Содержание к диссертации
Введение
1 Литературный обзор 10
1.1 Роль ГМИ в обеспечении питания населения 10
1.2 Проблемы безопасности продукции содержащей ГМИ . 14
1.3 Методы определения ГМИ 24
2 Собственные исследования 36
2.1 Материалы и методы 36
2.1.1 Отбор и подготовка проб для исследования. 36
2.1.2 Методика выделения ДНК с использованием детергента СТАВ 37
2.1.3 Методика выделения ДНК с использованием сорбента Silica 39
2.1.4 Методика качественного определения ГМИ на основе ПЦР с электрофоретической детекцией ампликонов 41
2.1.5 Методика качественного определения ГМИ с помощью ПЦР в реальном времени 47
2.1.6 Методика количественного определения ГМИ с помощью ПЦР в реальном времени 49
2.1.7 Статистическая обработка результатов 51
2.2. Результаты исследований 51
2.2.1. Разработка и оптимизация методов выделения и очистки ДНК из продукции животного и растительного происхождения. 51
2.2.2. Сравнительная характеристика методик выделения ДНК. 54
2.2.3. Совершенствование методики качественного определения ГМИ на основе ПЦР с электрофоретической детекцией ампликонов . 56
2.2.4. Разработка модифицированной методики качественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени.
2.2.5. Совершенствование методики количественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени 66
2.2.6. Проведение мониторинговых исследований по выявления фальсифицирующих примесей 74
3. Обсуждение результатов выводы 82
4. Предложения для практики 84
5. Список литературы 85
- Проблемы безопасности продукции содержащей ГМИ
- Методы определения ГМИ
- Методика качественного определения ГМИ на основе ПЦР с электрофоретической детекцией ампликонов
- Совершенствование методики качественного определения ГМИ на основе ПЦР с электрофоретической детекцией ампликонов
Введение к работе
1. Актуальность темы.
В последние годы значительно увеличилось производство и импорт трансгенной продукции. Общая площадь посевов трансгенных культур в мире в 2005 году составила 90,0 млн. га. За девять лет, с 199бг по 2005г, общая площадь, засеянная трансгенными культурами, возросла более чем в 53 раза (с 1,7 млн. га в 1996г. до 90,0 млн. га в 2005г.)- По прогнозам специалистов общая площадь посевов трансгенных культур и число фермеров, выращивающих их, будет возрастать. По данным на 2005 год посевные площади под трансгенными культурами-продуцентами продуктов растительного происхождения занимают в США 49,8 миллиона гектаров, в Аргентине - 17 миллионов гектаров, в странах ЕС - около ОД миллиона гектаров, в России трансгеные культуры пока не выращиваются. За десять лет коммерческого использования ГМ-культур объемы потребления, в частности, модифицированной сои составили: в России - 300 тысяч тонн, в странах ЕС - 50 миллионов тонн, в США - 500 миллионов тонн. Список разрешенных для использования в питании и кормах сельскохозяйственных культур на 2005 год, по данным Food and Drag Administration (США), включает более 100 генетически модифицированных продуктов. При этом, согласно данным Роспотребнадзора, ежегодный импорт товаров, произведенных с использованием биотехнологии, оценивается в 650 млн. долл. США. Внутренний ежегодный объём российского рынка биотехнологических товаров превышает 1 млрд. долл. США. В связи с этим увеличивается вероятность поступления пищевой продукции, полученной из ГМИ или содержащей компоненты из ГМИ, на внутренний рынок Российской Федерации.
В настоящие время разработаны правовые документы, регулирующие генно-инженерную деятельность и использование ГМ-продуктов, которые в
обязательном порядке должны подвергаться экспертизе и проходить госрегистрацию, а продукты, содержащие ГМИ, затем маркироваться.
Для Российской Федерации проблема контроля за содержанием в продуктах питания генетически модифицированных компонентов и информацией о содержании ГМИ в продуктах питания, которая доводится изготовителем до потребителя, становится актуальнее год от года. Во многом это определяется активным присутствием на рынке импортных пищевых продуктов, содержащих растительные компоненты.
