Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1 Основные положения об идентификации и фальсификации пищевого сырья и готовой продукции 8
1.2 Виды фальсификаций мясного сырья, полуфабрикатов и готовых мясных изделий 10
1.3 Органолептические и морфологические показатели видовой принадлежности мяса и мясных продуктов 12
1.4 Физико-химические показатели видовой принадлежности мяса и мясных продуктов 15
1.5 Инструментальные методы идентификации и выявления фальсификаций видового состава мясного сырья и готовых мясных продуктов 17
1.6 Сущность полимеразной цепной реакции (ПЦР) 32
1.7 Применение метода ПЦР для видовой идентификации мясного сырья и продуктов животного происхождения 35
1.8 Количественная оценка содержания компонентов животного происхождения в составе мясного сырья, полуфабрикатов и готовых мясных изделий с использованием метода ПЦР 39
1.9 Заключение 43
2. Собственные исследования
2.1 Материалы и методы
2.1.1 Объекты исследования 46
2.1.2 Методы выделения ДНК из проб исследуемого материала 47
2.1.3 Метод полимеразной цепной реакции (амплификация ДНК) 53
2.1А Метод электрофоретического анализа продуктов ПЦР 55
2.1.5 Учет и интерпретация результатов ПЦР 58
2.1.6 Конструирование и калибровка внутренних стандартов для конкурентной ПЦР 59
2.1.7 Метод кольцепреципитации в капиллярах 60
2.1.8 Метод иммунодиффузии с бумажными дисками 63
2.2. Результаты исследований
2.2.1 Разработка и испытание однолокусных и мультилокусной ПЦР-тест-систем для видовой идентификации тканей крупного рогатого скота, свиней и кур в составе мясного сырья и готовых мясных продуктов...65
2.2.1.1 Подбор ДНК-мишени, конструирование видоспецифичных праймеров и выбор метода экстракции ДНК 66
2.2.1.2 Оптимизация процесса амплификации в однолокусных и мультилокусной ПЦР 72
2.2.1.3 Изучение специфичности и чувствительности однолокусных и мультилокусной ПЦР 83
2.2.1.4 Конструирование контролей работы однолокусных и мультилокусной ПЦР-тест-систем 87
2.2.2 Разработка методики конкурентной ПЦР для количественной оценки содержания компонентов животного происхождения в составе мясного сырья, полуфабрикатов и готовых мясных изделий 105
2.2.2.1 Конструирование внутренних стандартов для постановки конкурентной ПЦР 107
2.2.2.2 Калибровка внутренних стандартов и определение точек эквивалентности для количественного определения ДНК крупного рогатого скота, свиней и кур методом конкурентной ПЦР 109
2.2.3 Изучение влияния технологической обработки мясного сырья на эффективность различных методов видовой идентификации 117
2.2.3.1 Влияние условий хранения мясного сырья на эффективность иммунологических и ПЦР методов видовой идентификации 119
2.2.3.2 Влияние термической обработки мясного сырья на эффективность иммунологических и ПЦР методов видовой идентификации 125
2.2.4 Обсуждение результатов исследования 132
3. Выводы 162
4. Практические предложения 163
5. Список литературы
- Основные положения об идентификации и фальсификации пищевого сырья и готовой продукции
- Сущность полимеразной цепной реакции (ПЦР)
- Методы выделения ДНК из проб исследуемого материала
- Разработка методики конкурентной ПЦР для количественной оценки содержания компонентов животного происхождения в составе мясного сырья, полуфабрикатов и готовых мясных изделий
Введение к работе
Актуальность темы диссертации. Формирование в России рыночных условий развития общества, резкое увеличение объема частного производства и свободной торговли продовольственными товарами, в том числе мясным сырьем, полуфабрикатами и готовыми мясными продуктами, предопределяют возможность различной их фальсификации по структуре и видовой принадлежности сырьевых составляющих. По экономическим соображениям чаще всего фальсифицируют малоценное мясное сырье, продукцию второго и третьего сортов, реализуя их как продукцию высокого качества.
В последние годы на рынках и торговых предприятиях нашей страны заметно увеличился сбыт фальсифицированных продовольственных, в том числе мясных товаров как отечественного, так и импортного производства. Принятые в России законы «О ветеринарии» (14.05.93), «О защите прав потребителя» (05.12.95), «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» (30.03.99), «О качестве и безопасности пищевых продуктов» (02.01.02), направленные на строгое соблюдение определенных требований к сырью и продукции, еще не обеспечивают полного исключения фальсификации различных продуктов.
