Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1. Проблема определения видовой принадлежности мясных ингридиентов 10
2. Молекулярные методы определения видовой принадлежности мясных ингредиентов в кормах 12
3. Принцип полимеразной цепной реакции 14
4. Подбор праймеров 15
4.1. Дизайн праймеров 15
4.2. Температура отжига. 16
4.3. Длина праймеров. 16
4.4. Вырождение праймеры 17
5. Факторы воздействующие на ПЦР 18
5.1. Температура и время денатурации 18
5.2. Температура и время элонгации 19
5.3. Реакционный буфер 19
5.4. Количество циклов амплификации 20
5.5. «Горячий старт» ПЦР. 20
5.6. Контаминация в ПЦР и предложения по обустройству ПЦР-лаборатории 21
5.8. Внутренний контрольный образец (ВКО) 23
ЧАСТЬ 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 25
ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 25
1. Базы данных нуклеотидных последовательностей ДНК и компьютерные программы для обработки этих данных 25
2. Образцы-сравнения ДНК. 25
2.1. Коммерческие препараты ДНК. 25
2.2. Самостоятельно полученные образцы ДНК из цельной крови животных 26
3. Образцы кукурузной, куриной, рыбной и мясокостной муки 26
3.1. Отбор образцов 26
3.2. Приготовление смесей 26
3.3. Перечень видов смесей кормовой муки 26
4. Образцы сухого и консервированного корма для животных 27
5. Образец сыворотки лошадей 27
6. Методика выделения ДНК из цельной крови по maniatis (94) 27
6.1. Выборочный лизис эритроцитов: 27
6.2. Обработка лейкоцитарного осадка протеиназой К. 28
6.3. Экстракция ДНК фенол-хлороформом с последующей преципитацией этанолом 28
7. Оценка концентрации Днк спектрофотометрическим методом (94) 29
8. Методика выделения Днк сорбцией на селикагеле по boom (24) 29
9. Методика проведения реакции амплификации 30
9.1. Состав реакционной смеси, условия амплификации 30
9.2. «Горячий старт» 30
10. Методика проведения электрофореза в агарозном геле 31
11. Методика определения говядины в образцах методом ифа 31
ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 32
1. Выбор олигонуклеотидных праимеров для дифференциальной амплификации ДНК говядины и баранины 32
2. Изучение специфичности выбранных праимеров 32
3. Подбор условий ПЦР 33
3.1. Оптимизация температуры отжига специфических олигонуклеотидов (праимеров) 33
3.2. Подбор концентрации праимеров 34
3.3. Применение «горячего старта» 35
4. Определение чувствительности и специфичности выбранной системы амплификации 35
5. Подбор методов выделения (очистки) ДНК из муки 36
6. Внутренний контрольный образец (BKO) 38
7. Отрицательные и положительные контрольные образцы 39
8. Состав разработанной тест-системы 40
9. Определение чувствительности и специфичности разработанной тест-системы 41
10. Сравнение чувствительности методов ПЦР и ифа 42
11. Комиссионные испытания пцр-тест-системы «биг» 43
12. Изучение активности и стабильности пцр-тест-системы в зависимости от срока хранения 44
13. Эпизоотическая статистика при тестировании кормов на днк жвачных животных методом ПЦР в России 45
ОБСУЖДЕНИЕ 46
ВЫВОДЫ 52
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 53
РИСУНКИ 54
ТАБЛИЦЫ 67
ЛИТЕРАТУРА 79
ПРИЛОЖЕНИЯ 93
- Молекулярные методы определения видовой принадлежности мясных ингредиентов в кормах
- Методика выделения Днк сорбцией на селикагеле по boom (24)
- Состав разработанной тест-системы
Введение к работе
Актуальность проблемы
Ветеринарная служба, защищая потребителя от фальсификации мясной продукции, постоянно проводит видовую дифференциацию мяса в продуктах питания и кормах, подвергавшихся термической обработке. Значение этих мероприятий в последние годы особенно возросло в связи с открытием новых видов прионных болезней сельскохозяйственных и домашних животных, относящихся к группе трансмиссивных губкообразных энцефалопатии (ГЭ) (10).
Губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота (ГЭ КРС) впервые выявлена в Великобритании в ноябре 1986 года (148). По данным международного эпизоотического бюро за 1989-2002 годы в мире зарегистрировано 3611 случаев ГЭ КРС, и более 177 000 случаев в Великобритании. В 2000-2001 годах отмечен рост случаев ГЭ КРС во Франции (134), Ирландии, а в 2001-2002 годах в Бельгии, Германии, Нидерландах, Испании, Италии, Португалии отмечено от нескольких десятков до сотен случаев в год. В 2003 году в мире зарегистрировано 777 случаев ГЭ КРС и 425 случаев в Великобритании.
Основной источник заражения ГЭ - мясокостная мука, полученная из жвачных животных. В Великобритании в начале 80-х годов были изменены режимы переработки сырья животного происхождения при производстве мясокостной муки, которые не обеспечивали инактивацию возбудителя болезни (3).
С 1996 г. во всех странах Европейского Союза (ЕС) ввели запрет на скармливание жвачным животным мясокостной муки, приготовленной из млекопитающих. Однако из-за незаконного сбыта мясокостной муки в страны, не являющиеся членами ЕС, и фальсификации рыбной муки добавками протеинов млекопитающих по экономическим причинам риск заражения достаточно велик. В связи с открытием в последние годы ГЭ кошек в группу риска попали и корма для домашних животных (25).
Таким образом, определение видовой принадлежности мясных ингредиентов в составе кормов актуально. Однако такие методы как иммунодиффузия в геле, изоэлектрическое фокусирование, иммуноферментный анализ (ИФА), реакция кольцеприципитации (КП) применяемые для видовой идентификации сырого мяса не эффективны, т.к. термическая обработка приводит к денатурации белков и потере ими видовой специфичности (62).
В отличие от белков ДНК более устойчива к термической обработке и не утрачивает своей информативной функции. Поэтому применение молекулярно-генетических методов, в частности полимеразной цепной реакции (ПЦР) является перспективным для определения видовой принадлежности ДНК в составе продуктов и кормов подвергавшихся термической обработке.
Цель и задачи исследования Цель исследования — разработать тест-систему для определения видовой принадлежности мясных ингредиентов в кормах методом полимеразной цепной реакции.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Сконструировать олигонуклеотидные праймеры и разработать оптимальные параметры ПЦР для идентификации и дифференциации ДНК говядины и баранины в кормах.
2. Оценить эффективность различных способов выделения ДНК из кормов (рыбная и мясная мука), комбикормов для крупного, мелкого рогатого скота и птицы, сухих и консервированных кормов для домашних животных (собак, кошек).
3. Сравнить чувствительность и специфичность разработанной ПЦР-тест-системы с ИФА-набором фирмы Cortecs Diagnostics Limited (Великобритания).
4. Определить эффективность ПЦР-тест-системы для определения видовой принадлежности тканей жвачных животных методом ПЦР при тестировании кормов, поступающих по импорту в Россию.
Научная новизна работы Впервые сконструированы олигонуклеотидные праймеры для дифференциальной амплификации специфических последовательностей ДНК жвачных животных (крупного и мелкого рогатого скота) в варианте мультиплексной ПЦР, на основе которых разработана тест-система, обладающая 100% специфичностью с пределом аналитической чувствительности 0,1% примеси мясокостной муки жвачных в исследуемом материале или 10 пг ДНК жвачных в пробе ПЦР.
Установлено, что универсальным методом пробоподготовки корма является протеиназная обработка с последующей сорбцией ДНК на силикагеле в присутствии высокой концентрации солей гуанидина. Данный метод пробоподготовки исследуемого материала обеспечивает высокую чувствительность тест-системы.
Создан внутренний контрольный образец с оптимальной концентрацией 1 пг в ПЦР-пробе, который добавляется на этапе выделения ДНК и полностью исключает ошибки исследователя при постановке реакции.
