Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1 Роль Ornithobacterium rhinotracheale (ORT) в инфекционной патологии птиц 9
1.2 Распространенность возбудителя орнитобактериоза 11
1.3 Орнитобактериоз 13
1.3.1. Способы распространения. Клинические признаки и патологоанатомические изменения 13
1.3.2, Краткая характеристика биологических свойств ORT 15
1.4 Экспериментальное воспроизведение инфекции 22
1.5 Диагностика орнитобактериоза птиц 25
1.5.1 Бактериологическая диагностика орнитобактериоза 25
1.5.2 Серологическая диагностика орнитобактериоза 27
1.5.3 Диагностика орнитобактериоза с использованием иммуноферментного анализа 31
1.5.4 Молекулярно-генетические методы в диагностике орнитобактериоза 33
Заключение 49
2. Собственные исследования 51
2.1 Материалы и методы 51
2.1.1 Референтные культуры ORT 51
2.1.2 Изучение популяции О. rhinotracheale с применением методов сканирующей электронной микроскопии 51
2.1.3 Пробы патологического материала 52
2.1.4 Пробы сыворотки крови 53
2.1.5 Объект биологическихисследований 53
2.1.6 Питательные среды 53
2.1.7 Биохимические тесты 55
2.1.8 Тест на образование каталазы 55
2.1.9 Тест на образование оксидазы 56
2.1.10 Создание видоспецифичных праймеров 56
2.1.11 Выделение ДНК 56
2.1.12 Постановка ПЦР-амплификации 60
2.1.13 Электрофоретический анализ продуктов ПЦР 63
2.1.14 Постановка ИФА 63
2.2 Результаты собственных исследований 65
2.2.1 Оценка морфологических, культуральных и биохимических свойств ORT 65
2.2.2 Изучение популяции ORT при сканирующей электронной микроскопии 70
2.2.3 Результаты бактериологических исследований 74
2.2.4 Экспериментальное воспроизведение инфекции 76
2.2.5 Изучение распространенности орнитобактерий 78
2.2.6 Разработка метода обнаружения возбудителя орнитобактериоза на основе ПЦР 81
2.2.7 Сравнительный анализ методов выделения ДНК из патологического материала от птиц 82
2.2.8 Оптимизация процесса амплификации 83
2.2.9 Апробация чувствительности и специфичности сконструированной ПЦР тест - системы 85
2.2.10 Определение возможности использования метода ПЦР для
обнаружения О. rhinotracheale в патологическом материале от
птиц 87
3. Обсуждение результатов исследования 89
Выводы 97
Практические предложения 99
Список литературы
- Распространенность возбудителя орнитобактериоза
- Краткая характеристика биологических свойств ORT
- Изучение популяции О. rhinotracheale с применением методов сканирующей электронной микроскопии
- Оценка морфологических, культуральных и биохимических свойств ORT
Введение к работе
Актуальность темы. Орнитобактериоз - бактериальное, высоко- контагиозное заболевание птиц, широко распространенное в странах с промышленно развитым птицеводством. Возбудитель орнитобактериоза - Omithobacterium rhinotracheale циркулирует не только в птицеводческих предприятиях различных стран мира, но и среди диких птиц.
Первые упоминания ов орнитобактсрии датируются 1981 годом, когда Omithobacterium rhinotracheale была впервые выделена в Германии от 5-недельных индюшат с признаками поражения органов дыхания, но способность Omithobacterium rhinotracheale вызывать инфекцию подтверждена только в начале
90-х годов. В настоящее время заболевание, вызываемое Omithobacterium rhinotracheale, зарегистрировано в Южной Африке, Германии, Нидерландах, Франции, США, Израиле, Англии, Бельгии и других странах [124].
Особенности, характеризующие болезнь, вызываемую орнитобактериями, включают относительно слабые респираторные симптомы у молодых птиц, которые начинаются с чихания и исчезают через 1-2 недели. У погибшей птицы наиболее часто регистрируют аэросаккулиты, одно - или двухсторонние пневмонии, пенистые скопления жидкости в грудной полости, анемичность, перикардиты и перитониты.