Показатели качества и безопасности сырья и продуктов животного происхождения, определяемые в Системе обязательной сертификации ГОСТ Р, представлены в Санитарных правилах и нормах (СанПиН 2.3.2. 1078-01). По данным ряда исследований, мясные продукты, не отвечающие требованиям Правил ветсанэкспертизы, ГОСТ и других нормативных документов, составляют в отдельных торговых предприятиях и на рынках до 12-35% от числа всех проверенных партий. Имеются случаи реализации фальсифицированных продуктов, сопровождавшихся ветеринарными документами и сертификатами соответствия, указывающими на их подлинное происхождение и проведенный лабораторный контроль качества.
В настоящее время особенно остро стоит вопрос о необходимости более достоверного определения, как видовой принадлежности блочного мясного сырья, так и состава мясных мелкоизмельченных продуктов. Это обусловлено тем, что из-за фальсификации мясного сырья по видовому составу не только
5 изменяются потребительские свойства готовых изделий, но и возникает опасность для здоровья потребителей.
Наибольшего беспокойства у ветеринарных специалистов вызывают возможные подмены в продуктах мясного сырья мясом животных, пораженных прионами или вирусами, создающими большой риск в эпизоотическом и эпидемическом отношениях (губкообразные энцефалопатии, африканская чума свиней, ящур и другие), а также мясом, импорт которого в нашу страну по каким-либо причинам запрещен. Кроме того, фальсификация видовой принадлежности мясного сырья в *многокомпонентных мясных продуктах может нанести большой моральный вред той категории потребителей, национальные или религиозные воззрения которых не позволяют употреблять мясо отдельных видов скота и птицы.
Известно, что используемые в настоящее время методы органолептического, физико-химического и микробиологического контроля дают возможность надежно определить свежесть и безопасность в инфекционном отношении мясного сырья и готовых мясных изделий. Но с их помощью нельзя установить видовой состав мяса в продуктах, особенно если количество видоизмененной мышечной ткани незначительное по отношению к основному сырью.
Выявление различных фальсификаций с помощью таких иммунологических методов исследования, как РА, РП, РИД и ИФА, не всегда достигает цели, так как эти методы не позволяют надежно выявить наличие подложного мяса, содержащегося в количестве менее 10-20% от общей массы продукта. Более того, указанные методы практически не пригодны для исследования мясного сырья близкородствешшх видов животных и мясных продуктов, прошедших термическую обработку выше 48-57С.
Помимо идентификации сырьевых составляющих мясных полуфабрикатов и готовых мясных изделий существует необходимость количественной оценки процентного соотношения мясных фальсифицирующих примесей к основному мясному сырью, а также дифференцирование умышленно произведенного подлога от технически неизбежной контаминации пищевого сырья, возникающей в процессе технологической обработки мяса.
Достаточно точными и надежными методами исследования мясного сырья, позволяющими провести количественный анализ исследуемых компонентов продукта, оказались некоторые варианты иммуноферментного анализа (ELISA). Однако термическая обработка продуктов при 80С в течение 30 мин, при 100С - 20 мин, или 121С - 10 мин, отрицательно влияет на чувствительность и специфичность данного метода и не позволяет выявлять в образцах примеси отдельных видов мяса в количестве менее 20%. Кроме того, с помощью ELISA оказалось невозможным дифференцировать мясо близкородственных видов животных и птицы, что снижает надежность применения данного метода (54).
Наиболее перспективными для определения видовой принадлежности тканей животного происхождения в составе мясного сырья и продуктов, в том числе подвергшихся термической обработке, являются методы ДНК-диагностики и, в особенности, метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). По сравнению с традиционными способами видовой детекции, установление видовой принадлежности мяса при помощи ПЦР отличается универсальностью, более глубоким уровнем видовой дифференциации, высокой воспроизводимостью и возможностью количественного анализа.
В последнее время метод ПЦР находит практическое применение при диагностике инфекционных заболеваний человека и животных, генотипировании различных микроорганизмов и вирусов, оценке их вирулентности и определении устойчивости к антибиотикам, генодиагностике и генетической дактилоскопии, пренатальной диагностике и биологическом контроле препаратов крови (13,16,28, 32, 40,41,161).
