Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы. 11
2.1. Общая характеристика семейства ортомиксовирусов 11
2.1.1. Грипп А . 12
2.1.2. Структура и функция гемагглютинина 13
2.1.3. Структура и функция нейраминидазы 15
2.1.4. Структура и функция липидов 16
2.1.5. Структура и функция М белка 17
2.1.6. Структура и функция NP белка 18
2.1.7. Структура и функция белков-полимераз 19
2.2. Структура генома 19
2.3. Антигенная изменчивость вирусов гриппа 21
2.3.1. Антигенная структура гликопротеидов вирусов гриппа 23
2.4. Этапы репликации вируса гриппа 25
2.4.1. Роль вирусных белков в процессе репликации вируса гриппа А 28
2.5. Лабораторная диагностика гриппа птиц 31
2.5.1. Выделение вируса 31
2.5.1.1 .Взятие и подготовка материала 31
2.5.1.2. Заражение куриных эмбрионов 31
2.5.2. Серодиагностика и ретроспективная диагностика 34
2.5.3.1. РТГА 34
2.5.2.2.РСК 34
2.5.2.3. Реакция радиального гемолиза 3 4
2,5.2.4.Иммуноферментный метод для диагностики гриппа птиц 35
2.6. Очистка и концентрирование вируса гриппа А и его структурных компонентов 43
2.7. Профилактика гтриппа типа А 43
2.7.1. Серологическая оценка поствакцинального иммунитета 43
2.8. Заключение по обзору литературы 44
3. Материалы и методы 45
4. Собственные исследования 54
4.1. Репродукция вируса гриппа А птиц в куриных эмбрионах 54
4.2. Репродукция вируса гриппа А в первично-трипсинизированной культуре клеток куриных эмбрионов 59
4.3. Очистка и концентрирование вируса гриппа А птиц 62
4.4. Получение панели антисывороток к 13 сероподтипам вируса гриппа А птиц 76
4.5. Получение коньюгата анти-IgG кур с пероксидазой из хрена 78
4.5.1. Выделение, очистка и концентрирование IgG из желтков яиц кур 78
4.5.2. Получение анти-IgG кур гипериммунной сыворотки. 83
4.5.3. Мечение антивидовых иммуноглобулинов (анти-IgG кур) ферментом пероксидазой из хрена 87
4.6. Тест-система иммуноферментного определения уровня антител к вирусу гриппа А птиц 91
4.6.1. Оптимизация условий проведения иммуноферментного анализа при определении уровня антител к гриппу А кур. 91
4.7. Определение воспроизводимости, чувствительности и специфичности тест-системы для детекции уровня антител к вирусу грмппа А кур в иммуноферментном анализе 94
4.8. Набор реагентов для иммуноферментного определения уровня антител к вирусу гриппа А пртиц 100
5. Обсуждение 107
6. Выводы 114
7. Практическая значимость 116
8. Список литературы. 117
9. Приложение. 134
- Роль вирусных белков в процессе репликации вируса гриппа А
- Репродукция вируса гриппа А птиц в куриных эмбрионах
- Тест-система иммуноферментного определения уровня антител к вирусу гриппа А птиц
Введение к работе
1.1. Актуальность темы. Одним из движущих факторов развития экономики нашей страны является научно-технический прогресс, способствующий ускорению развития народного хозяйства путем интенсификации науки и производства, внедрения новых технологий. Процесс интенсификации охватывает и биологию в самом широком смысле слова.
В связи с сохранением в нашей стране крупных птицеводческих хозяйств, остается актуальной проблема диагностики и ликвидации ряда инфекций, которые при большой концентрации птицы часто проявляется у кур. Грипп - одна из наиболее распространенных инфекционных болезней кур при промышленном птицеводстве. Изучение гриппа кур в течении последнего времени показало актуальность данной проблемы.
Несмотря на то, что ветеринарная практика имеет в своем распоряжении большой набор диагностических сывороток и диагностикумов, увеличение номенклатуры, улучшения качества и стандартизация диагностических препаратов для практических лабораторий по-прежнему остается важной задачей.