В настоящее время значительная часть импортируемых в Россию продуктов содержат компоненты из ГМИ (в основном сои). Трансгенные белки сои постоянно возрастающими темпами заменяют в продуктах питания биологически полноценные животные белки и растительные белки традиционных культур. Важно, что современные регламенты производства любых продуктов питания не ограничивают содержание в них трансгенных растительных белков, а только требуют их маркировки. Учитывая, что замена трансгенпым соевым белком белков животных - сверхвыгодный бизнес, и это создает условия для фальсификации продукции животного происхождения. Сейчас средний россиянин съедает в год 32 кг натурального мяса и рыбы, что на 40% меньше медицинской нормы. При продолжающейся замене животных белков соевыми он в 2006-2007 годах уже будет съедать только 20-25 кг животных белков (Монастырский О.А., 2004).
По данным исследований, проведенных Роспотребнадзором РФ (Иванов А.А., 2004) в 2004 г. по сравнению с 2003 г. было исследовано в три раза больше проб на наличие генетически модифицированных источников (ГМИ) - 12 956 проб продовольственного сырья и пищевых продуктов. Наибольшее количество проб, содержащих ГМИ, в абсолютных значениях, в 2004 г. выявлено в мясной продукции - 946 (в 2003 г. - 272) и «прочей» продукции, основу которой составили растительные белки — 466 (в 2003 г. —
129), В незначительном количестве ГМИ встречались в хлебобулочных и мукомольно-крупяных изделиях (44 пробы), птице и птицеводческих продуктах (29 проб), продуктах детского питания (13 проб) и консервах (13 проб).
В связи с этим необходимо идентифицировать продукцию содержащую примеси ГМИ в продуктах животного и растительного происхождения. На сегодняшний день это является одной из актуальнейших задач биотехнологии. Для этого необходимы разработка и создание высоко эффективных диагностических тест-систем для выявления трансгенных растений в пищевых продуктах, продовольственном сырье, семенном материале, кормах животных, лекарственном сырье. Основой современных методик служат качественные и количественные методы. Данные методики должны позволять проводить определение ГМИ как в термообработанных продуктах, так и нативных.
Цель и задачи исследований.
Целью исследований являлось совершенствование методов идентификации примесей ГМИ в продуктах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения.
В задачи исследований входило:
разработка и оптимизация методов выделения и очистки ДНК из продукции животного и растительного происхождения для качественного и количественного определения ГМИ;
- сравнительная характеристика методик выделения ДНК;
- совершенствование методики качественного определения ГМИ на
основе ПЦР с электрофоретической детекцией амиликонов;
разработка модифицированной методики качественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени;
совершенствование методики количественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени;
проведение мониторинговых исследований по выявлению фальсифицирующих примесей из ГМИ в продуктах животного и растительного происхождения.
Научная новизна:
Разработаны модифицированные высокоэффективные методики выделения ДНК с использованием ионного детергента СТАВ (цетиятриметиламмониум бромида), а также с использованием сорбента Silica (S1O2). Разработанные методики позволяют получать свободную от ингибирующих примесей и в необходимых количествах ДНК из различных продуктов, содержащих компоненты животного и растительного происхождения. ДНК пригодна для качественного и количественного анализа. Методики могут использоваться для экстракции и очистки ДНК как многокомпонентных смесей, так и однокомпонентних.
Усовершенствованы методики качественного определения ГМИ (сои и кукурузы), включающие экспрессное выделение ДНК с использованием сорбента Silica (81() или ионного детергента СТАВ (цетиятриметиламмониум бромида), постановку ПНР с использованием праймеров на лектин н крахмальную синтазу и последующим электрофоретическим разделением ампликонов.
Проведены исследования по совершенствованию методик определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени, включающие экспрессное выделение ДНК с использованием сорбента Silica (SiOj) или использование ионного детергента СТАВ (цетилтриметиламмопиум бромида), амплификации ДНК с мечеными ДНК-зо идами (представляющие собой олигопуклеотид, несущий флуоресцентный краситель и флуоресцентный гаситель), используемые для качественной и количественной оценки продукта.