В настоящее время предложены всевозможные модификации ПЦР, разрабатываются новые амплификационные технологии, основанные на репликации как ДНК-, так и РНК-фрагментов. Несмотря на то, что использование метода полимеразной цепной реакции для видовой идентификации тканей животного и растительного происхождения получило высокую оценку зарубежных специалистов, в нашей стране это направление не нашло еще широкого практического применения в области ветеринарно-санитарной экспертизы. Для решения этой проблемы необходима разработка
7 эффективных и адаптированных к различным объектам исследований ПЦР-тест-систем качественного и количесівенного анализов видового состава мясного сырья и готовых мясных продуктов.
Цель и задачи исследований. Целью исследований являлась разработка ПЦР-тест-систем для видовой идентификации и количественной оценки измельченного мясного сырья в сосгаве мясных полуфабрикатов и готовых мясных изделий.
В задачи исследований входило:
конструирование видоспецифичных праймеров для идентификации ДНК крупного рогатого скота, свиньи и курицы методом ПЦР и определение наиболее эффективной методики выделения ДНК из мясного сырья и готовых продуктов;
оптимизация процесса амплификации по температурному и временному профилям реакции;
изучение специфичности и чувствительноста разработанных однолокусных и мультилокусной ШДР-тест-сисгем;
создание контролей ложноположительных и ложноотрицательных результатов разработанных ПЦР-тест-систем;
разработка внутренних стандартов для количественного определения ДНК крупного рогатого скота, свиньи и курицы методом конкурентной ПЦР;
калибровка внутренних стандартов и определение точек эквивалентности для количественной оценки ДНК исследуемых видов животных методом конкурентной ПЦР;
сравнительный анализ влияния условий хранения и термической обработки мясного сырья на эффективность иммунологических и ПЦР-методов видовой идентификации.
Основные положения об идентификации и фальсификации пищевого сырья и готовой продукции
В соответствии со статьей 14 Закона Российской Федерации «О качестве и безопасности пищевых продуктов» (от 01.12.99), в целях определения приоритетных направлений государственной политики в области обеспечения качества и безопасности пищевых продуктов, охраны здоровья населения, а также в целях разработки мер по предотвращению поступления на потребительский рынок некачественных и опасных пищевых продуктов органами государственного надзора и контроля проводится мониторинг качества и безопасности пищевых продуктов (39).
Известно, что в обеспечении государственного надзора и контроля качества и безопасности продуктов животного и растительного происхождения принимают участие органы государственной ветеринарной службы. В их полномочия входит проведение обязательной ветеринарно-санитарной экспертизы мяса, мясных и других продуктов убоя животных, а также иных продуктов животноводства с целью определения их пригодности к использованию на пищевые цели.
Ветеринарно-санитарная экспертиза представляет собой совокупность мероприятий, позволяющих дать обоснованные ветеринарно-санитарные оценки (20). Согласно Информационного письма № 01-15/18416 от 1 сентября 1998 г. Государственного таможенного комитета РФ «О видах экспертиз, проводимых таможенными лабораториями, и перечне типовых вопросов, задаваемых эксперту», основополагающей является идентификационная экспертиза (29, 38, 56).
В соответствии с целями идентификационной экспертизы товара идентификацию подразделяют на потребительскую, товарно-партионную, ассортиментную (видовую), качественную, сортовую и специальную и осуществляют при помощи органолептических, измерительных и тестовых методов (53).
Параллельно с идентификационной экспертизой товара проводится экспертиза на его подлинность, целью которой является установление соответствия данного изделия ряду специфических показателей, отличающих данный продукт от других. Получение отрицательного результата при установлении подлинности товара свидетельствует о его подделке. Подделка, выполненная с корыстной целью, именуется фальсификацией и является основной причиной ухудшения тех или иных потребительских свойств продукта (2, 29, 178).
При фальсификации продовольственных товаров подделке подлинности обычно подвергаются одна или несколько характеристик товара. Исходя из этого, различают ассортиментный (видовой), качественный, количественный, стоимостный, информационный и комплексный виды фальсификации, каждый из которых имеет свои характерные способы подделки подлинности товаров (38).
В настоящее время наиболее распространенной и, в то же время, наиболее сложной для выявления является ассортиментная фальсификация, осуществляющаяся путем полной подмены истинного продукта его заменителями другого сорта, вида или наименования с сохранением сходства одного или нескольких признаков (53).
