, что противоречит закону и сказывается на питательной ценности продукции.
Чаще всего в многокомпонентных смесях содержатся белки растительного происхождения (белки сои, кукурузы и др.). Генетически модифицированные растения проходят специальные исследования на качество и безопасность и только после этого поступают в оборот (74, 75). Введение соевых белков позволяет сохранять свойства, качество мясного сырья и органолептические показатели (консистенция, внешний вид, сочность), отвечающие товароведческим характеристикам.
Использование соевого белка значительно снижает себестоимость мясной продукции. Вследствие этого стремление к снижению себестоимости
без отражения компонентного состава в нормативных документах может являться причиной фальсификации продукции.
При производстве мясных изделий (пельмени, фарши, рубленые полуфабрикаты, колбасы, консервы) в зависимости от технологических особенностей используются различные виды соевых белковых препаратов: изоляты, концентраты, текстураты и мука.
Для определения компонентного состава сырья и продукции в основном применяются методы гистологического анализа, SDS-электрофореза, иммунологические методы и методы ДНК-диагностики.
Гистологический метод дает возможность не только проводить идентификацию, но и дифференцировать особенности тканевых и клеточных структур, свидетельствующие о качестве продукта.
Однако, несмотря на эффективность гистологического метода, он требует специального оборудования и не всегда специфичен, что создает определенные трудности его использования, особенно при арбитражном анализе.
Электрофоретические методы давно используются в научных и практических исследованиях, в частности, для определения видовой принадлежности продукции.
Сущность этих методов заключается в экстракции белков и разделении их с помощью SDS-электрофореза или изоэлектрофокусирования. При этом фракции белков дают соответствующие белковые спектры, как общие для различных видов, так и специфичные для определенных видов животных или растений. По специфичным зонам или, как их называют «маркерным зонам», проводят идентификацию. Применение этих методов для идентификации мяса, белковых добавок, в частности сои, в мясных изделиях показано в работах Писаревой В.М. и Горожаниной Е.С. (17, 54). Есть данные о возможности использования метода SDS-электрофореза для идентификации термообработанных продуктов (17, 54). Метод SDS-электрофореза в сочетании с денситометрией применялся для качественной оценки различных ингредиентов в многокомпонентных пищевых продуктах (фаршевые изделия и термообработанные пищевые продукты).
Разработана модифицированная методика количественного анализа, включающая построение калибровочной кривой.
Мониторинговые исследования пищевой продукции с применением методов SDS-электрофореза показали возможность выявления недекларированных компонентов растительного и животного происхождения.
Разработанные методы могут быть использованы для скрининговых тестов и количественного определения отдельных составляющих в многокомпонентных смесях животного и растительного происхождения.
Однако денатурация белков при различных условиях термообработки, вероятно может влиять на специфичность данного метода. В частности, метод не позволял проводить идентификацию в стерилизованных консервах (17).
Для определения компонентного состава продукции могут применяться иммунологические методы.
Иммунологические методы использовались для определения различных веществ (гормоны, антибиотики и другие химические агенты), для идентификации продукции и определения фальсифицирующих примесей (определение видовой принадлежности мяса и мясопродуктов, качественного состава и количественного содержания ингредиентов в многокомпонентных продуктах и кормах) и для индикации и идентификации возбудителей инфекций (8-9, 47, 68, 77, 86, 148, 157).
Иммунологические методы обладают высокой специфичностью, чувствительностью, возможностью проведения качественного и количественного анализа и могут быть использованы в качестве тестов при сертификации и ветеринарно-санитарной экспертизе.
Методика определения видовой принадлежности мяса с использованием тест-систем иммунодиффузии серии 34 ORBIT, РИМЕ, SOFT, PROFIT (США)
Для выделении ДНК использовали СТАВ-буфер, включающий следующие компоненты: 3%- СТАВ, 1.4M-NaCL, ШОмМ TrisHCL до рН 7.8-8.0 и ЗОмМ EDTA.
Смесь буфера с исследуемым образцом инкубировали 20 минут при температуре 50С. Проинкубированный образец центрифугировали при комнатной температуре 10000g в течение 15 минут.