Заболевание, вызываемое орнитобактериями, может принести значительный экономический ущерб за счет увеличения процента смертности, снижения яйценоскости, снижения вывода птенцов, повышения процента выбраковки и низкого показателя прироста.
Диагностика инфекций, вызванных Omithobacterium rhinotracheale, затруднена, так как клинические симптомы и посмертные изменения не специфичны и вызывают трудности дифференциации от других инфекций. Проблема заключается в том, что Ornithobacterium rhinotracheale может быть изолирована из биологического материала путем бактериологического анализа только на ранней стадии заболевания. Выделение Ornithobacterium rhinotracheale из патологического материала в соответствии с классическими процедурами бактериологического анализа занимает длительное время и достаточно трудоемко, так как колонии медленнорастущей Ornithobacterium rhinotracheale очень мелкие и их рост не всегда заметен при более быстром росте других видов бактерий.
Наиболее перспективными в плане индикации Ornithobacterium rhinotracheale являются методы, основанные на обнаружении их генетического материала в пробе.
Целенаправленных исследований в данном направлении отечественные исследователи не проводили, отсутствуют сведения о распространенности Ornithobacterium rhinotracheale в Российской Федерации. В связи с изложенным, актуальным является усовершенствование методов индикации и идентификации Ornithobacterium rhinotracheale при проведении лабораторных исследований, изучение распространения Ornithobacterium rhinotracheale в птицеводческих хозяйствах Российской Федерации, изучение биологических особенностей популяций Ornithobacterium rhinotracheale.
Цель и задачи исследования. Изучить биологические особенности и усовершенствовать методы индикации и идентификации Ornithobacterium rhinotracheale при проведении лабораторных исследований биологических материалов от птиц и с объектов птицеводства.
Для достижения поставленной цели нами определены следующие задачи:
• изучить распространение Ornithobacterium rhinotracheale в птицеводческих хозяйствах РФ; изучить культуральные и биохимические свойства Ornithobacterium rhinotracheale',
• определить особенности морфологического строения популяции Ornithobacterium rhinotracheale;
• подобрать дифференциально-диагностические среды и условия культивирования Ornithobacterium rhinotracheale; подобрать праймеры и оптимизировать параметры постановки ПЦР в целях совершенствования индикации Ornithobacterium rhinotracheale; провести серологический мониторинг среди птицеводческих хозяйств на наличие антител к Ornithobacterium rhinotracheale; разработать методические рекомендации по индикации Ornithobacterium rhinotracheale в объектах птицеводческих хозяйств.
Научная новизна Впервые определена распространенность Ornithobacterium rhinotracheale (ОРТ) в птицеводческих хозяйствах на территории РФ. Изучены культуральные и биохимические свойства Ornithobacterium rhinotracheale, определены оптимальные условия культивирования на питательных средах.
Впервые изучены морфологические особенности роста и развития популяций Ornithobacterium rhinotracheale, а также выявлен гетероморфизм с проявлением L-Трансформации с помощью метода сканирующей электронной микроскопии.
Установлена патогенность Omithobacterium rhino- tracheale для птиц путем воспроизведения э к с п е р и м е н т а л ь н о й инфекции.
Подобрана с п е ц и ф и ч е с к а я пара п р а й м е р о в и оптимизированы параметры процесса а м п л и ф и к а ц и и для постановки ПЦР ( п о л и м е р а з н о й цепной реакции) .
Определена э ф ф е к т и в н о с т ь использования м е т о д а генетической д и а г н о с т и к и (ПЦР) при обнаружении ДНК Omithobacterium rhinotracheale, позволяющего у с т а н о в и т ь наличие возбудителя о р н и т о б а к т е р и о з а при его содержании в пробе 100 микробных клеток (м.к.) и значительно с о к р а т и т ь срок проведения и с с л е д о в а н и я .