Отрицательное влияние фальсификаций продовольственных товаров нельзя недооценивать, так как помимо экономических потерь, оно вызывает целый спектр отрицательных физиологических и моральных последствий, как на отдельного потребителя, так и на общество в целом. Результатами таких последствий являются утрата здоровья, снижение продолжительности жизни и увеличение смертности от болезней и пищевых отравлений, ухудшение структуры питания за счет повышения удельного веса низкокачественных и малоценных продуктов (175).
Таким образом, разработка эффективных способов идентификации и обнаружения фальсификаций сырья и продуктов животного и растительного происхождения имеет первоочередное значение в списке мероприятий, направленных на достижение безопасности и качества выпускаемой и реализуемой пищевой продукции (40,45).
По мнению ряда авторов, мясом называют совокупность тканей, получаемых при убое животного (птицы) и отделении несъедобных частей туши (шкуры, рогов, копыт, перьев и т.п.) (20). Мясо является существенным источником животных белков, жиров, минеральных и экстрактивных веществ, которые представлены в нем в оптимальном количественном и качественном соотношении и легко усваиваются организмом (44). Мясо и продукты его переработки - колбасные изделия, мясокопчености, консервы, полуфабрикаты -относятся к наиболее ценным продуктам питания, но они попадают в разряд наиболее часто фальсифицируемых пищевых товаров (21,51).
Мясо идентифицируют по виду, полу, возрасту, упитанности и термическому состоянию (53). Фальсификация по видовому составу является наиболее распространенным видом подлогов, предпринимаемых по отношению к мясному сырью и готовым мясным продуктам. В зависимости от вида убойного животного различают: говядину, свинину, баранину, козлятину, конину, оленину, мясо кроликов, сухопутной и водоплавающей домашней птицы. Помимо этого в нашей стране разрешается использовать в пищу мясо диких животных: лося, косули, дикого северного оленя, пятнистого оленя, благородного оленя (марал, изюбр и др.), кабарги, сайгака, серны, козерога, дикого барана, кабана, медведя, барсука, зайца, дикого кролика, бобра, а также пернатой дичи. Из пернатой дичи первостепенное значение имеет отряд куриных (семейство тетеревиных и фазановых), объединяющий более 20 видов, а также водоплавающая дичь (30).
Видовая идентификация мяса и мясной продукции приобретает все большее значение в связи с увеличением объема международной торговли и введением во многих странах мира правил маркировки (159). Для идентификации свежего и необработанного мяса используются морфологические и анатомические характеристики (10, 14, 46). Однако в обработанном виде мясо утрачивает характерные морфологические черты, необходимые для идентификации вида (49), что создает благоприятные условия для фальсификации видовой принадлежности мясопродуктов. Такой вид подделки относится к ассортиментной фальсификации мяса, достигающейся за счет подмены одного вида мяса другим, менее ценным (29).
Сущность полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это селективная амплификация (многократное воспроизведение) целевого фрагмента ДНК in vitro (356). ПЦР была разработана Мюллисом К. (фирма "Cetus", США) в 1983 году, за что в 1995 году автор был удостоен Нобелевской премии. Метод ПЦР основан на уникальной способности ДНК к самовоспроизведению - репликации, включающей расплетение двойной спирали ДНК, расхождение ее нитей и достраивание на них дочерних цепей ДНК по принципу комплементарности (48).
Механизм репликации таков, что синтез новых нитей может начаться не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках - коротких двунитевых участках. Суть метода ПЦР заключается в том, что, маркировав такими блоками (синтезированными искусственным путем), специфический участок ДНК, можно добиться синтеза дочерних цепей только в этом конкретном участке, а не по всей длине нитей ДНК. В результате происходит увеличение количества копий специфического фрагмента приблизительно по формуле 2", где п - число циклов амплификации (100). Такая высокая степень направленного обогащения позволяет в значительной степени улучшить чувствительность анализа, что дает возможность проводить индикацию единичных клеток в исследуемой пробе (4).
Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют две олигонуклеотидные затравки, называемые праймерами. Праймеры комплементарны участкам матричной ДНК, между которыми находится последовательность-мишень, и ориентированы таким образом, что синтез протекает только между ними, обеспечивая удвоение искомого фрагмента (23).
Праймеры входят в состав синтезирующейся последовательности - ампликона, размер которого, таким образом, определяется числом нуклеотидных пар между 5 -концами праймеров. Как правило, длина ампликона составляет несколько сотен нуклеотидных пар, а длина праймеров - 16-30 оснований (4).