Разработана модифицированная методика качественного обнаружения ГМИ с использованием 35S промотора, NOS терминатора и внутреннего положительного контроля в одной реакционной смеси, включающую
ускоренную пробоподготовку и оценку результатов на основе ПЦР в реальном времени.
Показана высокая чувствительность и специфичность разработанных количественных методик модифицированных методик количественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени (сои Roundup Ready линии GTS 40-3-2, кукурузы линии MON 810), позволяющих обнаруживать в образце ГМИ менее 0,1 % как в сырье, так и в продуктах питания, в том числе термообработанных. Время анализа сокращается в 1,5-2 раза.
Проведены мониторинговые исследования в сырье и продуктах питания с использованием разработанных методик, показавших возможность использования их для скрининговых и количественных тестов выявления недекларированных ГМИ в продуктах животного и растительного происхождения.
Практическая ценность.
На основании результатов исследований разработаны:
- Методические рекомендации «Качественное определение ГМИ в
продуктах, . содержащих компоненты животного и растительного
происхождения» (утверждены отделением ветеринарной медицины PACXII
20.10.2006 г.)
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:
-V Международной конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, ветеринарно-санитарного контроля и биологической безопасности сельскохозяйственной продукции» (Москва, 2004 г.).
заседании Ученого совета ГНУ ВНИИВСГЭ (2005 г.);
межлабораторном совещании ГНУ ВНИИВСГЭ (2006г.);
- V международной научной конференции «Живые системы и
биологическая безопасность населения» Москва, МГУ ПБ, 2006 г.
Публикации. Результаты исследований отражены в 5 научных статьях.
Положения, выносимые на зашиту.
разработка и оптимизация методов выделения и очистки ДНК из продукции животного и растительного происхождения для качественного и количественного определения искомой ДНК;
совершенствование методик качественного определения ГМИ на основе ПЦР с электрофор етической детекцией амшшконов;
совершенствование методик качественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени;
совершенствование методик количественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени;
сравнительная оценка методов по специфичности, чувствительности и быстродействию;
проведение мониторинговых исследований по выявлению фальсифицирующих примесей из ГМИ в продуктах животного и растительного происхождения.
Структура и объем работы.
Диссертация состоит из введення, литературного обзора, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложений.
Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц и 16 рисунков. Список литературы включает 150 источников отечественных и зарубежных авторов.
Проблемы безопасности продукции содержащей ГМИ
Для получения ГМО в настоящее время применяются 2 основных метода - трансформация растения с помощью Ti-плазмиды (почвенной бактерии Agrobacterium tumifacience), либо различные приёмы прямого переноса ДНК, например, метод биологической баллистики(44).
Первый из этих методов применяется в основном для генетической трансформации двудольных растений. Для этого необходимый ген встраивают Ті-плазмиду, которая затем переносится в агробактерию. Далее трансформируемое растение или культуру клеток культивируют с агробактериями. В результате Ті-плазмида проникает в клетки растения и интегрируется в геном. Каждая такая клетка может быть затем превращена в целое трансгенное растение, которое содержит в себе генетическую информацию из двух или многих различных организмов.
При использовании метода биологической баллистики клетки и ткани растений бомбардируют мельчайшими частицами золота или вольфрама с осаждённой на них ДНК-конструкцией. Основное ограничение биологической баллистики заключается в способности трансформированных клеток восстанавливать клеточную стенку, а затем регенерировать до целого растения(44).
Двудольные растения трансформируются, как правило, с помощью Ti-плазмиды. Однодольные растения трансформируют с помощью метода биологической баллистики.
Применение генно-инженерных технологий позволяет многократно ускорить процесс создания новых сортов растений по сравнению с традиционной селекцией и получить заданное свойство или признак (1, 33, 34). Однако вместе с таким признаком трансформированный организм приобретает целый набор новых качеств, предсказать которые невозможно вследствие несовершенства современных генно-инженерных технологий, а также недостаточной изученности механизмов регуляции экспрессии генома.