Практическая ценность работы Разработаны и предложены ветеринарной практике «Методические рекомендации по индикации Omithobacterium rhinotracheale методом полимеразной цепной реакции» (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН
27.03.2009г), которые находятся на апробации для внедрения в учебный процесс курсов дополнительного образования для ветеринарных специалистов ветлабораторий РФ на базе ФГУ ЦНМВЛ. Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: • заседаниях учёного совета ГНУ ВНИИВСГЭ (2007,2008 гг); • Международной научно-практической конференции « Молекулярная диагностика», Москва (2007); • расширенном совещание сотрудников лаборатории санитарной микробиологии ГНУ ВНИИВСГЭ (2009г.) Публикации. Материалы диссертации отражены в четырех научных статьях, в том числе одна в журнале, рекомендованном ВАК РФ («Ветеринарная патология»).
Основные положения, выносимые на защиту: • Результаты комплексного изучения биологических свойств О. rhinotracheale.
• Широта распространения О.rhinotracheale в птицеводческих хозяйствах РФ на о с н о в а н и и серологических и с с л е д о в а н и й .
• Результаты подбора специфических праймеров для молекулярно-генетической диагностики орнитобактериоза.
• Экспериментальные данные по разработке метода обнаружения ДНК О. rhinotracheale с помощью ПЦР.
Распространенность возбудителя орнитобактериоза
Первое сообщение о выделении Ornithobacterium rhinotracheale было опубликовано Hinz К.-Н. et. al.(1994) в Германии. Упоминалось, что в 1981 году была обнаружена пастерелла - подобная бактерия у индеек 5-недельного возраста с симптомами респираторного заболевания, в настоящее время называемая Ornithobacterium rhinotracheale.
Пастерелла-подобная бактерия в 1987 году в Венгрии была выделена от уток, страдающих респираторным заболеванием [80].
В 1991 году Jan de Preez исследовал новое респираторное заболевание у бройлерных кур из Южной Африки. Он выделил грамотрицательную, полиморфную, палочковидную, медленно растущую бактерию, не относящуюся ни к одному из ранее описанных видов.
Предварительно новая бактерия была обозначена как полиморфная грамнегативная палочка (PGNR), пастерелла -подобная или кингелла-подобная [71,82, 120]. В 1993 году в Нидерландах и Германии в нескольких стадах индеек наблюдались респираторные заболевания, сопровождающиеся экссудацией носовых пазух, чиханием, слезотечением, опуханием подглазничных синусов, некоторым замедлением роста.
В Германии инфекцию у индюшек наблюдали большей частью в возрасте от 14 недель и старше [84,92,87].
В Нидерландах инфекции, сходные с инфекцией Pasteurella multocida, наблюдались у птиц в очень раннем возрасте. Грам негативные палочки, сходные с теми, что были выделены в Южной Африке, Германии, Венгрии, изолировали из тканей пораженных птиц [120,59}. Позднее также установили, что сходные полиморфные грам-негативные палочки были выделены от птиц с респираторным симптомокомплексом в Израиле, Бельгии, Франции, Англии и в США [63, 101,72].
Вполне возможно, что инфекции, вызванные Ornithobacterium rhinotr ache ale, в птицеводстве до 1993 могли быть ошибочно отнесены к вирусным заболеваниям или инфекциям, вызванными другими видами бактерий, такими как Pasteurella, Flavobacterium, Cytophaga, Haemophilus, Riemerella [85,64,32,30].
После некоторых изменений в схеме бактериологического исследования материала от птиц с респираторными заболеваниями (длительное инкубирование при 5 - 10% атмосферного С02) О. rhinotracheale неоднократно выделялась в случаях аэросаккулитов и пневмоний от индюшек и бройлерных кур во всем мире [70,109,117,93,60].
Были сообщения, что в 1995-1996 годах в различных областях США инфекции, вызванные О. rhinotracheale, сопровождались сильными пневмониями с коэффициентом летальности у взрослых индюшек - 1-15%, а иногда до 50% [62,74].
Присутствие возбудителя орнитобактериоза у водоплавающих птиц в Южной Америке и Азии было установлено серологическими методами [77,65].