Разработаны положительные контрольные образцы ДНК bovis и ДНК ovis, являющиеся индикатором работы амплификационной смеси и маркером длины ПЦР-продуктов (680 и 350 п.н. соответственно).
Практическое значение работы
Разработана и впервые внедрена в ветеринарную практику тест-система «БИГ» для определения видовой принадлежности тканей жвачных животных методом полимеразной цепной реакции.
Установлено, что ПЦР-анализ для выявления тканей жвачных животных в кормах, значительно превосходит по чувствительности и специфичности традиционные методы (ИФА и реакция КП) и позволяет дифференцировать ДНК крупного и мелкого рогатого скота в варианте мультиплексной ПЦР.
Внедрение в систему государственного контроля ПЦР-тест-системы «БИГ» с декабря 2000 года по январь 2004 года позволило снизить фальсификацию рыбной муки и кормов тканями жвачных животных с 30,3% до 6,1%, что имеет важное эпизоотологическое и эпидемиологическое значение.
Результаты проведенных исследований вошли в следующие разработанные нормативные документы:
1. Наставление по применению тест-системы «БИГ» для определения видовой принадлежности тканей жвачных животных методом полимеразной цепной реакции (№ 13-5-02/0161);
2. Технические условия тест-система «БИГ» для определения видовой принадлежности тканей жвачных животных методом полимеразной цепной реакции (ТУ № 9388-029-00494189-01).
Апробация диссертации
По теме диссертации опубликовано 4 научных статьи.
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ФГУ ВГНКИ 1999-2003 гг.
Материалы диссертации доложены на 3-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика в современной медицине» (Москва, 2000 г.); на Всероссийской научной конференции «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов» (Москва, 2001 г.); на международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002 г.); на 4-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2002 г.); на научно-проблемных методических коммисиях ФГУ ВГНКИ (1999-2003 гг.).
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена 104 страницах компьютерного текста, и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов исследований, выводы, практические предложения и указатель литературы (всего 162 источника, в том числе 148 иностранных). Диссертация иллюстрирована 13 рисунками и 9 таблицами. Прилагаются разработанные нормативные и другие документы, подтверждающие результаты исследований, их научно-практическую ценность.
Молекулярные методы определения видовой принадлежности мясных ингредиентов в кормах
Определение видовой принадлежности тканей в кормах проводят при помощи идентификации белков или ДНК (23, 100). Для выявления белков используют серологические тесты: РИД в агарозном геле (54), изоэлектрическое фокусирование в ПААГ (67), ИФА (23). Они основаны на взаимодействии антиген-антитело с последующим выявлением образовавшегося комплекса (6). Успешность анализа зависит от специфичности этого взаимодействия. В процессе денатурации, например, в результате термической обработки, белки теряют свою пространственную структуру. Антитела, полученные к нативным белкам не будут «узнавать» денатурировавшие белки, соответственно, анализ будет давать ложноотрицательные результаты. Действительно, иммунодиф фузия в геле, изоэлектрическое фокусирование, используемые для видовой идентификации сырого мяса малопригодны для определения видовой принадлежности животных белков в составе кормов и продуктов, подвергнутых термической обработке. Показано, что использование РИД не позволяет определять видовую принадлежность белка уже после термической обработки при температуре 80С в течение 30 минут (99).
Итак, чтобы повысить специфичность анализа кормов подвергавшихся термической обработке антигены должны быть не только видоспецифичны, но и термостабильны. Иначе денатурированные белки не будут узнаны антителами к ним. Наличие термостабильности выявлено (60, 101), например, у белков скелетных мышц (73, 96). Эти белки выбираются в качестве мишени в коммерческих ИФА-тест-системах. К сожалению, свойством термостабильности обладает лишь часть белков, что само по себе накладывает ограничения на чувствительность тест-систем.