Причины потенциальных биологических рисков ГМО 1. Непредсказуемость встраивания чужеродного гена в геном растения. Это - один из основных недостатков генно-инженерной технологии. Современные технологии не позволяют интегрировать генно-инженерную конструкцию в определенное место генома хозяина. До конца трансформации невозможно определить в какое место встроится конструкция, сколько копий этого гена будет в конечном итоге встроено и какие участки генома будут в результате этого повреждены. 2. Плейотропный эффект встроенного гена. Работа встроенного гена, так же и работа окружающих его генов, во многом определяется тем, куда интегрируется ген. Следствием этого может быть непрогнозируемое изменение функционирования генетического, клеточного метаболизма, а также синтез токсичных или аллергенных веществ, ранее не свойственных клетке (42,120). 3. Нарушение стабильности генома и изменение его функционирования вследствие переноса чужеродного гена. Согласно имеющимся данным, даже самые распространенные в настоящее время коммерческие сорта растений (например, соя фирмы Монсанто, устойчивая к гербициду Раундап) не сохраняют генетическую стабильность после трансформации исходного растения. Следовательно, представляют потенциальную опасность для человека и окружающей среды (45, 52,). 4. Нарушение стабильности встроенного в геном чужеродного фрагмента ДНК (56, 86, 93,146). 5. Наличие в вставке генов устойчивости к антибиотикам, которые также могут привести к не желательным последствиям (57). 6. Токсические и аллергические эффекты чужеродного белка (51,112, 142). Все эти, а также ряд других ограничений современных методов получения ГМО, являются источниками потенциальных биологических и экологических рисков. Потенциальные риски культивирования и потребления ГМИ, можно объединить в три группы: пищевые, экологические и агротехнические риски. Пищевые риски 1. Непосредственное действие токсичных и аллергенных трансгенных белков ГМИ на человека и других теплокровных (48,60, 79,92,149). 2. Риски, опосредованные плейотропным действием трансгенных белков на метаболизм растений. 3. Риски, опосредованные накоплением гербицидов и их метаболитов в устойчивых сортах и видах сельскохозяйственных растений (32,49, 70). 4. Риски горизонтального переноса трансгенных конструкций, в геном человека, животных и бактерий (118, 54)). 5. Возможное негативное воздействие на здоровье человека генов устойчивости к антибиотикам.
Практические оценки влияния ГМИ на организм человека и других теплокровных при их пищевом потреблении появились недавно. Наиболее широко известны работы А.Пуштаи (62,123,63).
Однако возможность формирования выраженного иммунного ответа на трансгенный белок, являющийся аллергеном и потребляемый в составе растительного продукта, были известны и ранее. В частности, показан высокий иммунный ответ у мышей на трансгенный картофель, модифицированный капсидным вирусным белком А. Также работы, посвященные механизмам иммунного ответа человека на лектины хлебного дерева и сои, связывающиеся с иммуноглобулином, что приводит к слипанию эритроцитов (43,127).
Помимо рисков, связанных с токсичностью и аллергенностью трансгенных белков, имеют место и пищевые риски, связанные с устойчивостью ГМО к гербицидам (33).
Устойчивость возделываемых сортов растений к действию пестицидов дает большой экономический эффект - ручная или машинная прополка заменяется быстрой и сравнительно дешевой обработкой пестицидами, приводящей к гибели сорняков. Это ведет к увеличению масштабов использования гербицидов, и, соответственно, к усилению их воздействия на окружающую среду, а также к такому нежелательному эффекту как быстрый отбор растений-сорняков, обладающих повышенной устойчивостью к применяемым пестицидам.
Для придания растению повышенной устойчивости к такому распространенному гербицид, как глифосат, используют конструкции основе одного из двух генов: EPSPS (5-енолпирувилшикимат-З-фосфат синтазы) GOX и (глифосатоксидоредуктаза). Сами по себе эти белки не являются ни аллергенами, ни токсинами.
