Содержание к диссертации
Введение
Литературный обзор 11
Техническое регулирование и подтверждение соответствия продукции 11
Сравнительный анализ зарубежных и отечественных критериев и методов оценки безопасности и качества продуктов животного и растительного происхождения 18
Идентификация мяса и методы анализа 24
Фальсификация продуктов животного происхождения компонентами из генетически модифицированных
источников (ГМИ). Методы их определения 29
Собственные исследования 36
Цель и задачи исследования - 36
Материалы и методы исследования 36
Методика определения видовой принадлежности мяса на основе иммун до диффузии 37
Отбор и подготовка проб для исследования 37
Постановка реакции иммунодиффузии 37
Учет и оценка результатов , 40
Методика определения видовой принадлежности мяса на основе ДНК-диагностики 41
Выделение и очистка ДНК животных из проб продовольственного сырья и не термо-обработанных пищевых продуктов с помощью тест-набора SureFood PREP Animal 41
Выделение и очистка ДНК животных из проб продовольственного сырья и пищевых продуктов, подвергнутых термической обработке с помощью тест-набора SureFood PREP Animal X 42
Постановка ПЦР 44
Исследование продуктов ПЦР методом гибридизации с последующим иммуноферментным анализом и оценка результатов 46
Методика определения ГМИ на основе ПЦР и электрофоретического детектирования 47
Методика определения ГМИ на основе амплификации, ДНК- гибридизации и иммуноферментного детектирования 49
Статистическая обработка результатов 52
Результаты исследования 52
Совершенствование методов определения видовой принадлежности мяса на основе ДНК-диагностики и иммунодиффузии анализа 52
Разработка модифицированной методики идентификации свинины на основе ПЦР и ДНК-гибридизации 61
Сравнительный анализ и гармонизация методов определения компонентов из ГМИ, фальсифицирующих продукцию животного происхождения 64
Гармонизация критериев и методов оценки качества и безопасности сырья и пищевых продуктов в системе
добровольного подтверждения соответствия 76
Обсуждение результатов 84
Предложения для практики 90
Выводы 91
Список литературы
- Техническое регулирование и подтверждение соответствия продукции
- Идентификация мяса и методы анализа
- Методика определения видовой принадлежности мяса на основе иммун до диффузии
- Совершенствование методов определения видовой принадлежности мяса на основе ДНК-диагностики и иммунодиффузии анализа
Введение к работе
Вступивший в силу 1 июля 2003 года Федеральный закон «О техническом регулировании» создал основу для проведения государственной реформы технического регулирования. Суть преобразований сводится к тому, чтобы на основе рационального сочетания свободного предпринимательства и государственного регулирования, гармонизации с международной практикой этой деятельности обеспечить безопасность продукции и повышение ее конкурентоспособности.
Реформа предопределяет необходимость гармонизации основных элементов технического регулирования, обеспечивающих безопасность и качество продукции: технических регламентов, стандартов, процедур подтверждения соответствия, аккредитации, контроля и надзора (19, 71).
Одной из основных целей реформирования системы технического регулирования является повышение эффективности защиты рынка от опасной продукции. Для этого необходимо внедрение стандартов оценки безопасности и качества продуктов, отвечающих международным критериям.
Одним из основных критериев подтверждения соответствия продукции, согласно Федеральному закону «О техническом регулировании», является ее идентификация.
Идентификация продукции способствует исключению из торговли недоброкачественной и фальсифицированной продукции, представляющей серьезную угрозу для здоровья населения.
Идентификация сырья и продуктов животного происхождения является важным элементом в системе Государственного ветеринарного надзора. Актуальное значение при этом имеют такие критерии, как определение видовой принадлежности мяса и рыбы, определение видового состава мясных и рыбных продуктов и определение фальсифицирующих примесей, в частности, определение примесей из генетически модифицированных источников.
Известны различные методы идентификации продуктов животного происхождения, они основаны на электрофоретическом анализе белков, биохимических, гистологических исследованиях (38, 55, 89, 134, 144, 168, 18І).
Весьма чувствительными и специфичными способами идентификации продуктов животного происхождения являются методы ДНК-диагностики. Они позволяют проводить анализ термообработанных образцов (30, 31, 108, 111, 139, 180).
Тест-системы на основе иммунологического анализа просты в исполнении, экспрессны и специфичны (73, 154).