Так, R.Meyer с соавт. показал, что применение ИФА позволяет выявлять видовую принадлежность мяса после термической обработки при 80С в течение 30 мин, при 100С — 20 мин или 121С — 10 мин. Однако чувствительность метода низка: метод не позволяет надежно выявлять свинину в смеси с говядиной при содержании ее менее 20% (99). Следует отметить, что метод выделения видоспецифического антигена при производстве иммунных сыворотко для ИФА (например, термоустойчивых гликопротеинов скелетных мышц животных) довольно сложен и включает многостадийное высаливание сульфатом аммония, диализ и последующую очистку белка ионообменной хроматографией на колонке с КМ-целлюлозой. В дальнейшем, для получения специфических антител проводят иммунизацию кроликов полученным антигеном. Из полученной сыворотки высаливанием сульфатом аммония выделяют IgG, проводят очистку иммуноглобулиновой фракции гельфильтрацией на колонке с Sephadex G200. Далее полученные антитела метят биотином (23). Низкая: чувствительность и довольно сложная технология получения специфических антител не позволяет оценивать метод ИФА как перспективный для решения задачи видовой идентификации белков в кормах, подвергавшихся термической обработке. В отличие от белков ДНК более устойчива к термической обработке, нуклеотидная последовательность не утрачивает своей информативной функции при денатурации. Поэтому такие методы как ДНК-гибридизация, рестрикционный анализ и, наконец, ПЦР являются перспективными для определения видовой принадлежности животных белков в составе продуктов и кормов подвергавшихся термической обработке (29, 69). Показано, что с помощью ПЦР можно выявлять 1% свинины, подвергнутой термической обработке при 120С в течение 10 мин, после 30 циклов амплификации и 0,1% - после 35 циклов амплификации (99). Для идентификации мяса близкородственных видов животных можно использовать ПЦР с последующим рестрикционным анализом ампликонов, так называемый ПЦР-ПДРФ анализ (34). Так, применение в качестве ПЦР праймеров комплиментарных фрагменту митохондриального цитохрома и различных эндонуклеаз для последующей рестрикции позволило типировать мясо таких близкородственных животных, как олень, косуля, лань, серна, американский лось, северный олень, кенгуру, южноафриканская газель и др. (100). Наиболее часто встречающейся проблемой при использовании ПЦР для идентификации мясных ингредиентов в составе продуктов питания и кормов является ингибирование реакции компонентами образца, например, протеиназами и детергентами, которые могут нейтрализовать активность ДНК-полимеразы (120). Для решения этой проблемы необходимо особенно тщательно подходить к разработке метода выделения ДНК из образца (24).
Методика выделения Днк сорбцией на селикагеле по boom (24)
Методика основана на лизисе исследуемого материла при помощи специального хаотропного агента (гуанидина тиоционата) и последующем связывании нуклеиновых кислот частицами силикагеля в присутствии этого агента.
Исследуемый материал обрабатывали лизирующим раствором (гуанидина тиоционат 5,2 М, Трис-НС1 10 мМ, ЭДТА 12,5 мМ, тритон Х-100 2%, рН=8,0). Соотношение исследуемого материала и лизирующего раствора подбиралось в работе. Добавляли 20 мкл ВКО, если его использовали в данном анализе. Пробу инкубировали при 65 С в течение 5 мин. Не растворившийся материал осаждали при 8000-10000 g 5 мин, супернатант переносили в новую пробирку. К супернатанту добавляли 20 мкл тщательно ресуспендированного сорбента, хорошо перемешивали на вортексе, давали отстояться в течение 2 минут, снова перемешивали и отстаивали еще 10-12 минут. Пробирки центрифугировали при 2000 g 1 мин, супернатант удаляли.