Для оценки безопасности пищевого применения таких сортов, необходимо учитывать не только их способность к накоплению ядовитых для человека и животных химикатов, но и не происходит ли в них накопление других ядовитых метаболитов или аллергенов под действием плейотропных эффектов трансгенных конструкций.
При этом следует иметь в виду, что практически все существующие в настоящее время пестициды токсичны для человека или при попадании в его организм могут приносить ему тот или иной вред. Глифосат, например, является сильным канцерогеном, вызывающим лимфому, раздражение стенок желудка, отек легких и т.д.(70, 107).
Методы определения ГМИ
ПЦР проводили по собственной разработанной программе, в автоматическом режиме, на амплификаторах с детекцией в режиме реального времени: «АНК-32», «АНК-16» производства ИАнП РАН, МГТУ им. Баумана, ЗАО «Синтол» (Россия) и «ICycler» производства Bio-Rad (США).
В качестве матрицы для количественного определения ГМИ использовали выделенную и очищенную ДНК из термообработанных и нативных продуктов. Перед выполнением ПЦР рассчитывали количество реакций. Расчет производил по следующей формуле: Количество реакций = 2 х количество проб + 4 колибровочных образца 2 отрицательных контроля. Маркировали необходимое количество пробирок для исследуемых образцов, также 4 пробирки для колибровочных образцов и 2 пробирки отрицательного контроля (контроль контаминации). Пример для 10 проб: 2 х 10 проб + 4 колибровочных образца + 2 отрицательных контроля = 26 реакции Из-за потерь реагентов, обычно возникающих при пипетировании, готовили смесь с 1 дополнительной реакцией на каждые 10 реакций и 4 дополнительно на каждые 50 реакций.
Для количественного определения модифицированной сои линии 40-3-2 в продуктах содержащих компоненты животного и растительного происхождения была предложена следующая методика. Она основана на выявление гена лектина Lee и модифицированного гена определяющего устойчивость к глифосату.
Реакцию проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей: смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дГТФ и дТТФ - по 2,5 мМ каждого), 2,5 мкл реакционного буфера В, 3,5 мМ MgCb, по 3 пкМ прямого и обратного праймера (для Lee), по 1,8 пкМ прямого и обратного зонда (для Lee), по 6 пкМ прямого и обратного праймера (для RR), по 1,8 пкМ прямого и обратного зонда (для RR), 2,5 ед. Taq-полимеразы и 2 мкл ДНК.
В пробирки вносили 2 мкл деионизированной воды в отрицательный контроль, 2 мкл ДНК исследуемых образцов и 2 мкл ДНК в калибровочные образцы. Данный порядок используется для избежания перекрестной контаминации. Режим амплификации при анализе был использован следующий:
Для количественного определения модифицированной кукурузы линии Моп 810 в продуктах содержащих компоненты животного и растительного происхождения была предложена следующая методика. Она основана на выявление гена крахмальной синтазы SSllb и модифицированного гена определяющего устойчивость к стеблевому мотыльку.
Реакцию проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей: смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дГТФ и дТТФ - по 2,5 мМ каждого), 2,5 мкл реакционного буфера В, 3,5 мМ MgCl2, по 3,5 пкМ прямого и обратного праймера (для SSllb), по 2 пкМ прямого и обратного зонда (для SSllb), по 6 пкМ прямого и обратного праймера (для Моп 810), по 2 пкМ прямого и обратного зонда (для Моп 810), 2,5 ед. Taq-полимеразы и 2 мкл ДНК.
В пробирки вносили 2 мкл деионизированной воды в отрицательный контроль, 2 мкл ДНК исследуемых образцов и 2 мкл ДНК в калибровочные образцы. Данный порядок используется для избежания перекрестной контаминации. Режим амплификации при анализе был использован следующий:
Экспериментальные данные подвергали статистической обработке по Стьюденту с определением средней арифметической, среднего квадратичного отклонения и критерия достоверности.