Vandamme P. et al. (1994) дали описание основных фенотипических признаков и биохимических особенностей микроорганизма и предложили название О. rhinotracheale. Эти же авторы предложили название нового рода Ornithobacterium (состоящее из ornito - относящаяся к птицам, bacterium - бактерия) и вид rhinotracheale (rhino -нос, trachea трахея) в связи с тем, что микроорганизм был впервые выделен именно из этих органов. Выделение нового рода было основано на сравнительных исследованиях биохимических, фенотипических и генотипических признаков среди грамотрицательных бактерий (Flavobacterium, Cytophaga, Capnocytophaga, Riemerella anatipestifer), выделенных от домашней и дикой птицы. Все штаммы О. rhinotracheale генотипически гомогенны и составляют единственный род, который включает в себя один вид. Фенотипически ближайшими «соседями» являются Flavobacterium, Cytophaga, Capnocytophaga, Riemerella [91]. Таким образом, по имеющимся публикациям О. rhinotracheale имеет широкое распространение по всему миру, особенно в странах с развитым птицеводством. Инфекция регистрируется в США, Мексике, Испании, ЮАР, Канаде, Германии, Бельгии, Франции, Великобритании, Израиле, Италии, Голландии [124].
Приведенные материалы свидетельствуют о том, что данная инфекционная болезнь является объектом внимания ученых в странах с развитым птицеводством.
Возбудитель орнитобактериоза - недавно открытая бактерия, широко распространенная в коммерческом птицеводстве, а также выделенная от диких птиц. Бактерию связывают с респираторными заболеваниями. Аэросаккулиты и пневмония обычно сопровождают инфекции, вызванные Ornithobacterium rhinotracheale. Эти признаки могут быть вызваны попаданием возбудителя орнитобактериоза в трахею или грудную полость и могут быть отягчены другими факторами, такими как: вирусами, вызывающими поражение респираторного тракта, бактериями или климатическими условиями.
Инфекция может передаваться горизонтально, аэрозольным путём, а так же вертикально, через яйцо, что, вероятно, способствует быстрому и повсеместному распространению орнитобактериоза.
Не смотря на то, что отнитобактериоз трудно идентифицируется, существуют некоторые коммерческие тест-системы для идентификации выделенных культур орнитобактерий, однако используемые для выделения Ornithobacterium rhinotracheale питательные среды не всегда поддерживают её рост [124].
Travers A.F. et al. (1996) указывают на что основные патологические изменения у птиц наблюдаются в области глазниц, трахеи, воздухоносных мешков, легких, коленных и заплюсневых суставов. В грудных и брюшных воздушных мешках скапливается желтоватый пенистый экссудат, плевра гиперемирована и покрыта фибринозным экссудатом, творожистые наложения в трахее, консолидация легких. В некоторых случаях может наблюдаться гепатомегалия и спленомегалия.
Краткая характеристика биологических свойств ORT
О. rhinotracheale — грамотрицательная, палочковидная, полиморфная, неподвижная и неспорулирующая бактерия, длиной 0,2 - 0,9 мкм и шириной 1,0 - 3,0 мкм [72].
До настоящего времени учеными не обнаружено никаких специальных структур, таких как пили, фибриллы, плазмиды или специфические токсины внутри рода О. rhinotracheale [101].
О. rhinotracheale сложно культивировать, она растет медленно и требует специальных условий, поэтому в посевах часто можно наблюдать рост других бактерий, вследствие чего О. rhinotracheale не выявляется. Для развития колоний изучаемого микроорганизма часто предлагают добавлять в питательные среды гентамицин и полимиксин для редукции роста сопутствующих возбудителей.
О. rhinotracheale в большинстве случаев способна к росту в аэробных, «микроаэробных» и анаэробных условиях, с содержанием в атмосфере от 5% до 10% С02. Колонии растут при определенном температурном режиме: 30, 35 и 45 С. При этом при температуре 24 С роста практически не происходит.
Период роста на кровяном агаре составляет от 48 до 72 часов. Среды, на которых зафиксировано развитие О. rhinotr ache ale это-кровяной овечий агар, шоколадный агар, пептонныи агар с добавлением сердечно - мозговой вытяжки. Рост колоний бактерий не наблюдался на таких микробиологических средах, как агар Мак-Конки, среда Эндо, агар Дригальского, цитратный агар Симмонса.
