Содержание к диссертации
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫБактериальная контаминация - основной показатель безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов
Биологические характеристики L. monocytogenes
Экология листерий
Эпизоотология и эпидемиология листерий
Листерий в продовольственном сырье и пищевых продуктах
Методы индикации и идентификации листерий СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы и методы исследований
Результаты исследований
Культурально-морфологические и биохимические свойства популяции листерий на различных питательных средах
Изучение биологических особенностей листерий в популяции при различных температурных режимах культивирования
Изучение культурально-морфологических и биохимических свойств листерий, подвергнутых влиянию низких и отрицательных температур
Разработка метода индикации L.monocytogenes в продовольственном сырье и продуктах питания на основе ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
Введение к работе
Листериоз является природно-очаговым опасным инфекционным заболеванием человека и животных и представляет актуальную медиковетеринарную проблему.
Болезнь характеризуется множественностью источников возбудителя инфекции, многообразием факторов и путей его передачи, а также разнообразной клинической картиной (часто протекает в виде
нейроинфекции).
Начиная с 80-х годов прошлого века, листериоз привлекает к себе внимание в связи с регистрацией заболеваний людей, связанных с употреблением продуктов питания, контаминированных возбудителем листериоза. Так в США, Канаде, Мексике, Великобритании, Швейцарии, Франции и других странах были зарегистрированы крупные вспышки листериоза людей с высоким уровнем смертности при употреблении пищевых продуктов животного и растительного происхождения: молока, мягких сыров, мяса и мясных продуктов, квашеной капусты и др. [3, 69, 118, 119, 121, 131, 143, 147, 148, 157, 166, 172, 174]. К настоящему времени листериоз животных зарегистрирован в более чем 50 странах мира, где он наносит весьма существенный экономический и эпидемиологический ущерб.
Эпизоотическая ситуация по листериозу в нашей стране остается напряженной. Листериоз животных учитывается, начиная с 1956 года.
Регистрация и учет листериоза у людей, как самостоятельной нозологической формы, введена Минздравом Российской Федерации в 1992г. [60].
Согласно данным Управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по городу Москве за первое полугодие 2007 г. зарегистрировано 9 случаев заболевания листериозом, в том числе: среди беременных женщин с отягощенным акушерским и гинекологическим анамнезом зарегистрировано 3 случая листериоза, клинический листериоз (окулогландулярная форма) диагностирован у ребенка 9 лет, в январе 2007 года зарегистрировано два случая летального исхода у мужчин 61 и 65 лет.
В период с 2002 по 2006 г.г. в Архангельской области зафиксировано 30 случаев заболевания листериозом, по 1 случаю в Ленинградской и Мурманской областях, 11 случаев в Санкт-Петербурге [80].
Предположительно, при совершенствовании организации и методики проведения лабораторных исследований число зарегистрированных больных значительно возрастет [37, 69, 83].
Сельскохозяйственные животные заражаются чаще всего через воду, корма. К листериозу восприимчивы овцы, козы, крупный рогатый скот, свиньи, лошади, кролики, домашняя птица. Чаще болеют молодые животные.
Основной резервуар возбудителя в природе - грызуны [26].
Современные технологии переработки и хранения пищевых продуктов создают условия для контаминации и размножения листерий в продуктах питания, что приводит к эпидемическим вспышкам и спорадическим случаям листериоза [53].
Листерий способны накапливаться при хранении продуктов в бытовых холодильниках, когда многие другие бактерии гибнут или не размножаются и не составляют конкуренции для значительного увеличения микробной массы листерий. Такая особенность микробов объясняет распространенное название листерий как "микроб холодильника". В этой связи хранение зараженных пищевых продуктов в холодильниках не предотвращает, а часто, наоборот, способствует листериозу у людей при отсутствии дополнительной обработки таких продуктов. Аналогичным образом соление овощей, молочных и мясных продуктов, которое губительно для многих микробов, не препятствует размножению листерий, выдерживающих 6-20%-ные концентрации поваренной соли [13, 158, 198].