При диагностике вирусных и бактериальных инфекций в ветеринарии все более широкое применение находят такие современные и высокоточные методы, как молекулярная гибридизация и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Однако ввиду их высокой стоимости, сложности в постановке и необходимости дорогостоящего оборудования и реактивов метод определения антигенов и антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) при оптимальном соотношении себестоимость-чувствительность остается действенным инструментом в ветеринарной лабораторной практике. Высокая разрешающая способность этого метода обусловлена, главным образом, природой лиганда, степенью очистки компонентов и чувствительностью приборов, регистрирующих наблюдаемый эффект. Таким образом, очистка и концентрирование вирусов является решающим условием при изготовлении диагностикумов и получении высокоактивных иммунных сывороток, используемых при создании компонентов, необходимых для проведения иммуноферментного анализа.
Для получения антивидовых иммуноглобулинов кур, меченых пероксидазой из хрена (ИХ), необходимо наличие чистых препаратов иммуноглобулинов G класса.
Методы выделения иммуноглобулинов из сыворотки человека разработаны детально, но применительно к иммуноглобулинам птиц они не всегда эффективны. Использование многих иммунологических методов для решения прикладных задач в области ветеринарии сдерживается отсутствием коммерческих моноспецифических антисывороток. Идеальным условием получения моноспецифических антисывороток представляется иммунизация продуцентов высокоочищеными антигенами.
Ключевым моментом в отработке твердофазного непрямого ИФА является получение коньюгата, то есть иммуноглобулина меченого пероксидазой. Качество получаемого коньюгата находится в прямой зависимости от серологической активности иммуноглобулина, активности фермента и условий связывания этих компонентов.
Быстрый и точный диагноз гриппа кур является решающим условием организации необходимых мер борьбы с этим заболеванием.
1.2. Целиизадачиисследования.
В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы являлась разработка набора реагентов на основе очищенных и концентрированных антигенов вируса гриппа А кур, используемых в качестве компонента набора для определения уровня антител в крови больной, переболевшей и вакцинированной птицы в им-муноферментном анализе.
Решалисьследующиезадачи:
1.2.1. Репродукцровать вирус гриппа А птиц, штаммы: А/угка/Альберта/35/76 (H1N1); А/утка/Германия/1215/73 (H2N3); А/ужа/Украина/1/63 (H3N8); А/утка/Чехословакия/56 (H4N6); А/крачка/Южная Африка/61 (H5N3); А/индюк/Массачусетс/3740/65 (H6N2); А/курица/СССР/315/70 (H6N2); А/индюк/Онтарио/6118/68 (H8N4); А/индюк/Висконсин/1/66 (H9N2);
А/цыпленок/Германия/49 (H10N7); А/утка/Англия/56 (H11N6);
А/утка/Апьберта/60/16 (H12N5) и А/черноголовый хохо-
тун/Астрахань/1421/79 (H13N2) в 9 — 11 дневных SPF куриных эмбрионах.
12.2. Определить условия репродукции, вируса гриппа А кур, штаммы ГП1-А/угка/Апьберта/35/76 (H1N1) и ГП-9 А/индюк/Висконсин/1/66 (H9N2) в. первично-трипсинизированной культуре клеток SPF куриных эмбрионов.
1.2.3. Разработать метод получения очищенных и концентрированных антигенов
вируса гриппа А кур, штаммы ГШ-А/утка/Альберта/35/76 (H1N1) и ГП-9 А/индюк/Висконсин/1/66 (H9N2), репродуцированных в культуре клеток SPF куриных эмбрионов.
1.2.4. Получить панель антисывороток к 13 сероподтипам ((H1N1), (H2N3),
(H3N8), (H4N6), (H5N3), (H6N2), (H7N1), (H8N4), (H9N2), (H10N7), (HI 1N6), (H12N5) и (H13N2)) вируса гриппа А кур на SPF петухах.
1.2.5. Определить уровень антител к гомологичным штаммам вируса гриппа А в
полученых антисыворотках и степень перекрестных реакций с гомологичными штаммами в РТГА
-
Выделить IgG кур, получить анти-IgG кур антисывротки на кроликах, выделить анти-IgG кур антитела и синтезировать анти-IgG кур иммуноперокси-дазный коньюгат.
-
Разработать компоненты набора для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур в иммуноферментном анализе.
-
Изучить воспроизводимость результатов по определению уровня антител к вирусу гриппа А, полученных с использованием разработанного иммуно-ферментного набора.
-
Исследовать специфичность разработанного Набора с использованием полученной нами панели моноспецифических сывороток петухов к 13 сероподтипам вируса гриппа А кур.