На кровяном агаре колонии, как правило, не пигментированы. Тем не менее, наблюдаются также колонии серого и серовато-белого оттенков. При культивировании бактерий в течение 72 часов колонии имеют размер около 1-2 мм в диаметре [72,37,40].
Ферментативные свойства О. rhinotracheale можно дифференцировать от других грамотрицательных палочек, потенциально патогенных для птиц (таблица 1). Большинство штаммов используют в качестве источника углерода следующие углеводороды: D- галактозу, D глюкозу, D - маннозу, лактозу и сахарозу. О. rhinotracheale обладает ферментативной активностью в отношении щелочной фосфатазы, липазы, фосфоамидазы, а - глюкозидазы, Р глюкозамидазы, фосфодиэстеразы, аланинариламидазы, глицинариламидазы, пролинариламидазы, глицилфенил аланинариламиназы, фенилаланинаргининариламидазы и пролиларгининариламидазы. В то же время такие ферменты, как (3 - глюкоронидаза, Р - глюкозидаза, а - манозидаза, а -фукозидаза, липаза С14, фосфолипаза, О.rhinotracheale не синтезирует [6,36,56,38,39,119].
Существует мнение, что результаты биохимических тестов при идентификации культур О. rhinotracheale могут быть противоречивы, так как не все виды О. rhinotracheale способны расти в жидких средах, которые обычно используются в целях идентификации культур. Однако, когда при идентификации используется адаптированная среда, биохимические свойства О. rhinotracheale довольно последовательны, невзирая на источник выделения или серотип вида[119,102].
Для идентификации О. rhinotracheale предлагают применять сочетание преципитации в агарозном геле и иммуноферментного анализа с использование стрипов фирмы BioMerieux API - 20NE и API ZYM, для определение ферментативных и биохимических свойств, поскольку ферментативные свойства О. rhinotracheale довольно постоянны[85,92].
Изучение популяции О. rhinotracheale с применением методов сканирующей электронной микроскопии
В работе использовано 2 референтных штамма Ornithobacterium rhinotracheale (К-33, К-282) из коллекции бактериальных культур ветеринарной лаборатории LOHMAN TIERZUCHT (Германия) и культуры E.coli, P.multocida (ФГУ ЦНМВЛ).
Перед использованием в работе культуры указанных штаммов Ornithobacterium rhinotracheale подвергали селекции по признаку диссоциации. С этой целью лиофильно высушенные культуры Ornithobacterium rhinotracheale после регидратации высевали на 5% кровяной агар. Через 48 ч культивирования при 37С в условиях С02-инкубатора для последующей работы отбирали мелкие непрозрачные сероватые колонии в S-форме.
Для исследования морфологических особенностей популяции бактерий О. rhinotracheale при росте на кровяном агаре использовался метод сканирующей электронной микроскопии (СЭМ).
Для изучения отбирали 24-часовые однородные культуры орнитобактерий, находящиеся в S-форме.
На кровяной агар, разлитый в чашки Петри, укладывали мембранные фильтры (Владипор) и производили посев культуры О. rhinotracheale с помощью бактериологической петли. Посевы инкубировали при 37С 48 часов. Выросшие на фильтрах колонии фиксировали парами 25%-го глутарового альдегида, а затем двукратно обезвоживали в парах пропиленоксида.
Полученные препараты закрепляли на объект - держателе, а затем напыляли золотом 20 мин на установке "Hitachi-E-102" и просматривали на электронном микроскопе со сканирующей приставкой "Hitachi-8010" (Япония) при ускоряющем напряжении 75 кВ и инструментальном увеличении 1-10 тыс. Исследования в СЭМ сопровождались фотосъемкой объектов.
Работа проводилась при содействии и по методике профессора Павловой И.Б. и старшего научного сотрудника лаборатории санитарной микробиологии ГНУ ВНИИВСГЭ Банниковой Д.А.