В настоящее время лаборатории, проводящие исследования пищевых продуктов на наличие листерий, руководствуются ГОСТ Р 51921-2002 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий L.monocytogenes». При этом выделение L.monocytogenes и окончательная идентификация этого патогена может составлять по времени до 14 суток, что осложняет исследование продуктов с ограниченным сроком годности.
Следует отметить возможность возникновения артефактных результатов в практике лабораторной диагностики листериоза. Например, некоторые бациллярные формы листерии принимаются за лактобациллы, а коккобациллярные формы за стрептококки [24].
Нередко идентификация листерии, как и многих других микроорганизмов, затруднена в силу популяционнои изменчивости их морфологических и биохимических свойств [72].
Для лабораторной практики наибольший интерес представляют ускоренные методы, такие как ИФА, ПЦР, ДНК-ДНК и ДНК-РНК гибридизация, радиоиммунологические методы исследования, использование хромогенных питательных сред [35, 119, 156, 165, 170, 171, 197, 203] . К достоинствам этих методов' следует отнести их высокую чувствительность и специфичность, кроме того их использование существенно сокращает время анализа, расход питательных сред и трудозатраты.
В связи с вышеизложенным, нами была определена цель - изучение биологических особенностей популяций L. monocytogenes и совершенствование индикации патогенных листерии в продовольственном сырье и продуктах питания.
Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:
1. Провести сравнительный анализ культуральных, морфологических и биохимических свойств популяций листерии, полученных на разных питательных средах при различных условиях культивирования;
2. Изучить культурально-морфологические и биохимические свойства популяций листерии, подвергнутых влиянию низких и отрицательных температур;
3. Разработать ускоренный метод индикации L.monocytogenes на основе иммуноферментного анализа (ИФА);
4. Испытать разработанный метод при мониторинговых исследованиях продовольственного сырья и пищевой продукции животного происхождения.
Научная новизна. Новизна выполненной работы заключается в том, что были изучены биологические особенности листерий на уровне микробной популяции, благодаря использованию в работе метода сканирующей электронной микроскопии, позволяющего изучать популяцию бактерий, не нарушая их естественной архитектоники. Показана зависимость морфологии клеток L.monocytogenes от состава питательной среды и режимов культивирования.
Установлено, что низкие и отрицательные температуры не влияют на морфологию клеток листерий, что связано с их психрофильными свойствами.
Однако при последующем культивировании популяций, подвергнутых длительному воздействию отрицательных температур, отмечается появление в популяции клеток на различных стадиях гетероморфизма.
Разработан ускоренный метод индикации L.monocytogenes с помощью ИФА, позволяющий в течение трех суток провести скрининговые исследования продовольственного сырья и продуктов питания, что актуально для бактериологических лабораторий, контролирующих качество продовольственного сырья и продукции животноводства.
Практическая ценность работы. На основании результатов исследований разработаны «Методические рекомендации по ускоренной индикации сальмонелл и Listeria monocytogenes в животноводческом сырье и продуктах питания с помощью тест систем LOCATE®SALMONELLA и LOCATE®LISTERIA» (утверждены Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 18 октября 2006г).
Исследования по теме данной диссертационной работы были проведены в лаборатории санитарной микробиологии ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии.
Приношу глубокую благодарность доктору биологических наук, профессору Павловой Инне Борисовне и кандидату ветеринарных наук старшему научному сотруднику Банниковой Дарье Андреевне за помощь при выполнении разделов по сканирующей электронной микроскопии.
Приношу глубокую благодарность доктору ветеринарных наук, профессору Кавруку Леониду Сергеевичу и кандидату ветеринарных наук старшему научному сотруднику Бритовой Софье Васильевне за помощь в работе.
Приношу глубокую благодарность директору ООО «Стайлаб», кандидату химических наук Галкину Александру Викторовичу, за предоставленную тест - систему.