1.2.10. Провести сравнительную оценку чувствительности РТГА и разработанного иммуноферментного Набора при определения уровня анти-гриппозных антител в сыворотках больной, переболевшей и вакцинированной вирусом гриппа А птицы.
1.3. Научнаяновизна.
В результате проведенной работы, определены условия репродукции вируса гриппа А кур, штаммы ГШ-А/утка/Альберта/35/76 (H1N1) и ГП-9 А/индюк/Висконсин/1/66 (H9N2) в первично-трипсинизированной культуре клеток SPF куриных эмбрионов.
Разработан метод получения очищенных и концентрированных антигенов вируса гриппа А кур, штаммы ГШ-А/утка/Альберта/35/76 (H1N1) и ГП-9 А/индюк/Висконсин/1/66 (H9N2), репродуцированных в культуре клеток SPF куриных эмбрионов.
Разработана технология изготовления набора реагентов для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур в иммуноферментном анализе.
Определена воспроизводимость результатов и специфичность разработанного Набора с использованием полученной нами панели моноспецифических сывороток петухов к 13 сероподтипам вируса гриппа А кур,
При изучении ретроспективного ответа на заражение вирусом гриппа птиц (H1N1, H9N2) установлено, что 60% цыплят имели положительные значения показателя отношения адсорбции образца к позитиву (о/п) в разработанном ИФА тесте через 2 недели после заражения, на пятую неделю после заражения - 90%. Результаты, полученные с помощью РТГА в этот период были негативными. Ответ в ИФА значительно увеличился на бустер-инъекцию к 25 неделе, и в РТГА к этому времени результаты были на 100% положительны. Эти данные свидетельствуют о возможности выявления анти-гриппозных антител на ранних стадиях заражения с помощью набора ИФА.
1.4.Практическаязначимостъработы.
Разработан набор для индикации и количественного определения анти-гриппозных антител в сыворотках крови кур.На основании результатов проведенных исследований разработана «Инструкция по изготовлению набора реагентов для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур в иммуноферментном анализе» и проект нормативной документации.
Внедрение в практику ветеринарии иммуноферментного набора реагентов для определения уровня антител к вирусу гриппа А кур в иммуноферментном-анализе позволит решить проблему массового эпизоотологического обследования поголовья кур, составляющего основу мероприятий по ликвидации и предупреждению распространения данного заболевания.
7.5. Апробацияработы.
Материалы исследований доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ВНИТИБП (2002 - 2004г.г.), на 2-ой международной учебно-методической и научно-практической конференции посвященной 85-летию МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, г. Москва (2004 г.), на международной научно-производственной конференции, посвященной 100-летию доктора ветеринарных наук профессора Кон-дюрина Н. Г.: «Актуальные вопросы микробиологии и инфекционной патологии животных», г. Омск (2004 г.).
По материалам диссертации опубликовано 3 работы.
/. 6. Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены
на 132 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и практические предложения, список литературы, содержащий 65 отечественных и 136 зарубежный источников и приложение. В приложении представлены документы, подтверждающие результаты отдельных этапов работы, их научную и практическую ценность. Диссертация иллюстрирована 15 таблицами, 20 рисунками и 3 схемами.
Автор выражает глубокую благодарность академику РАСХН, профессору АЯ. Самуйленко за научно-методическую помощь в организации и проведении исследований.
Роль вирусных белков в процессе репликации вируса гриппа А
Антигенная, молекулярная и генетическая структура гликопротеидов вируса гриппа человека изучена весьма подробно. В составе гемагглютинина было обнаружено наличие вариабельных и консервативных участков последовательности аминокислотных остатков. Консервативные участки играют ведущую роль в сохранении биологических функций НА и формируют каркас, который и определяет постоянную конфигурацию белка. 22% аминокислотных остатков большой субьединицы НА и 45% малой -консервативны [163, 170].
Изначально считалось, что НА вируса гриппа имеет две антигенные детерминанты: общую для родственных штаммов и специфичную, свойственную только одному штамму. Затем было высказано предположение о наличии трех качественно различных антигенных детерминант на поверхности молекулы НА вируса гриппа, типа А.
Самый мощный инструмент ученые, работающие в этом направлении, получили с появлением МА [48, 53, 66, 77, 100, 105, 116, 144, 156, 164]. С их применением стало возможным значительно более детальное изучение антигенной структуры, причем пространственное разрешение методов иммуноанализа существенно увеличилось, достигнув индивидуальных антигенных детерминант - антигенных участков (сайтов), включающих менее 10 аминокислотных остатков, а структурное разрешение достигло уровня, позволяющего регистрировать различия всего лишь по одной аминокислоте [147].