Важным является проведение сравнительных исследований различных тест-систем идентификации с целью их оценки для использования в качестве арбитражных методов при подтверждении соответствия или в качестве скрининговых тестов при мониторинговых испытаниях.
Решение проблем идентификации сырья и пищевых продуктов внесет определенный вклад в обеспечение гарантий качества и безопасности продукции.
Учитывая, что Российская Федерация интегрирует в мировую экономику, можно ожидать глобального расширения каналов поступления на внутренний рынок широкого ассортимента пищевых продуктов, полученных из генетически модифицированных источников (ГМИ) (63).
Безопасность пищевых продуктов из ГМИ является ключевым фактором, определяющим возможность их широкого использования в питании. Мнения по этому вопросу противоречивы, однако потребитель должен располагать информацией о содержании в продукции ГМИ (59).
Во вступившем в силу Федеральном законе «О техническом регулировании» предусмотрено совершенствование систем подтверждения соответствия продукции. Большую приоритетность получило добровольное подтверждение соответствия в форме добровольной сертификации.
Добровольное подтверждение соответствия стало действенным инструментом повышения конкурентоспособности отечественных товаров, продукции и услуг на рынке.
Таким образом, совершенствование контроля безопасности и качества пищевых продуктов на основе внедрение гармонизированных методов идентификации мяса и определения компонентов из ГМИ, фальсифицирующих продукцию животного происхождения, является важным аспектом подтверждения соответствия этой продукции. Актуальной задачей гармонизации механизма подтверждения соответствия продукции становится также разработка новых систем добровольной сертификации, включающих критерии и методы .оценки безопасности и качества, отвечающие международным стандартам.
Цель и задачи исследований.
Целью исследований являлась гармонизация критериев и методов оценки качества и безопасности продуктов животного происхождения при подтверждении соответствия продукции.
В задачи исследований входило:
провести сравнительный анализ литературных данных по зарубежным и отечественным критериям и методам оценки безопасности и качества продуктов животного происхождения;
- гармонизировать методы определения видовой принадлежности мяса с использованием стандартизованных по международным требованиям тест-систем на основе иммунодиффузии и ДНК - диагностики;
- разработать модифицированную методику идентификации свинины на основе ПЦР и ДНК-диагностики;
- определить чувствительность и специфичность методов идентификации свинины на основе иммунодиффузии и ДНК-диагностики; - разработать методические рекомендации по определению видовой принадлежности мяса и мясопродуктов на основе иммунодиффузии и ДНК-диагностики;
- гармонизировать методику определения компонентов из генетически модифицированных источников, фальсифицирующих продукцию животного происхождения, с использованием стандартизованной по международным требованиям тест-системы на основе полимеразой цепной реакции, ДНК гибридизации и иммуноферментного анализа;
- разработать гармонизированные критерии и методы оценки безопасности и качества сырья и продуктов животного происхождения системы добровольной сертификации "Гильдия Поставщиков Кремля".
Научная новизна:
Проведен сравнительный анализ литературных данных по зарубежным и отечественным критериям и методам оценки безопасности и качества продуктов животного происхождения и определены основные направления их гармонизации.
Проведена гармонизация критериев и методов идентификации мяса и определения ГМИ с использованием стандартизованных по международным требованиям тест-систем на основе полимеразой цепной реакции, ДНК-гибридизации и иммуноферментного анализа.
Проведена гармонизация методов идентификации свинины с использованием стандартизованных по международным требованиям тест-систем на основе иммунодиффузии и ДНК-диагностики.
Разработана модифицированная методика идентификации свинины, включающая выделение ДНК с использованием 3% СТАВ-буфера, амплификации ДНК с биотинилированными праймерами, гибридизации меченных ампликонов с ДНК-зондами, иммобилизованными на планшетах и детектирование гибридных молекул по интенсивности окрашивания после реакции с конъюгатом и субстратом.
Определены чувствительность и специфичность метода на основе иммунодиффузии, позволяющего проводить идентификацию до 5% свинины в сырье и сырых продуктах питания.
Показана высокая чувствительность и специфичность метода на основе полимеразой цепной реакции, ДНК-гибридизации и иммуноферментного анализа, позволяющего проводить идентификацию до 0,5% свинины в сырье и продуктах питания, в том числе термообработанных.
Показана возможность определения до 0,01% ДНК ГМИ с использованием стандартизованной тест-системы на основе амплификации с биотинилированными прайм ерами, последующей гибридизацией со специфичными ДНК-зондами и детектированием гибридных молекул по иммуноферментному типу.