Патологический материал для бактериологических исследований в целях выделения О. rhinotracheale брали от птиц из разных птицеводческих хозяйств РФ ( ОАО « Братцевское », ЗАО « Элинар - Бройлер », ЗАО «Феникс», ОНО « Загорское ЭПХ ВНИТИП », ОНО (ХО) ППЗ «Птичное », ЗАО «Оренбургский бройлер », ООО «Русский страус», ОАО « Ярославский бройлер », ГУК « Московский зоопарк », ЗАО « Краснобор », ООО « Краснобор - Н », ООО « Дантон птицепром », ОАО п/ф «
Калужская », ОАО «Череповецкий бройлер». Всего было проведено 285 бактериологических исследований 141 трупа птиц различного возраста и вида (голубь, индейка, страус, куры). Также бактериологическому исследованию подвергался патологический материал от убитых с диагностической целью СПФ - цыплят после экспериментального заражения суспензией культуры Ornithobacterium rhinotracheale.
Сыворотка крови для обнаружения антител к возбудителю орнитобактериоза методом иммуноферментного анализа была получена от птиц вышеперечисленных хозяйств. Всего методом ИФА с использованием наборов фирмы IDEXX было исследовано 229 проб сыворотки.
Методом ИФА также исследовались сыворотки крови СПФ -цыплят спустя 30 дней после экспериментального заражения суспензией культуры Ornithobacterium rhinotracheale.
Биопробы (СПФ - яйцо) для экспериментального заражения были приобретены на ФГУП «Щелковский Биокомбинат».
При выполнении работы использовали следующие жидкие питательные среды: Питательный бульон сухой для культивирования микроорганизмов (ННПЦ ГИП, г. Оболенск). Питательный бульон на переваре Хоттингера с содержанием 20 мг/% аминного азота. Мясо-пептонный бульон Бульон с сердечно - мозговым настоем. Состав (г/л): вытяжка из мозга телёнка- 200,0; желатиновый пептон-10,0; натрия хлорид-5,0; вытяжка из говяжьего сердца -250,0; калия фосфат двузамещенный-2,5; декстроза-2,0 Из плотных общеупотребительных коммерческих питательных сред использовали: Питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ - агар), производство ННПЦ ГИП, г. Оболенск. шоколадный агар агар с сердечно - мозговым настоем. Состав (г/л) вытяжка из мозга телёнка- 200,0; полипептон-10,0 натрия хлорид-5,0; вытяжка из говяжьего сердца -250,0 калия фосфат двузамещенный-2,5; декстроза-2,0; агар -15,0 среду Эндо кровяной агар
Оценка морфологических, культуральных и биохимических свойств ORT
На первом этапе исследований было проведено изучение морфологических, культуральных и биохимических свойств Ornithobacterium rhinotracheale при росте на различных питательных средах.
После приготовления питательного бульона, питательного бульона на переваре Хоттингера с содержанием 20 мг/% аминного азота, мясо-пептонного бульона, бульона с сердечно - мозговым настоем, питательного агара, шоколадного агара, агара с сердечно-- мозговым настоем, среды Эндо, кровяного агара, согласно наставлению, у жидких питательных сред устанавливали рН (7,4-7,5) и разливали в одинаковых объёмах по однотипным культуральным сосудам (пробиркам). Среды выдерживали 20 ч при 37С для контроля стерильности. Затем вносили равные посевные дозы бактериальных культур О.rhinotracheale, выращенных в течение 48 ч на 5%-ном кровяном агаре. Посевная доза составляла одну бактериологическую петлю культуры. Производили параллельный посев двух штаммов О.rhinotracheale (К-33, К-282). Культуру каждого штамма О.rhinotracheale засевали в две параллельные пробирки. Одну часть пробирок инкубировали в условиях обычного термостата, а вторую в условиях СОг - инкубатора с содержанием углекислого газа 7,5%. Посевы инкубировали при 37С в течение 48 ч.
Просмотр посевов показал, что все изученные жидкие среды оставались прозрачными. Видимый рост бактерий в них отсутствовал, т. е. общепринятые жидкие питательные среды не поддерживали рост О. rhinotracheale.