В результате появления этого нового инструмента исследований было обнаружено, что антигенные участки белков вируса гриппа изменяются независимо друг от друга [241]. Аминокислотные изменения возникают также часто в специфических антигенных сайтах, как и в перекрестнореагирующих участках молекулы ГА [252]. Также было установлено, что иммуногенность и антигенность не являются постоянным признаком, свойственным определенным участкам молекулы ГА. В результате дрейфа наблюдался переход одних и тех же участков ГА из одного состояния в другое.
Качественные различия между дрейфовыми вариантами с антигенной характеристикой H2N2 разных лет выделения, а также штаммами, циркулировавшими в одном году, установлены И.М. Исмайловой [64].
При изучении антигенной эволюции вируса H1N1 [56, 184] и вируса H3N2 [43, 68] установлено, что эволюция происходит постепенно, количественные изменения переходят в качественные: новая антигенная детерминанта заменяет в основных позициях антигенные группировки у вирусов прошлых лет, но одна антигенная детерминанта остается общей для всех изученных штаммов вируса гриппа. Анализ ГА позволил определить антигенный сайт, консервативный в серокомплексе HI с 1933 г до сих пор. Две другие детерминанты были лабильными и свидетельствовали об антигенной изменчивости дрейфового характера.
В результате антигенного дрейфа вирус приобретает качественно новые антигенные компоненты, что приводит к возникновению нового варианта вируса, отличающегося от предыдущего по крайней мере одной антигенной детерминантом [26, 49, 178]. Высказано предположение, что различные эпидемические свойства новых штаммов могут быть следствием только одной или нескольких аминокислотных замен.
Появление новых дрейф-вариантов совпадает с развитием эпидемических волн [50]. Антигенные изменения отмечаются не только в ГА, но и в NA [1, 6, 179, 209] . Изменчивость субиппов N1 и N2 изучали в тесте ингибиции нейраминидазной активности [221, 228]. Эксперименты показали наличие, по крайней мере, трех неперекрывающихся антигенных участков в молекуле NA. Анализом с использованием конкурентного радиоиммунного теста и ннгибиции фермента отмечено, что третий антигенный участок может быть подразделен на два перекрывающихся участка [166, 136], Первый и четвертый участки достаточно отдалены для того, чтобы связывание антител на одном из них не влияло на доступность для антител другого [161, 207].
В тоже время, антигенный анализ изолятов вируса гриппа A/H3N2/ 1989-1930 г выделения с помощью МА показал наличие 5 различных комбинаций сочетании антигенных сайтов, а изоляты различались в антигенном отношении; один из изолятов сохранял родство с вирусами, выделенными в 1385 г, только по одному сайту [88].
При изучении антигенной характеристики NA вируса гриппа A/Ri/5/57 (H2N2) с MA R. Webster с соавторами [246] так же показали, что молекула фермента содержит 4-е неперекрывающиеся антигенные области. Исследованиями Colman & Varghese [ПО] при сопоставлении первичной структуры различных NA установлено, что в молекуле имеется семь антигенных детерминант, которые располагаются близко к каталитическому центру и распределены по всей поверхности верхней части мономера.
Репродукция вируса гриппа А птиц в куриных эмбрионах
Репродукцию вируса гриппа А птиц проводили на куриных эмбрионах. Заражение куриных эмбрионов 10-ти дневного возраста в аллантоисную полость проводили по общепринятой методике из расчета 103 ЭИД5о/о,1Мл Зараженные эмбрионы инкубировали в термостате при 37С (оптимальная температура для вирусов типа А). После 48-часовой инкубации частично охлажденные (в течение 40 мин при -15-18С) эмбрионы вскрывали в стерильных условиях и наличие вируса в амниотическои, и аллантоиснои жидкости определяли с помощью реакции гемагглютинации. Определение титра инфекционности вируса проводили по ЭЩЦо/мл на куриных эмбрионах. Результаты оценивали по специфическому воздействию вируса на зародыши (множественные кровоизлияния, вплоть до гибели эмбриона) через двое -трое суток после заражения и рассчитывали титр вируса по методике Ашмарина и Воробьева.