Разработаны гармонизированные критерии и методы оценки безопасности и качества сырья и продуктов животного происхождения для системы добровольной сертификации "Гильдия Поставщиков Кремля".
Практическая ценность.
На основании результатов исследований разработаны:
«Методические рекомендации по определению видовой принадлежности мяса и мясопродуктов на основе иммунодиффузии» (утверждены Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 18.03.2004г.);
«Методические рекомендации по определению видовой принадлежности мяса и мясопродуктов на основе ДНК-диагностики» (утверждены Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 18.03.2004г.);
- разработаны требования к системе добровольной сертификации «Гильдия Поставщиков Кремля» (система добровольной сертификации представлена для утверждения в Федеральное агентство по техническому регулированию и метрологии). Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:
- заседании Ученого совета ВНИИВСГЭ (2004 г.);
- межлабораторном совещании ВНИИВСГЭ (2004 г.);
- IV Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции» (Москва, 2002 г.);
- II Международной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2003г.);
- V Международной конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, ветеринарно-санитарного контроля и биологической безопасности сельскохозяйственной продукции» (Москва, 2004 г.).
Публикации. Результаты исследований отражены в 7 научных статьях. Положения, выносимые на, защиту.
- Изучение российских и международных критериев и методов оценки безопасности и качества сырья и продуктов животного происхождения и определение основных направлений их гармонизации.
- Исследования по гармонизации методов определения видовой принадлежности мяса с использованием стандартизованных по международным требованиям тест-систем на основе иммунодиффузии и ДНК - диагностики.
- Разработка модифицированной методики идентификации свинины на основе полимеразой цепной реакции (ПЦР) и ДНК-диагностики.
- Определение чувствительности и специфичности методов идентификации свинины на основе иммунодиффузии и ДНК-диагностики.
- Исследования по гармонизации методики определения компонентов из генетически модифицированных источников, фальсифицирующих продукцию животного происхождения, с использованием стандартизованной по международным требованиям тест-системы на основе полимеразой цепной реакции, ДНК-гибридизации и иммуноферментного анализа.
- Разработка гармонизированных критериев и методов оценки безопасности и качества сырья и продуктов животного происхождения системы добровольной сертификации "Гильдия Поставщиков Кремля".
Техническое регулирование и подтверждение соответствия продукции
Установление обязательных требований к продукции и процессам производства является одним из инструментов государственного регулирования экономики. Эффективное применение технических требований является важнейшим фактором, который влияет и на уровень конкурентоспособности страны на мировых торговых рынках. Поскольку система обязательных технических требований применяется на всех этапах жизненного цикла продукции — включая доступ на рынок и обращение продукции на рынке, она стала предметом регулирования международного права, в том числе многосторонних торговых соглашений в рамках Всемирной торговой организации (ВТО).
Члены ВТО согласовали ряд документов, регламентирующих правила обеспечения безопасности продукции. К ним относятся «Соглашение по применению санитарных и фитосанитарных мер» (СФС) и «Соглашение по техническим барьерам и торговле» (ТБТ), которыми признается важный вклад международных стандартов и систем оценки соответствия качества для повышения эффективности производства и ведения международной торговли.
Технические регламенты не должны оказывать на торговлю более ограничительных воздействий, чем это необходимо для достижения законных целей, принимая в расчет риски, которые возникали бы при их невыполнении. Такими законными целями являются, в частности, требования национальной безопасности; предотвращение обманной практики; защита здоровья или безопасности людей, жизни или здоровья животных или растений, либо охраны окружающей среды (3, 10, 42, 50, 51, 64).
Основными элементами технического регулирования являются технические регламенты, стандарты, процедуры подтверждения соответствия, аккредитация, контроль и надзор.
В настоящее время обязательное подтверждение соответствия проводится на соответствие обязательным требованиям безопасности, которые содержатся в государственных стандартах, санитарных правилах и нормах, строительных нормах и правилах и других нормативных документах. В связи с реформированием технического регулирования в стране, обязательные требования к продукции в скором времени будут содержаться в технических регламентах. Добровольное подтверждение соответствия осуществляется в форме добровольной сертификации. Современный взгляд на добровольную сертификацию заключается в том, что она является типичным рыночным механизмом, позволяя изготовителю получать определенные конкурентные преимущества. Потребитель заинтересован в проведении добровольной сертификации, которая проводится, как правило, по всем показателям качества, в отличие от обязательной, проводимой только по показателям безопасности. Кроме того, добровольная сертификация, организуемая профессиональным сообществом изготовителей (обществами изготовителей, гильдиями и другими организациями такого типа), оказывается эффективным средством защиты рынка от контрафактной продукции, которая реализуется под чужой маркой.