С целью сокращения временных затрат и оптимизации выделения ДНК изменяли следующие параметры: - Масса навески - Концентрация СТАВ в экстракционном буфере - Время затрачиваемое на инкубирование экстракционным буфером - Количество затрачиваемого протеолитического фермента (протеиназы К) - Изменение режимов центрифугировании - Временя затрачиваемого на инкубирование осаждающем буфером. - Объем солевого раствора для растворения комплекса ДНК-СТАВ. - Концентрация промывочного спирта Результат анализа оценивали качественно и количественно. Качественную оценку результата проводили спектрофотометрически. Максимум поглощения белков при длине волны 280 нм, а для ДНК при длине волны 260 нм. Их пики частично перекрываются. Отношение А260/А280 используется, для оценки чистоты нуклеиновых кислот по белку. Чистая раствор ДНК имеет отношение приблизительно 1.8. Поглощение при 230 нм говорит о наличие в образце веществ типа углеводов, полисахаридов или соединений ароматического ряда. Чистые образцы имеют отношением А260/А230 приблизительно 2.2.
Методика качественного определения ГМИ на основе ПЦР с электрофоретической детекцией ампликонов
Для подтверждения специфичности подобранных праймеров, полученные продукты амплификации электрофоретически разделяли в 2% агарозном геле. В геле отсутствовали продукты неспецифичной амплификации и праймеров димеров. Полученные полосы амшшкона были яркими и четкими. Всё это свидетельствует о оптимально подобранных условиях амплификации и составе ПЦР смеси.
Также проводился анализ кривой плавления с SYBER Green I. Принцип анализа заключается в следующем. При связывании с возникающим в ходе ПЦР фрагментом ДНК интенсивность флуоресценции этого красителя многократно (несколько порядков) увеличивается. Возникновение специфического продукта реакции может быть доказано путем снятия кривой плавления в конце ПЦР. Плавление проводится путем медленного нагревания реакционной смеси в диапазоне 40-95С и мониторинге изменения флуоресценции с температурой. Точка, в которой двуцепочечная ДНК плавится, характеризуется резким падением флуоресценции из-за освобождения красителя в раствор. Первая производная изменения флуоресценции от температуры представляет собой пик, с максимумом в точке плавления. ДНК фрагменты разной длины и разной последовательности имеют различные точки плавления. Если условия ПЦР хорошо оптимизированы, то на кривой плавления для одного продукта амплификации будет один пик. В ходе проведенных исследований было показано отсутствие неспецифики и наличие трёх пиков плаления.
Перекрестных реакций между продуктами, не наблюдалось.
Количественная оценка результатов анализа примесей ГМИ в продуктах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения проводится по калибровочной прямой. Для её построения используются калибровачные стандартные образцы, с процентным содержанием ГМИ 0,5%, 1%, 2% и 5%. Стандарты используются и как положительные контроли. Параметры калибровочной прямой такие как значение среднего квадратичного отклонения R2 и коэффициент калибровочной прямой А используются для количественного расчета содержания ГМИ исследуемых образцах.
Требования к стандартному образцу должны быть максимально жесткими, чтобы соответствовать по химическим и физическим показателям заявленным. Рекомендуют использовать стандарты разработанные и произведенные IRMM (Институт Референсных Материалов и Измерений, Geel, Бельгия). IRMM-410S-2: содержит ГМИ 0,5% разброс ±0,1% IRMM-410S-3: содержит ГМИ 1% разброс ±0,2% IRMM-410S-4: содержит ГМИ 2% разброс ±0,3% IRMM-410S-5: содержит ГМИ 5% разброс ±0,6% Стандарты содержат растительные компоненты соответствующей линии ГМИ, измененную ДНК и экспрессирующийся трансгенный белок. Для количественного анализа использовались стандарты производства ЗАО «Синтол». Проведенные исследования показали возможность замены дорогостоящих стандартов IRRM, стандартами производства ЗАО «Синтол». По основным характеристикам они не уступали зарубежным аналогам.
В случае обнаружения в образце генов вставки 35 S промотор, NOS терминатор и Lee лектина, проводили количественную оценку и идентификацию трансгенной ДНК сои линии 40-3-2, устойчивой к глифосату. Для этого была разработана методика количественного анализа ГМИ.