Известно, что вирус гриппа, введенный в аллантоисную полость 10-11-дневного куриного эмбриона размножается прежде всего в энд отели альных клетках хорион-аллантоисной оболочки, хотя вирус можно обнаружить также в клетках амниотическои оболочки и респираторных путей. Накопление вируса гриппа А птиц в полости аллонтоиса имеет очевидные преимущества, поскольку получается большой объем вирус содержаще го материала и его легко собирать. Однако гемагглютинирующая и инфекционная активность репродуцированного вируса зависит от его подтипа.
Формалинизированные эритроциты петуха отмывали физиологическим раствором с рН 7,2. Готовили 0,5 - 1 % суспензию и равный объем ее добавляли к двукратным разведениям исследуемых препаратов. Затем оставляли на 6 часов при температуре 4 - 8 С и учитывали реакцию. Наилучшие результаты были получены при использовании 0,5% суспензии. Все дальнейшие реакции по определению ГА активности вируссодержащих жидкости проводили при этой концентрации формалинизированных эритроцитов петуха.
Выявить гемагглютинирующую активность исходного вируса (в аллантоисных жидкостях) удалось в при первом заражении исходным лиофилизированным препаратом. Опыты показали, что вирус подтипа H1N1, штамм ГШ-А/утка/Альберта/35/76, накопленный в аллантоисной жидкости, обладает большей ГА активностью по сравнению с подтипом H9N2, штамм ГП-9 А/индюк/Висконсин/1/66 выращенным в тех же условиях. Титры в РГА 1:64 и 1:32, соответственно.
При дальнейшем пассировании вируса в 10-дневных куриных эмбрионах позволил увеличить титр гемагглютинирующей активности на 5-м пассаже до 1:4096 - 1:8192. (см таблицу 1. и рис Г).
Несмотря на различия по гемагглютинирующей активности, оба исследуемых подтипа вируса гриппа А птиц оказались одинаково инфекционно активными: титр вируса составил 7 lg ЭИД50/мл при первичном заражении и 7 - 8 lg ЭИД50/мл на уровне 5-го пассажа в куриных эмбрионах. Ввиду чрезвычайного антигенного дрейфа вируса гриппа А, для проверки специфичности разрабатываемой тест-системы необходимо было получить панель подтипоспецифических сывороток. Для этого все 12 полученные из контрольного института штамма (ГШ-А/утка/Альберта/35/76 (H1N1) и ГП-9 А/индюк/Висконсин/1/66 (H9N2)) были репродуцированы 12 штаммов А/утка/Альберта/35/76 (H1N1); А/утка/Германия/1215/73 (H2N3); А/утка/Украина/1/63 (H3N8); А/утка/Чехословакия/56 (H4N6); А/крачка/Южная Африка/61 (H5N3); А/индюк/Массачусетс/3740/65 (H6N2); А/курица/СССР/315/70 (H6N2); А/индюк/Онтарио/6118/68 (H8N4); Вирус гриппа А, штаммы ГШ-А/утка/Альберта/35/76 и ГП-9 А/индюк/Висконсин/1/66, репродуцировали в первично-трипсинизированных культуре клеток куриных эмбрионов (ККЭ) (1-й субпассаж).
Клетки выращивали на культуральной среде содержащей половину среды Игла, половину среды 199, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия и 40 единиц гентамицина на литр среды.
После образования монослоя клеток (рис. 3 а, в) его трижды отмывали раствором Хенкса и инокулировали вирус гриппа, штаммы ГШ-А/утка/Альберта/35/76 и ГП-9 А/индюк/Висконсин/1/66 в течение часа при 37 С из расчета 1-2 ИЭДзо/ш на клетку. Затем добавляли бессывороточную среду ГЛАХ (гидролизат лактальбумина на расворе Хенкса), содержащую 40 единиц гентамицина на литр среды.
Тест-система иммуноферментного определения уровня антител к вирусу гриппа А птиц
С целью оптимизации процесса постановки реакции, для увеличения точности, чувствительности и уменьшения расхода реактивов, необходимо подобрать концентрации используемых реагентов. Для определения оптимальной концентрации антигена при постановке ИФА его титровали с положительной и отрицательной сыворотками в разведении 1:100.