У плотных питательных сред устанавливали значение рН 7,4-7,5. Для приготовления шоколадного агара, в горячий ГРМ -агар после автоклавирования среды добавляли 5 % (объём/объём) дефибринированной крови барана. Для приготовления 5 %-ого кровяного агара, ГРМ-агар после автоклавирования охлаждали до 45 С и добавляли стерильную дефибринированную кровь барана. Среды разливали в стандартные чашки Петри по 20 мл в каждую чашку. Для посева использовали 48-часовые агаровые культуры O.rhinotracheale, выращенные на 5%-ном кровяном агаре. Посев производили бактериологической петлёй. Культуру каждого штамма O.rhinotracheale засевали на две параллельные чашки Петри. Одну часть чашек инкубировали в условиях обычного термостата, а вторую в условиях СОг- инкубатора с содержанием углекислого газа 7,5%.
Рост культур учитывали через 24 и 48 ч инкубирования при 37С.
При испытании различных питательных сред оптимальный рост орнитобактерий отмечен при инкубации на 5 % кровяном агаре (овечьем) в течение 48 часов в микроаэрофильных условиях (5 - 10 % С02) при 37С. В этих условиях О. rhinotracheale развивается в виде точечных колоний через 24 часа инкубации. После 48 часов инкубации орнитобактерий приобретали вид мелких округлых, выпуклых матовых колоний серого или серо-белого цвета (рис 2), одна из культур образовывала зону гемолиза.
Слабый рост бактерий был отмечен также на следующих плотных питательных средах: шоколадном агаре, агаре с сердечно - мозговым настоем и полностью отсутствовал на среде Эндо и ГРМ-агаре.
Колонии, выросшие на кровяном агаре, отбирали для микроскопических и биохимических исследований.
Пересеву подлежали мелкие колонии правильной формы. У выделенных культур бактерий определяли форму клеток, отношение к окраске по Граму, способность роста на средах Эндо и мясопептонном агаре.
При изучении морфологии орнитобактерии в мазках, окрашенных по Граму, было установлено, что орнитобактерии имеют вид мелких грамотрицательных полиморфных палочек, иногда образующих нити или принимающих коккоподобную форму (рис.3).
При окраске по методу Ожешки спор не обнаружено. При микроскопии культур методом «висячей капли» установлена их неподвижность.
На первоначальном этапе идентификации, после установления формы клетки и окраски по Граму, у грамотрицательных полиморфных палочковидных бактерий определяли каталазную и оксидазную активность. Затем изучали ферментативные и биохимические характеристики с использованием биохимических стрипов для дифференциации бактерий.
При определении биохимических свойств использовали 48 -часовые бактериальные культуры, выращенные на кровяном агаре. Нами были определены наиболее важные показатели, учитываемые при идентификации орнитобактерий
При изучении ферментативных свойств нами было установлено, что О. rhinotracheale не редуцируют нитраты, не обладают каталазной и оксидазной активностью, уреазаотрицательны, положительны относительно В галактозидазы и аргининдегидролазы, отрицательны относительно лизиндекарбоксилазы и орнитиндекарбоксилазы, ферментируют фруктозу, лактозу, мальтозу, галактозу.
При изучении культуральных свойств установлено, что О. rhinotracheale не способны к росту на среде Эндо.
Для изучения с помощью сканирующей электронной микроскопии популяции О. rhinotracheale были получены путём культивирования на кровяном агаре при 37С. Исследование колоний О. rhinotracheale в сканирующем электронном микроскопе показало, что колонии представляют собой популяции однородных палочковидных клеток плотно упакованных, имеющих определенную ориентацию (рис.4). Клетки бактерий более мелкие по сравнению с эшерихиями, сальмонеллами и другими грамотрицательными бактериями.
С поверхности колонии в S-форме просматривается плотная упаковка бактерий в виде цепочек из нескольких клеток, плотно соединенных между собой. Нередко при малом увеличении наблюдались волнообразные скопления несколько изогнутых бактерий, что показывает сложность разъединения клеток в процессе их деления на две дочерние особи. Образование цепочек из неразделившихся клеток свидетельствует о первой фазе гетероморфизма, когда клеточная стенка может иметь дефектность, что затрудняет процесс разделения (рис.4).