Основным отличием нового законодательства стало введение единого вида нормативного документа в статусе законодательного акта, устанавливающего обязательные требования к продукции - технического регламента. При этом национальные стандарты становятся добровольными. Федеральный закон «О техническом регулировании» определил следующие цели принятия технических регламентов: - защита жизни или здоровья граждан, имущества физических или юридических лиц, государственного или муниципального имущества; - охрана окружающей среды, жизни или здоровья животных и растений; - предупреждения действий, вводящих в заблуждение приобретателей.
Термин «безопасность», имеющий различное толкование в законодательных актах Российской Федерации, теперь приобрел четкое определение - «состояние, при котором отсутствует недопустимый риск, связанный с причинением вреда жизни или здоровью граждан, имуществу физических или юридических лиц, государственному или муниципальному имуществу, окружающей среде, жизни или здоровью животных и растений». Это определение соответствует общепринятой международной терминологии (ИСО/МЭК 2, п. 2.5).
Перечень объектов добровольного подтверждения соответствия, приведенный в пункте 1 статьи 21, достаточно широк и включает не только продукцию, процессы ее производства, эксплуатации, реализации и утилизации, но и работы и услуги, а также "иные объекты". При этом в качестве нормативной базы подтверждения соответствия могут использоваться национальные стандарты, стандарты организаций, требования систем добровольной сертификации и условия договоров. Таким образом, перечень объектов и подтверждаемых при добровольном подтверждении соответствия требований в новом законодательстве значительно расширен.
Идентификация мяса и методы анализа
Мясо и мясопродукты являются источником высоко усвояемого животного белка с оптимальным соотношением незаменимых аминокислот (69,82, 184-185).
В последнее время появилось много фальсифицированной «мясной» продукции состоящей из несоответствующих техническим условиям (83).
Вследствие этого возросла роль одного из важнейших элементов ветеринарно-санитарной экспертизы и подтверждения соответствия -идентификация (7, 29, 35, 61, 71, 87).
При идентификации продукции определяется ее качество, то есть совокупность свойств, обеспечивающих питательную ценность и безопасность для здоровья потребителя, идентичность состава и сохранение потребительских свойств (169).
Действия, направленные на ухудшение потребительских свойств товара или уменьшение его количества при сохранении наиболее характерных, но не существенных для его использования по назначению свойств могут рассматриваться как фальсификация (28, 55).
Наиболее часто фальсифицируемыми продуктами являются мясо и продукты его переработки - колбасные изделия, мясокопчености, консервы, полуфабрикаты, так как относятся к наиболее ценным продуктам питания (28).
При идентификации использоваться различные методы: органолептические, морфологические, биохимические, иммунологические и молекулярно-генетические (27, 40, 46, 49, 53, 98, 120, І23-І24, 189-191, 193).
. При ветеринарно-санитарной экспертизе особые затруднения при идентификации мяса возникают в тех случаях, когда для исследования имеются в наличии только мелкие кусочки мяса, а не целые туши или четвертины. В этих случаях применяют реакцию преципитации, определение йодного числа жира, показатели рефракции, а также используют методику определения температур вспышки животных жиров при помощи прибора Бренк ена (9, 36, 72).
Так, например, известно определение межвидовых различий мышечной ткани животных с помощью метода газовой хроматографии. При этом изучалось содержание углеводородов, циклобутанов и полиненасыщенных жирных кислот (134). Однако, по мнению ряда авторов на основании этого пока невозможно осуществлять количественный анализ содержания примесей мяса различного вида в мясо продуктах (165).
Для определения фальсификаций мяса используются биофизические методы, путем изучения спектра поглощения белка (54).
Авторами были показаны различия по оптической плотности и спектром поглощения общего белка мышц свиньи, барана и собаки. Эти различия, как объясняют авторы, отражают различное содержание в белках аминокислот триптофана, тирозина и финилаланина.
Mac с-спектрометрический анализ позволил определять видовую принадлежность сырого и термообработанного мяса (181).