Надосадочную жидкость в объеме 300-500 мкл очень аккуратно, не захватывая осадок и капли жира, переносили отдельными наконечниками с аэрозольными фильтрами в новые пробирки.
ДНК растворяли и очищали с помощью иммуномагнитосепарации с «Silica» (Si02). Смесь центрифугировали при 16000 об/мин (10000g) в течение 10 мин. Элюат ДНК собирали в отдельную пробирку и переосаждали изопропанолом. Осадок растворяли в 50 мкл ТЕ-буфера. Выделенную и очищенную ДНК использовали для постановки ПЦР или хранили при -20С до использования. Кроме того, после обработки с «Silica» (Si02) проводили очистку ДНК иммуномагнитосепарацией на специальном приборе. В последнем случае осаждение изопропанолом не требуется.
Выделенную и очищенную ДНК растворяли в стандартно-солевом растворе (ССР), денатурировали в кипящей водяной бане в течение 5-10 мин, иммобилизовали на мембранные нитроцеллюлозные фильтры, предварительно обработанные раствором ЮхССР в виде точек, не допуская их перекрывания. Иммобилизованную ДНК фиксировали в течение 30 мин при 80С и гибридизовали с меченными ДНК-зондами. В качестве ДНК-зондов для растительных компонентов использовали фрагмент хлоропластной ДНК, меченный биотином. При этом в качестве ДНК-зондов животного и растительного происхождения использовали биотинилированную ДНК. Затем фильтры трижды отмывали от несвязавшегося зонда по 10 мин при комнатной температуре в промывочном растворе I, содержащем: 50 мл 20хССР, 10 мл 10% раствора ДСН и 440 мл дистиллированной воды. Далее осуществляли промывку в промывочном растворе П, содержащем 50 мл 20хССР; 450 мл дистиллированной воды. Проводили «забивку» фильтров в течение 40 мин при 37С, в растворе содержащем: 25 мг сухого молока; 22 мл раствора АР7.5; 3 мл 10% желатина. Раствор АР7.5 содержал: 5 мл 1М MgCl2; 20 мл 5М NaCl; 75 мл 1М трис рН 9.5, в одном литре дистиллированной воды. Затем фильтры промывали в растворе АР7.5 и помещали в 6 мл рабочего раствора коньюгата стрептавидин фосфатаза на 15 мин, при комнатной температуре. Фильтры промывали три раза по 10 мин в растворе АР7.5 и 1 раз в течение 5 мин в растворе АР9.5. Затем фильтры инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 20-30 мин в проявляющем растворе, содержащем: 4 мл раствора АР9.5; 17,6 мкл раствора хромогена тетразолия нитроголубого и 13,2 мкл раствора субстрата бром-хлор индолит фосфата. Результаты гибридизации оценивали визуально или по интенсивности окрашивания пятен, по сравнению с контрольными образцами.
Методика идентификации мяса на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией с использованием тест-систем SureFood.
Отбирали 40 мг пробы, гомогенизировали и переносили в пробирку типа Эппендорф объемом 2 мл. Протеиназу К расворяли в 2 мл воды. Добавляли 400 мл лизирующего буфера и 40 мкл протеиназы, содержимое пробирки перемешивали на Vortex, помещали в термомиксер и инкубировали при 50С в течение 20 мин при непрерывном встряхивании, затем центрифугировали в течение 5 мин при 10000 об/мин (для отделения нелизированных компонентов). Надосадочную жидкость переносили в чистую пробирку Эппендорфа на 1,5 мл. В пробирку добавляли 200 мкл связывающего буфера и хорошо перемешивали на Vortex. Содержимое пробирки переносили на фильтр, который предварительно помещали в центрифужную пробирку на 2 мл. Инкубировали при комнатной температуре в течение 1 мин. Центрифугировали при 10000 об/мин в течение 5 мин. Фильтрат удаляли, а фильтр помещали обратно в центрифужную пробирку.
Готовили буфер для промывки. Для этого к исходному раствору добавляли 42 мл 99,8% этанола, закрывали крышку и тщательно перемешивали раствор. Готовый раствор хранили с плотно закрытой крышкой.