ПЦР-анализ, согласно общепринятой схеме, состоит из трех основных процедур: подготовка пробы исследуемого материала, которая в большинстве случаев сводится к изоляции ДНК и ее очистке; амплификация (собственно ПЦР) и детекция продуктов реакции (23, 90, 100, 110).
Ключевым этапом ПЦР является амплификация - направленная репликация фрагмента ДНК. Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов: денатурации, отжига и элонгации (синтеза). Многократное (циклическое) повторение этих трех стадий приводит к обогащению реакционной смеси молекулами ДНК-мишени, поскольку в каждом новом цикле в качестве матрицы выступает не только исходная, но и вновь синтезированная ДНК (4, 23, 100). Протекание ПЦР, т.е. переход от стадии к стадии и от цикла к циклу регулируется изменением температуры рабочей смеси (90, 110).
По окончании этапа элонгации первого цикла, посредством прогрева рабочей смеси, осуществляется переход к этапу денатурации второго цикла и так далее. Длина ампликонов, начиная с 3-го цикла, становится стандартной, то есть соответствует числу пар нуклеотидов фрагмента ДНК-матрицы между 3 -концами смыслового и антисмыслового праймеров (8, 23).
Количество циклов амплификации зависит от содержания искомых фрагментов ДНК в исследуемой пробе и обычно составляет 15-45. Проведение более 40 циклов ПЦР нежелательно, так как, с одной стороны, это приводит к частичной инактивации полимеразы и истощению компонентов реакции, а с другой стороны, - к наработке продуктов неспецифической амплификации (90).
Техническое обеспечение смены температурных режимов при постановке ПЦР первоначально было представлено набором водяных бань с различной температурой воды или масла (4). В настоящее время для создания требующихся условий амплификации в основном используются специальные приборы -термоциклеры (амплификаторы), которые способны изменять температуру автоматически на основе заданной программы (8, 36, 90).
Заключительным этапом ДНК-анализа на основе ПЦР является детекция продуктов амплификации, которая в подавляющем большинстве случаев осуществляется электрофоретическим разделением ПЦР-смеси на окрашенном бромистом этидием агарозном или полиакриламидном гелях. Бромистый этидий образует с фрагментами ДНК устойчивое соединение внедрения, проявляющееся в виде светящихся полос при облучении геля УФ-излучением с длиной волны 290-330 нм (22, 33, 100).
Специфичность полосы амплифицированной ДНК подтверждается ее положением (размерами) по отношению к маркерным фрагментам и ДНК-стандарту. Дополнительные доказательства специфичности ампликонов получают путем расщепления их рестриктазами или гибридизации со специфическими радиоактивным или флуоресцентным олигонуклеотидным зондами. Высоконадежным методом доказательства специфичности ДНК является также прямое секвенирование последовательности ампликона, но такая технология достаточно дорогостоящая и применяется в основном для идентификации точечных мутаций генов (23).
Перспективность использования полимеразной цепной реакции в качестве диагностического теста объясняется рядом преимуществ, которыми обладает данный метод. К таким преимуществам, в первую очередь, относятся высокие показатели специфичности и чувствительности ПЦР (17, 31, 167); во-вторых -универсальность и быстрота получения результатов ПЦР-анализа, а также возможность его автоматизации (4, 45); в-третьих - возможность прямой детекции клеток возбудителей или тканей животных в исследуемом материале и высокая эффективность ПЦР-диагностики, как острых, так и латентных форм инфекции (13, 16, 22, 32).
Методы выделения ДНК из проб исследуемого материала
Перед проведением процедуры выделения ДНК, независимо от метода экстракции, осуществляли первичную обработку проб исследуемого материла. При анализе мягких материалов, легко поддающихся измельчению (мясо и мясные полуфабрикаты, фарши, колбасные и консервные изделия и пр.), отбирали усредненную пробу продукта массой 1г, измельчали при помощи стерильных скальпеля, ножниц и одноразового шпателя и гомогенизировали фарфоровым пестиком в керамической ступке, тщательно перемешивая содержимое. После этого измельченную и гомогенизированную пробу переносили в чистую пробирку типа «Эппендорф» в количестве приблизительно 100-150 мкл по объему. Пробы сухих сыпучих материалов (кормовая мука, яичный порошок и пр.) и жидких или полужидких материалов (молоко, молочные изделия, мясное пюре и пр.), не требующих измельчения и однородных по составу, при помощи одноразового шпателя или пипетированием вносили в чистую пробирку типа «Эппендорф» в количестве 100-150 мкл по насыпному объему (5-7 мм от дна пробирки). Для предотвращения перекрестной контаминации инструменты для измельчения материала использовали однократно, тщательно мыли и стерилизовали после использования или при переходе от пробы к пробе.