Анализ видового состава проводили также по идентифицикации видоспецифичных пептидных цепей миозина кур методом электронного парамагнитного резонанса (172). Однако использование этих методов требует сложного и дорогостоящего оборудования и не применяется в широкой практике.
Видовая детекция термообработанных мясопродуктов может быть основана на определении термостабильных белков, сохранивших нативную конформацию, или тест-системах для определения денатурированных белков. Поэтому необходимы методы выявления как термостабильных, так и термолабильных видо - и органоспецифичных белков (76).
Среди наиболее часто используемых электрофоретических методов можно отметить изоэлектрофокусирование и метод диск-электрофореза в нативных и денатурирующих условиях (98, 136, 145, 155, 174-175).
Благодаря созданию автоматизированных приборов, обеспечивающих быстрое разделение белков и окраску гелей в стандартных условиях, стало возможным использовать данный метод для идентификации мяса в широкой практике (142, 146).
Широкое распространение получило разделение белков с помощью зонального электрофореза с применением твёрдых носителей (бумага, агар, крахмал, акриламид), насыщенных соответствующими буферами (151).
Для идентификации мяса использовали методики изоэлектрофокусирования (168, 176, 192).
Для идентификации вида термообработанных мясных или рыбных продуктов (мясные консервы, колбасы, сосиски) используется метод электрофореза с додецилсульфатом натрия - SDS-электрофорез (160).
Этот метод используется также для выявления не мясных добавок в мясных продуктах и позволяет выявлять до 0,02% примесей (161).
Есть данные о различие ферментного спектра неспецифической эстеразы в скелетной мускулатуре косули и красного оленя (132). У разных видов животных выявили специфику изоферментного состава мышечных глюкозо-6-фосфатдегидроге-назы, фосфоглюкомутазы и аденилаткиназы (116). Обнаружены различия в изо-ферментном составе креатинкиназы мышц отдельных видов животных и птицы (144).
Проведены исследования по созданию гибридомных клеточных линий, способных синтезировать моноклоны антител, специфичных к различным водорастворимым мышечным белкам курицы и индейки (158).
Для идентификации мяса применяется иммуноэлектрофоретический анализ, заключающейся в последовательном сочетании электрофореза на пластинках геля с последующей иммунодиффузией уже при выключенном электрическом токе.
Для определения видовой принадлежности используют также реакции преципитации в агаровом геле, реакции аглютинации, иммунофлуоресценции и в особенности метод твердофазного иммуноферментного анализа (6, 102, 177-178).
Для идентификации мяса используются также методы гистологических исследований. Они позволяют проводить структурный и гистохимический анализ объектов на микроскопическом и субмикроскопическом уровнях. С их помощью могут быть выявлены даже незначительные изменение структур тканей, отражающиеся на качестве готового продукта (2, 4, 38, 89, 101, 105).
Методика определения видовой принадлежности мяса на основе иммун до диффузии
Отбор проб осуществлялся по ГОСТ 7269 и ГОСТ 7702.0 и согласно действующей нормативной документации.
От образца отбирали пробу размером примерно 5x5x5 см, по возможности без жира и соединительной ткани и переносили в подписанный пластиковый пакет.
Перед отбором проб из каждой последующей партии тщательно мыли и вытирали руки и нож.
При необходимости пробу размораживали, не извлекая из пакета, при комнатной температуре или погружая пакет в воду, не допуская обсушки или обваривания образца.
Постановка реакции иммунодиффузии.
Набор PRIME извлекали из холодильника и все компоненты набора доводили до комнатной температуры (обычно для этого было достаточно 10 - 20 мин).
Перед тем как продолжить исследование, подписывали каждый пинцет буквами "Рк" и "А" и "S" , как это показано на рисунке.
Помещали чашку с гелем на лист чистой белой бумаги, таким образом, чтобы зона "А" оказалась внизу, зона "Рк" наверху, а зоны для образцов "S" слева и справа.
Снимали крышку и клали её рядом с чашкой на столе.
Брали флакон с дисками "А" и пинцет, помеченный буквой "А". Флакон открывали и с помощью пинцета извлекали один "А"-диск.
При этом избегали одновременного извлечения всех дисков на рабочую поверхность, так как это могло привести к перекрестному загрязнению дисков и неверным результатам испытаний.