В количественной методике также используется мультиплексная реакция. В одной пробирке одновременно идут независимо друг от друга две реакции.
1. Реакция - ген лектина, который присутствует в как в ГМ так и в обычной сое. Используемый гибридизационный зонд метили флуоресцентным красителем R6G, в качестве флуоресцентного тушителя использовали BHQ2.
2. Реакция - специфичный модифицированный ген для сои Roundup Ready линии GTS 40-3-2. Используемый гибридизационный зонд метили флуоресцентным красителем ROX, в качестве флуоресцентного тушителя использовали BHQ2. ИД 11
Анализ исследования принимается и считается достоверным, если коэффициент калибровочной прямой А лежит в диапазоне от 0,26 до 0,33.
Анализ исследования принимается, если значение порогового цикла для гена лектина менее 28, а для модифицированного гена реакция не прошла. Значит выделилось достаточное количество ДНК сои для проведения анализа.
Анализ исследования принимается и считается достоверным, если значение порогового цикла для гена лектина менее 28, а значение порогового цикла для модифицированного гена менее 35. Значит выделилось малое количество ДНК сои. Для проведения корректного анализа рекомендуется внести большее количество ДНК в ПЦР смесь.
Анализ исследования принимается и считается достоверным, если значение порогового цикла для гена лектина менее 28, а значение порогового цикла для модифицированного гена более 35. Значит выделилось малое количество ДНК сои. Для проведения корректного анализа рекомендуется внести большее количество ДНК в ПЦР смесь. Проведенный анализ показывает специфичность данной методики. Соя 40-3-2 - обнаружено значительное количество ГМИ Соя не ГМИ - не обнаружено ГМИ Кукуруза Моп 810 - реакция не прошла В случае обнаружения в образце генов вставки 35 S промотор, NOS терминатор и крахмальной синтазы SSllb, проводили идентификацию и количественную оценку трансгенной ДНК по кукурузе линии MON 810, устойчивой к стеблевому мотыльку. Для этого была разработана методика количественного анализа ГМИ.
В количественной методике также используется мультиплексная реакция. В одной пробирке одновременно идут независимо друг от друга две реакции. 1. Реакция - ген крахмальной синтазы SSllb кукурузы, который присутствует как в ГМ так и в обычной кукурузе. Используемый гибридизационный зонд метили флуоресцентным красителем R6G, в качестве флуоресцентного тушителя использовали BHQ2. 2. Реакция - фрагмент ДНК специфичный для ГМ кукурузы MON 810. Используемый гибридизационный зонд метили флуоресцентным красителем ROX, в качестве флуоресцентного тушителя использовали BHQ2.
Совершенствование методики качественного определения ГМИ на основе ПЦР с электрофоретической детекцией ампликонов
Способы выделения ДНК из сырья и пищевых продуктов, по сравнению с зарубежными аналогами, отличаются более низкой стоимостью и доступностью реактивов, не уступая им по остальным критериям.
Предложенные нами методы выделения имеют практическое значение для лабораторной практики. Выделенная и очищенная данными методами ДНК позволяет проводить, как скрининг продуктов и продовольственного сырья, так научные исследования, требующие наличия высококачественной ДНК. При этом предложенные методы просты и экпрессны, характеризуются высоким выходом свободной от различных примесей ДНК. Разработанные нами методики исключают работу с такими агрессивными и вредными реагентами, как фенол, изопропанол, не требуют наличия высококвалифицированного персонала и сложного оборудования. Экстракцию и очистку ДНК возможно проводить в небольших и передвижных лабораториях, обладающих необходимым оборудованием.
При качественном определение трансгенной ДНК, усовершенствование методики выделения ДНК и оптимизации других параметров позволили получить хорошие результаты при разделении ампликонов.