Метод фенольной экстракции ДНК. Для проведения фенольной экстракции ДНК использовали следующие реагенты: - Буфер для экстракции (151): 0,1 М NaCl; 0,1 М Tris-HCl (рН 8,0); 5 mM EDTA; 1,0% SDS; - Фенол, нейтрализованный 0.5 М Tris-HCl (рН 8,0); - Хлороформ; - Хлорид лития 10 М; - Буфер ТЕ (рН 8,0). Протокол фенольной экстракции (34): 1. Приготовление рабочих растворов ТЕ, Tris НС1, EDTA, фенола и хлороформа осуществляли по методикам, описанным Маниатисом Т. с соавт. (1994)(34). 2. В пробирку с исследуемым образцом добавляли 1000 мкл буфера для экстракции. Перемешивали содержимое при помощи гомогенизатора Поттера до полного смачивания пробы. 3. Инкубировали пробирку с пробой в твердотельном термостате «ТЕРМО 24-15» («Биоком») 45 мин при 65С. 4. В пробирку вносили 400 мкл хлороформа и эмульгировали содержимое вручную, переворачивая пробирку в течение 5 мин. 5. Центрифугировали пробирку 5 мин. при 10 тыс. об./мин при помощи центрифуги «ТЭТА 10» («Биоком»), полученную верхнюю водную фазу переносили в чистый «Эппендорф». 6. Добавляли к надосадку равный объем фенола и эмульгировали содержимое вручную, переворачивая пробирку в течение 5 мин. 7. Центрифугировали пробирку 5 мин. при 10 тыс. об./мин, полученную верхнюю водную фазу переносили в чистый «Эппендорф». 8. Добавляли к надосадку ХА объема фенола и Vi объема хлороформа и эмульгировали содержимое вручную, переворачивая пробирку в течение 5 мин. 9. Центрифугировали пробирку 5 мин. при 10 тыс. об./мин, полученную верхнюю водную фазу переносили в чистый «Эппендорф». 10. Добавляли к надосадку равный объем хлороформа и эмульгировали содержимое вручную, переворачивая пробирку в течение 10 мин. 11. Центрифугировали пробирку 5 мин. при 10 тыс. об./мин, полученную верхнюю водную фазу переносили в чистый «Эппендорф». 12. Повторяли действия, описанные в пп. 10-11. 13. Добавляли к надосадку /ю объема хлорида лития и 2 объема 96%-го этилового спирта, аккуратно перемешивая содержимое переворачиванием пробирки. 14. Помещали пробирку в морозильную камеру (- 20С) до выпадения осадка (30-40 мин.), после чего центрифугировали пробирку 1-2 мин. при 10 тыс. об./мин. 15. Удаляли супернатант, а осадок ДНК в пробирке просушивали в термостате при 65С до полного высыхания. 16. Растворяли осадок ДНК, добавляя 50-200 мкл буфера ТЕ, в течение ночи при комнатной температуре.
Метод щелочной экстракции ДНК. Для проведения щелочной экстракции ДНК использовали следующие реагенты: - Буфер для экстракции (146): 0,5 М NaOH; 0,01 М EDTA; - Фенол, нейтрализованный 0.5 М Tris-HCl (рН 8,0); - Хлороформ; - Хлорид лития 10 М; - Буфер ТЕ (рН 8,0). Протокол щелочной экстракции (138): 1. Приготовление рабочих растворов ТЕ, фенола и хлороформа осуществляли по методикам, описанным Маниатисом Т. с соавт. (34). 2. В пробирку с исследуемым образцом вносили 1000 мкл буфера для щелочной экстракции. Перемешивали содержимое при помощи гомогенизатора Поттера до полного смачивания пробы. 3. Инкубировали пробирку с пробой в твердотельном термостате 7 мин при 100С. 4. Осуществляли фенольную депротеинизацию ДНК согласно пп. 4-16 протокола фенольной экстракции ДНК.