С помощью пинцета помещали диск "А" на поверхность геля в зону "А" и осторожно прижимали кончиком пинцета к поверхности геля, для того чтобы окончательно установить диск на его место.
Если не удавалось точно поместить "А"-диск в зону "А", немедленно исправляли положение диска. При этом нельзя двигать диск, по поверхности геля, это может привести к повреждению или даже разрыву геля, что впоследствии скажется в неверных результатах исследования.
Для перемещения диска его всегда поднимали пинцетом. Также избегали повреждения геля и диска пинцетом.
Брали флакон с дисками "Рк" и пинцет, помеченный буквой "Рк". Открывали флакон и с помощью пинцета извлекали один "Ркм-диск из флакона и с помощью пинцета помещали его на поверхность геля в зону Тк".
Исследуемый образец мяса извлекали из пакета, пакет расправляли и клали на него образец. С помощью ножа делали разрез поверхности образца примерно на три четверти его толщины
Брали флакон с дисками "S" и пинцетом, помеченным буквой "S", извлекали один диск из флакона. При этом избегали одновременного извлечения всех дисков на рабочую поверхность, так как это могло привести к перекрестному загрязнению дисков и неверным результатам испытаний.
Образец мяса расправляли таким образом, чтобы разрез на поверхности разошелся и с помощью пинцета "S" устанавливли диск "S" примерно в середину разреза, кусок исследуемого мяса осторожно сжимали таким образом, чтобы обе стороны "S -диска вошли в контакт с образцом.
Диск оставляли в контакте с пробой в течение примерно 10-ти секунд. Диск не должен был контактировать с жиром или соединительной тканью.
Если образец мяса был сочный, не погружали диск "S" на дно разреза и не сжимали сильно образец, это могло привести к перенасыщению диска тканевой жидкостью и неправильным результатам анализа.
Если образец мяса был сухой, то делали несколько более глубоких разрезов и погружали в них диск до равномерного насыщения.
Пинцетом, помеченным буквой "S", разводили разрез на поверхности образца и извлекали "S -диск. С помощью пинцета диск "S" помещали на поверхность геля в правую зону "S". Осторожно переворачивали чашку донышком кверху и клали её на белый лист бумаги. Идентификационный код пробы, написанный на пластиковом пакете, фломастером переписывали на донышко чашки в район между краем зоны "S" и краем чашки. Не делали никаких пометок фломастером вблизи зон "Рк" и "S", так как впоследствии это могло мешать осмотру линий преципитации. Осторожно переворачивали чашку и устанавливали её на столе так, как она была установлена ранее.
Совершенствование методов определения видовой принадлежности мяса на основе ДНК-диагностики и иммунодиффузии анализа
І.Интеркалирующие метки
Этот способ детекции основан на том факте, что флуоресценция бромистого этидия и SYBR GREEN I значительно возрастает при их внедрении в двух цепочные молекулы ДНК. Добавление этих красителей в реакционную смесь позволяет наблюдать за накоплением продуктов амплификации.
2. ДНК - зонды
В реакционную смесь добавляют ДНК - зонды, в состав которых входит флуоресцентная метка и гаситель флуоресценции. Когда зонд находится в растворе, гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение и свечение отсутствует. В ходе ПЦР происходит присоединение ДНК - зонда к комплементарной цепи ДНК, происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к увеличению детектируемого свечения. Очевидно, что чем больше ампликонов было наработано в ходе ПЦР на данный момент времени, тем интенсивнее будет свечение. 1. Автоматическая регистрация концентрации продукта ПЦР непосредственно во время амплификации. 2.Возможность количественной оценки генетического материала в десятках образцов. З.Все этапы анализа проходят в одной пробирке - предотвращение контаминации. 4.Размещение лаборатории генодиагностики «на одном столе».
В последние годы интенсивно разрабатывается новая технология ДНК-диагностики, называемая «ДНК-микрочипами», которая также может использоваться для выявления ГМИ (186, 188).
Микрочиповая технология позволяет проводить мониторинг всего генома на одном единственном чипе. На различных микроносителях (стекло, нейлоновые мембраны, гели) помещаются образцы ДНК с известной последовательностью в форме точек даиметром 200-300 микрон. После этого исследуемая ДНК метится (обычно флуоресцентной меткой) и гибридизуется с ДНК иммобилизованными в виде точкек. Результаты гибридизации оцениваются флуориметрически с компьютерной обработкой данных.