Отсутствие шмеров на электрофореграммах говорит о высокой специфичности подобранных праймеров и эффективно идущей ПЦР. Подобранные праймеры позволяют получить только один ПНР-продукт, что говорит о их высокой специфичности. Перекрестных реакций между продуктами, не наблюдалось. Наличие яркой и четкой полосы ампликона свидетельствует о хорошо подобранных условиях и составе ПЦР-смеси.
Необходимо отметить что унифицированные протоколы проведения ПЦР как обычным способом так и РТ-ПЦР позволяет не изменять параметры проведения амплификации для различных тест-систем с целью эффективного проведения реакции. Что позволяет проводить количественный анализ образцов одновременно по нескольким линиям ГМ-растений, и исключает ошибки персонала ведущие к возникновению недостоверных результатов. Повторное проведение анализа увеличивает расходы и время определения конечного результата.
В скрининговой методике используется мультиплексная реакция. В одной пробирке одновременно идут независимо друг от друга три реакции.
Анализ исследования принимается и считается достоверным, если значение порогового цикла для 35S-npoMOTopa, NOS-терминатора и внутреннего положительного контроля менее 37 циклов.
Анализ исследования присутствия 35S-npoMOTopa и NOS-терминатора не принимается и считается не достоверным, в случае обнаружения в отрицательном контроле копий 35S-npoMOTopa и NOS-терминатора. Необходимо выявить источник контаминации и провести повторный анализ.
Анализ исследования присутствия 35S-npoMOTopa считается положительным, при выявлении в образце большем количество копий 35S-промотора, чем в положительном контроле.
Анализ исследования присутствия NOS-терминатора считается положительным, при выявлении в образце большем количестве копий NOS-терминатора, чем в положительном контроле.
Анализ исследования присутствия 35S-npoMOTOpa считается отрицательным, при выявлении в образце меньшем количестве копий 35S-промотора, чем в положительном контроле, при этом реакции с внутренним положительным контролем прошла стандартно.
Анализ исследования присутствия NOS-терминатора считается отрицательным, при выявлении в образце меньшем количестве копий NOS-терминатора, чем в положительном контроле, при этом реакции с внутренним положительным контролем прошла стандартно.
Анализ исследования присутствия 35S-npoMOTOpa и NOS-терминатора считается ложноотрицательным, в случае обнаружения в образце меньшем количестве копий 35S-npoMOTopa и NOS-терминатора, чем в положительном контроле, при этом реакция с внутреннем положительным контролем не прошла. Это происходит при наличии в выделенной ДНК ингибиторов реакции. Для дальнейшего исследования необходимо повторно выделить образец или развести полученную ДНК в несколько раз.В случае обнаружения в образце генов вставки 35 S промотор, NOS терминатор и Lee лектина, проводили количественную оценку и идентификацию трансгенной ДНК сои линии 40-3-2, устойчивой к глифосату. Для этого была разработана тест-система количественного анализа ГМИ.
В количественной методике также используется мультиплексная реакция. В одной пробирке одновременно идут независимо друг от друга две реакции.
Результат анализа считается достоверным если значение порогового цикла по гену лектина менее 28. Это значит сои выделилось достаточное количество для определения любых содержаний ГМ сои.
Результат анализа считается достоверным если значение порогового цикла по гену лектина более 28, а значение порогового цикла для генетической модификации менее 35, то сои выделилось мало, но она содержит большой количество модификации и результат принимается;
Результат анализа считается достоверным если значение порогового цикла по гену лектина более 28 и значение порогового цикла для генетической модификации более 35, то сои выделилось недостаточно и полученные результаты считаются недостоверными. В этом случае рекомендуется повторить анализ, используя 5 мкл пробы в реакцию или повторить выделение и объединить его с предыдущим.
Аналогичным образом проедено определение трансгенной кукурузы линии MON 810.
Проведенные мониторинговые исследования ПО образцов различных продуктов питания и пищевого сырья (колбас, сосисок, консервов, пельменей, муки и крупяных изделий, молочных продуктов, овощей, жировых растительных продуктов, показали возможность применения разработанных методик для качественного и количественного определения недекларированных компонентов из ГМИ в продуктах животного и растительного происхождения.