Осадок сорбента тщательно ресуспендировали (промывали) в растворе для отмывки 1 (гуанидина тиоцианат 4,0 М, трис-HCl 10 мМ, ЭДТА 12,5 мМ, тритон Х-100 0,5 %, рН=8,0), повторяли центрифугирование в прежнем режиме и удаляли супернатант. Далее осадок дважды промывали раствором для отмывки 2 (трис-НО 10 мМ, ЭДТА 1 мМ, хлорид натрия 5 мМ, спирт этиловый 50 %, рН=8,0), каждый раз осаждая сорбент при 8000 g 1 мин. Осадок сорбента высушивали при 65 С в течение 10 мин в твердотельном термостате, после чего элюировали ДНК с сорбента низкосолевым буфером (ТЕ-буфер). Для элюции осадок тщательно ресуспендировали в ТЕ, инкубировали при 65 С в течение 5 мин, периодически встряхивая. Сорбент осаждали при 8000-10000 g в течение 1 мин. Супернатант содержал ДНК.
Реакцию амплификации проводили в объеме 25 мкл в реакционном буфере следующего состава: каждого праймера (олигонуклетидной затравки) по 15-30 пмоль, каждого дНТФ по 0,2 мМ, 0,5 ед Taq-полимеразы, трис-НСІ 68 мМ, сульфата аммония 17 мМ, сульфата магния 3 мМ, твин-20 0,01 %, бычьего сывороточного альбумина 0,1 мг/мл. В качестве матрицы (ДНК-пробы) брали 10 мкл препарата ДНК. Чтобы избежать испарения, реакционную смесь сверху накрывали каплей минерального масла. Собственно реакцию проводили в термоциклере (амплификаторе) «Терцик» (ДНК-технология, Россия) с применением! функции активного точного регулирования температуры, по следующей программе: 95 С - 2 мин, 1 цикл; 95 С - 10 с, (56-64) С - 10 с, 72 С - 10 с, 40 циклов; 10 С - хранение. Отптимальную концентрацию праймеров и их температуру отжига подбирали в ходе работы.
В качестве модификации реакцию проводили с использованием «горячего старта», для чего реакционную смесь делили на две составляющих. Смесь, в которой находились праймеры и нуклеотиды, предварительно разливали на дно пробирок для амплификации, на смесь наслаивали 10—15 мкл расплавленного воска, так, чтобы он образовал пробку. Сверху восковой пробки разливали вторую реакционную смесь, минеральное масло и вносили ДНК-пробу. Пробирки с «собранной» по такой схеме реакционной смесью ставили в нагретый не менее чем до 80 С амплификатор. Для удобства работы с прибором использовали функцию «паузы».
Детекцию продуктов реакции амплификации проводили при помощи электрофореза в агарозном геле. Навеску агарозы массой 1,7-1,8 г помещали в термостойкую колбу, заливали 100 мл трис-боратного буфера (трис-(оксиметил)-аминометан 4,5 мМ, борная кислота 4,5 мМ, ЭДТА 1 мМ, этидия бромид 1 мкг/мл), доводили до кипения, остужали до 65-70 С и заливали в форму, так чтобы толщина геля была 5-6 см. На одном из концов геля с помощью специального приспособления («гребенки») формировали лунки. Застывший гель помещали в камеру для горизонтального электрофореза, расположив лунки ближе к отрицательному электроду, камеру заливали трис-боратным буфером, так чтобы он покрывал гель на 4-5 мм сверху. На дно лунок вносили по 12,5 мкл амплификата, подключали камеру к источнику тока, соблюдая полярность и проводили электрофорез при напряжении равном 10 В/см не менее 20 мин. Результаты электрофореза визуализировали облучением геля ультрафиолетовым светом на трансиллюминаторе «Биоком» (Россия) и документировали при помощи компьютерной видеосистемы "Gel Doc 1000" (BioRad, США).
На электрофореграммах проб, содержащих говяжьи (или бараньи) компоненты, должна быть отчетливо видна полоса амплифицированного участка ДНК длиной 680 п.н., соответствующая фрагменту генома митоходриального цитохрома b КРС или 350 п.н. овец. Если в исследуемых пробах присутствовали говядина и баранина, то на электрофореграмме наблюдали две специфические полосы ДНК, располагавшиеся на уровнях 350 и 680 п.н. Аналогично учитывали результаты амплификации ВКО.