Для практической реализации этого элементарного принципа потребовалось объединить самые последние достижения таких наиболее прогрессивных направлений современной науки как молекулярная генетика, нанотехнология, информатика и полупроводниковая индустрия.
ДНК-чипы представляют собой пластину площадью около 1 см, на которой в строго определенном порядке размещены ячейки, каждая из которых содержит одно-цепочечные полинуклеоитды одной определенной последовательности оснований. Количество таких полинуклеотидных ячеек, а следовательно, и количество различных нуклеотидных последовательностей может превышать 1 млн на 1 см , их длина варьируется от 9-10 до 1000 нуклеотидов.
Другим более перспективным направлением является применение разработанных для нужд микроэлектроники литографических технологий с использованием ультрафиолетового излучения. Такая технология позволяет синтезировать олигонуклеотиды непосредственно на поверхности чипа. При этом плотность их составляет несколько миллионов на 1 см2. Недостатком этой технологии является необходимость литографических масок, что ограничивает возможность синтеза этих чипов рамками крупных фирм. .
Последним достижением в данной области стала разработка в 1999 году технологии позволяющей обойтись без литографических масок. Это делает синтез чипов с плотностью олигонуклеотидов любой заданной последовательности превышающей 1000000 на 1 см2 доступным любым лабораториям.
Готовый чип гибридизуется с меченными различными способами ДНК-субстратом. Далее производится детекция меченных нуклетидов с помощью специального устройства, при этом строится паттерн гибридизации, учитывающий те олигонуклеитиды или ДНК фрагменты, с которыми гибридизовалась меченая ДНК и интенсивность сигнала, отражающую количество меченых молекул в данной ячейки чипа. Таким образом, можно получить информацию о последовательности исследуемых ДНК (так как каждой определенной последовательности исследуемой ДНК соответствует известная последовательность иммобилизованной на чипе ДНК) и о количестве каждой исследуемой последовательности.
Стремительное развитие ДНК-чип технологии и ее уникальные возможности, особенно появление в самое последние время принципиально новых доступных для широкого использования подходов в области синтеза чипов, манипуляций с субстратом и детекции результатов делают ее чрезвычайно привлекательной для внедрения в широкую клиническую практику. Такая перспектива резкого расширения рынка ДНК-чип технологии приведет к новой очень перспективной сфере высокотехнологического бизнеса, при этом компании, сумевшие благодаря быстрому внедрению новых высокоэффективных технологий занять доминирующее положение на этом огромном рынке, могут стать такими же гигантами как Intel и Microsoft.
На основе ДНК-микрочиповой технологии разработана методика определения ГМИ на основе известных нуклеотидных последовательностей промотора 35S и терминатора NOS. Эта технология имеет определенные перспективы, так как при ее использовании потенциально возможно определение любых «чужеродных» нуклеотидных последовательностей. Однако этот метод остается в настоящее время весьма дорогостоящим, что затрудняет его использование в широкой практике. Кроме того, при количественном определении ГМИ с помощью ДНК-микрочиповой технологии процент ошибки может быть весьма значительным. Поэтому в качестве арбитражного количественного метода при определении ГМИ принят метод ПЦР в реальном времени.
Однако, при проведении большого числа мониторинговых исследований используют не дорогостоящий качественный анализ ПЦР.
При этом, наборы основаные на классической схеме с использованием электрофореза, делают анализ несколько трудоемким.
В различных системах подтверждения соответствия чаще всего необходимо проведение качественного анализа на выявление генетически модифицированной продукции. Кроме того методы качественного определения ГМИ могут быть использованы для большого числа скрининговых анализов в тех системах подтверждения соответствия, котрые имеют количественные нормативы, так как эти методы практичны, не требуют сложного оборудования и более экономичны.
На следующем этапе наших исследований мы проводили оценку возможности использования наборов SureFood США для выявления ГМИ, с целью определения возможности применения этих тест-систем для подтверждения соответствия различных пищевых продуктов. Как было уже отмечено, производство наборов серии SureFood стандартизовано по международной системе ИСО 9000.
Набор SureFood дает возможность ускоренно и эффективно идентифицировать специфичную ДНК промотора 35S и терминатора NOS в составе продовольственного сырья, кормов и готовой пищевой продукции посредством полимеразой цепной реакции, ДНК-гибридизации и детектирования гибридных молекул на основе иммуноферментного анализа (ИФА).
