Введение к работе
1. Актуальность темы. Болезнь Ауески (БА) вызывается вирусом псевдобешенства, который относится к семейству Herpesviridae, подсемейству Alphaherpesvirinae. Основным фактором, определяющим эпизоотологические особенности вируса болезни Ауески, является его способность оставаться в латентной форме. Реактивация вируса происходит под воздействием различных факторов (стрессы, гормональные сдвиги, травмы и пр.) и, вероятно, связана с подавлением Т-клеточного иммунитета [В.А. Сергеев и др., 2007].
Болезнь Ауески - остро протекающее в виде эпизоотии и спорадических случаев контагиозное вирусное заболевание сельскохозяйственных (в основном свиней) и диких животных, пушных зверей и грызунов, наносящее значительный экономический ущерб странам с развитым свиноводством, в том числе и России.
Экономический ущерб при возникновении болезни Ауески обусловлен большим отходом поросят, малой эффективностью при откорме и непригодностью в качестве племенных животных. Заболевание свиноматок приводит к резкому нарушению воспроизводства стада из-за абортов и рождения нежизнеспособных поросят [В.Н. Сюрин и др., 1998; П.В. Малярец и др., 1993; В.А. Сергеев и др., 2007].
Анализ эпизоотической ситуации показывает, что болезнь Ауески широко распространена в мире. За период с 2000 по 2007 гг. заболевание зарегистрировано в 72 странах мира. Наибольшее количество стран, где зафиксированы вспышки БА было в Европе - 38 (Белоруссия, Франция, Болгария, Испания, Италия, Польша, Португалия, Россия, Украина, Бельгия, Нидерланды и др.), в Азии - 20 (Япония, Филлипины, Китай, Корея и др.), в Америке - 13 (Куба, Мексика, Аргентина, Боливия, Бразилия и пр.).
Российская Федерация стационарно неблагополучна по болезни Ауески. За период с 1998 по 2007 гг. было зарегистрировано 87 случаев заболевания.
Международный опыт показывает, что искоренение заболевания возможно при применении стратегии борьбы, включающей выявление инфицированных животных (в том числе латентно инфицированных) и их выбраковку, а также реализацию комплекса санитарно-эпидемиологических и других мер. В ряде стран (Великобритания, Дания) было проведено искоренение заболевания посредством
2 выявления и забоя больных и подозрительных в заболевании свиней [G. Wittman, 1991; G. Wittman, 1989]. Такие программы искоренения невозможны в странах и областях с высоким процентом инфицированных животных, так как это приведет к огромным экономическим потерям. Очевидно, что единственно возможным способом решения проблемы искоренения болезни Ауески в таких странах является выявление и выбраковка инфицированных животных без прекращения вакцинации. Такие мероприятия проводятся с использованием маркированных вакцин и дискриминирующих тестов, позволяющих дифференцировать вакцинальный и инфекционный иммунитет.
Среди маркированных вакцин наиболее широкое распространение получили gE-негативные вакцины [В. Lugovic et al., 1986; R.J.M. Moorman et al., 1990]. Соответственно, дискриминирующие тесты, направленные на выявление антител к гликопротеину gE и дифференцирующие вакцинированных и инфицированных животных, также нашли наиболее широкое применение и их разработке и совершенствованию уделяется особое внимание [T.G.Kimman et al., 1996; М. Banks et al., 1996; J. Grom et al., 1995; M. Kit et al., 1991; Q. J. Tonelli, 1991].
Серологическая диагностика болезни Ауески является наиболее распространенной, как в аспекте ретроспективного отслеживания возможных вспышек заболеваний, так и оценке эффективности специфической профилактики.
Большинство методов, позволяющих контролировать уровень антител к вирусу БА в сыворотках крови свиней, а также присутствие вируса и его антигенов в биологических материалах, основано на иммуноферментном анализе (ИФА) [В.Т. Сакович и др., 1989; М. Banks, 1989; М. Banks et а!., 1995; J. Grom et al., 1995; M.W. Mellencamp et al., 1989; P. Quist et al., 1989]. Достоинствами ИФА являются высокая чувствительность, возможность проведения масштабных исследований в полевых условиях, оперативность проведения анализов, небольшие объемы исследуемых проб и возможность автоматизации практически всех стадий выполнения реакции, включая регистрацию и обработку получаемых результатов.
На основе ИФА разработаны и описаны различные тест-системы для диагностики БА (T.G.Kimman et al., 1996; М. Banks et al., 1995; M. Eloit et al., 1989; M.W. Mellencamp et al., 1989; M. Kit et al., 1991; QJ. Tonelli, 1991]. При этом все известные наборы, позволяющие дифференцировать вакцинальный и
инфекционный иммунитет основаны на использовании гликопротеинов или моноклональных антител, что определяет высокую себестоимость соответствующих исследований. Таким образом, усовершенствование тест-системы для выявления антител на основе твердофазного непрямого варианта ИФА с иммобилизуемым антигеном в виде структурно-целостного вируса болезни Ауески штаммов «ВК» и «К», которая обладала бы достаточной чувствительностью и специфичностью и при этом имела бы меньшую себестоимость является актуальной. Кроме этого, представляется целесообразным разработать отечественную тест-систему на основе структурно-целостного вируса болезни Ауески штамма «ВК», позволяющую определять точный титр тестируемой сыворотки по единственному фиксированному разведению на основе уравнения связи с S/P - показателем, что помогло бы существенно повысить производительность анализа за счет увеличения количества исследуемых проб сывороток.