Состав разработанной тест-системы
В связи с многоступенчатостью ПЦР-анализа необходимо контролировать каждую его стадию. Важной задачей является не только исключение ложноотрицательных, но и ложноположительных результатов. Для этого на этапе выделения ДНК использовали отрицательный контрольный образец (ОКО), а на этапе амплификации отрицательный контроль ПЦР («К-»).
ОКО служит для оценки возможной контаминации на этапе выделения ДНК. В качестве материала для отрицательного контрольного образца тест-системы мы выбрали на сыворотку лошадей. Препарат сыворотки лошади был тщательно протестирован с праймерами «БиГ» (рис. 9). Результаты теста показали отсутствие перекрестных реакций.
Отрицательный контроль ПЦР представляет собой реакционную смесь, в которой присутствуют все компоненты (праймеры, нуклеотиды, Taq-полимераза), за исключением ДНК-пробы и служит для контроля этапа амплификации. В нашей тест-системе в качестве «К-» использовали ТЕ-буфер для элюции ДНК с сорбента.
Контроль работы амплификационной смеси и работы амплификаторов осуществляли с помощью положительных контрольных образцов (ПКО). Амплификат положительного контрольного образца является маркером длины ПЦР-продуктов для последующей электрофоретической детекции, т.е. позволял контролировать последний этап ПЦР-анализа.
Особое внимание уделяли подбору концентрации ПКО, т.к. большой избыток ДНК-матрицы приводит к наработке большого количества ампликонов, а, значит, сопряжен с риском контаминации (106). Концентрация ПКО должна быть минимальной чтобы не допустить возможного загрязнения реактивов. В наших исследованиях мы остановились на концентрации 1 нг специфической ДНК в ПЦР-пробу. Такая концентрация дает запас прочности препарата ПКО в 100 раз (рис. 10А), а также позволяет использовать его не только для контроля ПЦР, но и на этапе выделения ДНК (рис. 10Б).
Разработанная тест-система включает в себя четыре комплекта реагентов (рис. 6). Первый - набор для выделение ДНК из исследуемого материала сочетающий в себе метод протеиназной обработки исследуемого материала с последующей сорбцией ДНК на селикагеле.
Второй — набор для амплификации выделенной ДНК, включающий смеси для амплификации ДНК баранины и говядины и ВКО. Амплификация проводится с «горячим стартом». ПЦР-смесь-1 (праймеры и нуклеотиды) отделяется от буфера, содержащего Taq-полимеразу (ПЦР-смесь-2) и ДНК-матрицы прослойкой воска. Для пробиркам и покрыта слоем воска, что препятствует загрязнению ПЦР-смеси-1 и увеличивает стабильность данного реактива и всей тест-системы в целом.
В ПЦР-смесь-2 был введен лидирующий краситель синего цвета. Окрашенная ПЦР-смесь-2 внесенная в пробирку для амплификации поверх слоя воска, позволяла контролировать наличие восковой пробки в каждой пробирке. Если восковая пробка была неполной, то ПЦР-смесь-2 смешиваясь с бесцветной ПЦР-смесью-1 окрашивала последнюю. Подобные пробирки считались браком и выбрасывались.
Третий - набор для электрофоретической детекции ПЦР-продукта. Наличие бромистого этидия в составе концентрата ТБЕ-буфера для проведения электрофореза и лидирующего красителя в составе ПЦР-смеси дает возможность сразу вносить ПЦР-продукт в лунки агарозного геля без дополнительного смешивания его с буфером для нанесения ДНК на электрофорез и последующего окраски геля бромистым этидием, что значительно сокращает количество манипуляций и упрощает процесс.
Четвертый - набор контрольных образцов, включающий в себя положительные контрольные образцы (ПКО) ДНК bovis, ovis, ДНК ВКО и отрицательный контрольный образец (ОКО).
Состав тест-системы и методика анализа описаны в наставлении по применению тест-системы «БИГ» для определения видовой принадлежности тканей жвачных животных методом полимеразной цепной реакции, утвежденной Департаментом ветеринарии 15.08.01 №13-5-02/0161.