Разработка методики конкурентной ПЦР для количественной оценки содержания компонентов животного происхождения в составе мясного сырья, полуфабрикатов и готовых мясных изделий
Большинство используемых в настоящее время методов определения видовой принадлежности тканей животного происхождения представляют собой методы качественного анализа, то есть позволяющие с той или иной эффективностью установить видовой состав анализируемого продукта. При этом практически невозможно осуществить определение количества исследуемой мясной примеси (50, 54). В связи с необходимостью установления процентного соотношения мясных фальсифицирующих примесей к основному мясному сырью, а также с целью дифференцирования умышленно произведенного подлога от технически неизбежной контаминации пищевого сырья, возникающей в процессе технологической обработки мяса, требуется количественная оценка сырьевых составляющих исследуемого продукта.
Вследствие большого практического интереса к проблеме фальсификации мясного мелкоизмельченного сырья, мясных полуфабрикатов и многокомпонентных мясных продуктов, в последние годы зарубежными и отечественными специалистами разрабатывался целый ряд подходов и методов осуществления количественной оценки содержания компонентов животного происхождения. Большинство существующих способов количественной идентификации базируется на анализе видоспецифичных белков (54). Однако основными недостатками указанных методов являются низкие показатели их чувствительности и специфичности (72, 81, 101, 119, 124, 142, 166). Наиболее эффективными методами, превосходящими по своим показателям такие современные иммунологические тесты как ИФА и его твердофазный вариант ELISA, в настоящее время признаны методы ДНК-диагностики, среди которых более значимым считается метод полимеразной цепной реакции (175).
Попытки применения универсальной методики постановки ПЦР оказались малопригодными для количественной оценки компонентов исследуемого материала (72, 77). Причиной недостоверных результатов являлось отсутствие прямой зависимости количества образующихся в ходе ПЦР ампликонов от исходного количества ДНК-матрицы, обусловленное фазой плато ПЦР (170). Подобрать же такие условия амплификации, при которых достаточное для детекции количество ампликонов нарабатывалось бы только в ходе экспоненциальной фазы ПЦР до ее перехода в фазу плато ПЦР было практически невозможным (77).
Успешная реализация количественного ПЦР-анализа оказалась возможной после разработки ПЦР-методик, осуществляемых в режиме «реального времени» (realime PCR) и характеризующихся использованием красителей, обеспечивающих флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦР-продукта (154, 180). К главным преимуществам метода realime PCR относятся возможность достоверной количественной оценки, отсутствие необходимости детекции ПЦР-продуктов после амплификации и, как следствие, снижение риска контаминации образцов. Однако дороговизна оборудования и флуоресцентных зондов для ПЦР в «реальном времени» ограничивает возможности использования указанных технологий в условиях лабораторий ветсанэкспертизы.
В 1989 году Wang A.M. с соавт. разработали оригинальную модель количественной оценки копий ДНК методом, так называемой, конкурентной ПЦР, основанной на коамплификации ДНК исследуемого организма и количественно охарактеризованного внутреннего стандарта (конкурента) (176). Внутренний стандарт представляет собой фрагмент ДНК, отличающийся от амплифицируемой последовательности ДНК-матрицы по размеру и/или структуре, но содержит идентичные с ней сайты праймирования.
Такая конструкция внутреннего стандарта позволяет определить концентрацию исследуемой ДНК, так как при совместной амплификации с ДНК-мишенью возникает их конкуренция за праймеры и другие компоненты ПЦР-смеси. В случае, если начальные концентрации выявляемой ДНК и внутреннего стандарта эквивалентны, количество образующихся ПЦР-продуктов будет равным. Поскольку в пробу вносится известное количество конкурента, то, установив точку эквивалентности, можно оценить количество исследуемой ДНК-матрицы, содержащейся в реакционной смеси.
Метод конкурентной ПЦР был успешно апробирован специалистами, занимающимися проблемой количественного анализа ДНК бактериального (72), вирусного (62), растительного (77) и животного (183) происхождения. Тем не менее, методики количественной оценки видового состава тканей животного происхождения и установления процентного соотношения фальсифицирующих мясных примесей в составе мелкоизмельченного мясного сырья и многокомпонентных мясных продуктов в настоящее время отсутствуют.
В связи с этим, перед нами была поставлена задача разработать эффективную методику количественного определения ДНК крупного рогатого скота, свиней и кур в составе мясного сырья и готовых мясных изделий методом конкурентной ПЦР.