На центрифужный фильтр добавляли 550 мкл буфера для промывки и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 1 мин для промывки ДНК. Фильтрат удаляли, а фильтр помещали обратно в центрифужную пробирку и повторяли промывку еще раз.
После повторной промывки фильтр помещали обратно в пробирку и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 2 мин для того, чтобы удалить остатки буфера для промывки с фильтра. Для последующего элюирования ДНК готовили горячий элюирующий буфер путем нагревания в термомиксере при 52С. Для каждой исследуемой пробы необходимо готовить 105 мкл буфера (с учетом испарения).
Методика определения^ компонентного состава на основе „^ ДНК-гибридизации с ДНК-зондами, меченными биотином
Подтверждение соответствия сырья и продукции нормативным документам является важным элементом закона «О техническом регулировании» и проводится на разных стадиях оборота продукции.
Продукция, содержащая компоненты животного и растительного происхождения, отличающаяся от декларированного содержания компонентов в нормативных документах (технические условия, международные национальные и отраслевые стандарты) является фальсифицированной.
Увеличение ассортимента продукции, включающей ингредиенты животного и растительного происхождения, и необходимость определения соответствия продукции со стороны Госнадзорных органов, сделало актуальным разработку ускоренных и эффективных методов определения компонентного состава такой продукции (8, 21-22, 28,29).
В отличие от национального стандарта ГОСТ Р 52 723-2007 «Продукты пищевые и корма», в котором используется только дорогостоящий метод ПЦР и не охвачены некоторые ингредиенты для определения компонентного состава, нами предпринята разработка ускоренных методов, позволяющих проводить идентификацию ингредиентов как для скрининговых, так и для арбитражных исследований.
В результате исследований была разработана методика пробоподготовки, которая включала экстракцию белков для анализа на основе иммунодиффузии и выделение ДНК для определения видовой принадлежности компонентов, включая ГМИ, на основе различных методов ДНК-диагностики.
В соответствии со схемой пробоподготовки пробу гомогенизировали, из одной части пробы экстрагировали белки ТРИС-буфером для последующей идентификации с помощью иммуноферментного анализа. Гомогенат осаждали центрифугированием и выделяли ДНК, как описано в методах, для последующей идентификации растительных и животных компонентов на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией. Как показали результаты наших исследований, степень очистки ДНК животного и растительного происхождения по предложенной нами схеме была весьма высокой. Отношение по белку А26о/А28о Для полученных ДНК обоими методами равно 1.8; по полисахаридам А260А230 примерно 2.2.
Полученные данные свидетельствовали о достаточно хорошей очистке ДНК от белка. При этом такая очистка происходила как при выделении ДНК с применением детергента СТАВ, так и по методике с использованием сорбента.
Дополнительное использование сорбента или органических растворителей по методу Мармура делает анализ более трудоемким, кроме того, для выполнения метода Мармура необходимы специальные условия для работы с органическими растворителями. Неоднократное осаждение и переосаждение ДІЖ приводит к ее потерям. На основании собственных и литературных данных (51, 73) при определении компонентного состава предпочтительнее использовать детергент СТАВ, который дает возможность выделять ДНК животного и растительного происхождения, включая ГМО. Для очистки ДНК от белков при исследовании термообработанной продукции в стандартизованных по международным требованиям тест-системах амплификации используется протеиназа К. В своих исследованиях для очистки от белка мы применяли эффективный способ, сочетающий обработку детергентом СТАВ и иммуномагнитосепарацию.
Определение компонентного состава на основе белка мы проводили с помощью метода иммунодиффузии.
Постановка реакции иммунодиффузии занимала по времени 10-20 минут. После выделения белковых фракций в соответствии с представленной выше схемой проводили идентификацию компонентов в смешанных фаршах.
На первом этапе идентификацию мяса проводили с использованием тест-систем ORBIT, PRIME, SOFT, PROFIT, стандартизованных по международным требованиям системы ИСО 9000.
Сертификация производства по ИСО 9000 дает достаточную гарантию указанным тест-системам для использования их в идентификации мяса и мясной продукции. Однако данные тест-системы ранее не апробировались при исследовании продукции, состоящей из многокомпонентных систем.