Постановку непрямого ИФА проводили по следующей схеме. Двукратные разведения антигена, начиная с концентрации 50 мкг/мл в объеме ШОмкл, адсорбировали в лунках полистирольных микропланшет в течение 18 ч при +4С, после чего микропланшеты пятикратно промывали ФБР, содержащем 0,1% Тритона Х-305, рН 7,2 - 7,4, и вносили по ЮОмкл положительной и отрицательной сыворотки в разведении 1:200. Микропланшеты помещали в термостат на 1 ч при +37С и промывали, как описано выше. На следующей стадии микропланшеты обрабатывали антивидовым иммунопероксидазным коньюгатом в объеме ЮОмкл на лунку. Затем микропланшеты промывали. Реакцию проявляли субстратным раствором о-фенилендиамина 10 минут и учитывали после остановки 1М серной кислотой по показаниям ОП490 на считывающем устройстве "Sigma" (рис.17).
Оптимальное разведение антигена составило Імкг/мл, что обеспечивало высокий уровень оптической плотности (ОІІ490 равен 1,8 - 1,6) и достоверное различие результатов со специфической и контрольной сыворотками.
Для установления пороговой чувствительности ИФА определяли зависимость величины ОП490 продукта реакции от разведения сыворотки. Опыт проводили при оптимальной концентрации сорбированного антигена вируса. Двукратные разведения положительной сыворотки начинали с разведения 1:50. Достоверно регистрируемое различие в показаниях ОП490 (более чем в 2 раза) наблюдалось при разведении специфической и контрольной сывороток с 1:200. При разведении ниже 1:100 наблюдается неспецифическое взаимодействие, что сказывается на результатах реакции (рис. 18).
Таким образом, была определена концентрация антигена вируса гриппа А кур и положительной сыворотки, которые могут быть использованы для определения уровня антител иммуноферментным методом. 4.7. Определение воспроизводимости, чувствительности и специфичности тест-системы для детекции уровня антител, к вирусу грмппа Л кур в иммуноферментном анализе.
При разработке иммунологического контроля для подтверждения эффективности тест-системы использовалось несколько важных критериев -таких как воспроизводимость, чувствительность и специфичность.
При определении чувствительности тест-системы планшеты были сенсибилизированы антигеном вируса гриппа птиц. Высокоактивная антигриппозная сыворотка была разбавлена нормальной контрольной сывороткой в соотношении 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 и 1:128. Эта сывороткой в соотношении 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 и 1:128. Эта калибровочная сыворотка была протестирована на ИФА планшетах сенсибилизированных антигеном вируса гриппа птиц (5 копий на планшет).
С помощью разработанной тест-системы по выявлению антител к вирусу гриппа А птиц была продемонстрирована полная корреляция между log2 разбавления и log2 показателем отношения адсорбции образца к позитиву (коэффициент корреляции г =98) (Рис. 18). ИФА был способен обнаружить специфические антитела к вирусу гриппа птиц в 5-7 разведениях высокоактивной анти-гриппозной сыворотки (Рис.17). РТГА может обнаружить специфические антитела только в первых трех разведениях. Все остальные разведения были негативны в РТГА
Каждая сыворотка была протестирована, как с использованием ИФА так и с помощью традиционного метода РТГА
При изучении ретроспективного ответа на заражение вирусом гриппа птиц (H1N1, H9N2) установлено, что 60% цыплят давали позитивные значенияя показателя отношения адсорбции образца к позитиву (о/п) в разработанном тесте по выявлению антител к вирусу гриппа А птиц с через 2 недели после заражения. Четыре недели спустя после иммунизации титры продолжали расти. На пятую неделю после заражения 90% птиц показали положительные значения о/п (Рис. 19).Все это время результаты полученные с помощью РТГА были негативными. Ответ в ИФА значительно увеличился после бустер-инъекции в возрасте 25 недель. На данной стадии результаты РТГА стали на 100% положительны. Эти данные дают ясную картину возможности выявления анти-гршшозных антител посредством набора ИФА.
При исследовании специфичности тест-системы была протестирована полученная нами панель моноспецифических сывороток петухов к 13 сероподтипам вируса гриппа А кур. Показателем о/п колебались во всех образцах сывороток от 0,52 до 1,07, что значительно превосходит показатель о/п отрицательного контроля - 0,15 (Таблица 15). Эти данные показывают, что ИФА выявляет столь же высокий уровень специфичности у известных позитивных сывороток, как и РТГА. Вариабельность в о/п значениях составила около 6% из-за вариаций между отдельными постановками опыта (на планшетах и в лунках).