Цели и задачи исследований. Целью настоящих исследований было усовершенствование тест-системы на основе твердофазного непрямого варианта ИФА с иммобилизуемым антигеном в виде структурно-целостного вируса болезни Ауески штаммов «ВК» и «К», а также - разработка отечественной тест-системы на основе структурно-целостного вируса болезни Ауески штамма «ВК», позволяющей проводить оценку титра тестируемой сыворотки по единственному фиксированному разведению на основе уравнения связи с S/P - показателем. В рамках поставленной цели были определены следующие задачи:
- отработать метод получения высокоочищенных и концентрированных
антигенов вируса БА штаммов «ВК» и «К»;
получить специфические сыворотки крови свиней, содержащие антитела к штамму «ВК» и «К»;
получить сыворотки крови свиней, одновременно содержащих антитела к штамму «ВК» и «К»;
- определить оптимальную концентрацию и условия взаимодействия
компонентов реакции;
- сопоставить результаты исследования сывороток крови свиней с помощью
разработанной тест- системы на основе непрямого варианта ИФА с результатами
4 коммерческого набора фирмы IDEXX (США) и оценить чувствительность и специфичность разработанного теста;
для тест-системы с использованием штамма «ВК» определить допустимые величины показателей оптической плотности для отрицательного и положительного контролей; установить величины пороговых показателей, разграничивающих специфическую (положительную) и неспецифическую (отрицательную) реакции; определить величину разведения сыворотки, S/P-показатель которой будет использован для вычисления ее титра; построить уравнение связи между S/P - показателем фиксируемого разведения и величиной титра сыворотки;
с помощью разработанных тест-систем провести исследования сывороток крови свиней на наличие антител к вакцинному и полевому штаммам вируса болезни Ауески.
Научная новизна исследований. Усовершенствована тест-системы для выявления антител на основе твердофазного непрямого варианта ИФА с иммобилизуемым антигеном в виде структурно-целостного вируса болезни Ауески штаммов «ВК» и «К», а также разработана отечественная тест-система на основе структурно-целостного вируса болезни Ауески штамма «ВК», позволяющая определять титр тестируемой сыворотки по одному рабочему разведению на основе уравнения связи с S/P - показателем. При этом отработан метод получения антигенов вируса болезни Ауески штаммов «ВК», «К» и получены специфические гипериммунные сыворотки крови свиней, определены оптимальные концентрации и условия взаимодействия компонентов реакции, а также установлены величины пороговых показателей, разграничивающих специфическую (положительную) и неспецифическую (отрицательную) реакции, определена величина разведения сыворотки, S/P-показатель которой будет использован для вычисления ее титра, построено уравнение связи между S/P — показателем фиксируемого разведения и величиной титра сыворотки для расчета титра антител при тестировании проб в одном разведении.
Сопоставлены результаты исследования сывороток крови свиней с помощью усовершенствованной тест- системы на основе твердофазного непрямого варианта
5 ИФА с результатами коммерческого набора фирмы IDEXX (США) и проведена оценка чувствительности и специфичности предлагаемого теста.
Практическая значимость исследований. Разработаны, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» следующие методики:
«Методика концентрирования и очистки штамма «ВК» вируса болезни Ауески», 2008 г.;
«Методика получения иммуноглобулинов сывороток крови кроликов на маркированный штамм «ВК» и эпизоотический штамм «К» вируса болезни Ауески», 2008 г.;
«Методика определения уравнения линейной регрессии для вычисления титра антител к вирусу болезни Ауески в сыворотках крови свиней в непрямом варианте иммуноферментного анализа способом одного разведения», 2008 г.
Результаты научных исследований использованы при составлении СТО 00495527 - 0006 - 2005 «Вирусвакцина против болезни Ауески свиней и овец сухая культуральная из маркированного штамма «ВК»», утвержденного заместителем руководителя Россельхознадзора 07.08.2007 г.
Основные положения, выносимые на защиту:
усовершенствованная тест-система для выявления антител на основе твердофазного непрямого варианта ИФА с иммобилизуемым антигеном в виде структурно-целостного вируса болезни Ауески штаммов «ВК» и «К»;
отечественная тест-система на основе структурно-целостного вируса болезни Ауески штамма «ВК», позволяющая проводить оценку титра тестируемой сыворотки по единственному фиксированному разведению на основе уравнения связи с S/P - показателем
результаты использования тест-систем на основе твердофазного непрямого варианта ИФА при исследовании сывороток крови свиней на наличие антител к вакцинному и полевому штаммам вируса болезни Ауески.
Публикация научных исследований. По материалам диссертации опубликовано 4 научных работы, в т.ч. 2 работы в издании по перечню ВАК.
Апробация работы. Материалы исследований по теме диссертации доложены и опубликованы в материалах международной научно-практической
конференции молодых ученых «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику», посвященной 50-летию ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», (Владимир, 2008 г.) и докладывались на заседаниях ученого совета ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы выполнены совместно с научным сотрудником Г.А. Блотовой, к.в.н. А.В. Константиновым, к.б.н. Т.И. Корпусовой, а также сотрудниками лабораторий болезней свиней и диагностики болезней КРС и свиней, за что автор выражает им искреннюю благодарность.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 130 страницах, иллюстрирована 19 таблицами и 21 рисунками. Список использованной литературы включает 234 источника, из них 159 на иностранных языках 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ
