Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Разработка новых методов исследования гемосовместимых свойств материалов и изделий медицинского назначения 12
1.1. Процессы, протекающие на границе раздела биоматериал/кровьи методы их исследования (обзор литературы) 16
1.1.1. Адсорбция белков 16
1.1.2. Адгезия и активация тромбоцитов 17
1.1.3. Активация системы комплемента 21
1.1.4. Активация внутреннего пути свертывания крови 23
1.1.5. Специфика испытаний взаимодействия материалов с кровью
vitro в условиях связывания ионов кальция. Постановка задачи 28
1.2. Модификация гематологических методов для оценки гемосовме стимых свойств материалов и изделий медицинского назначения 29
1.2.1. Выбор объектов исследования 29
1.2.2. Активированное частичное тромбопластиновое время 34
1.2.3. Время рекальцификации плазмы крови 39
Глава 2. Ковалентная иммобилизация биологически-активных веществ, как способ повышения гемосовместимости медицинских материалов 57
2.1. Методы ковалентной иммобилизации биологически-активных веществ (обзор литературы). Постановка задачи 61
2.2. Гепаринсодержащие покрытия на основе пассивации поверхности биоматериалов белками 72
2.3. Особенности взаимодействия гепаринсодержащих покрытий с компонентами крови 78
Глава 3. Разработка материалов и покрытий, связывающих гепарин посредством комплексообразования 92
3.1. Материалы, образующие стабильный комплекс с БАВ (обзор литературы). Постановка задачи 94
3.2. Аминосодержащие поверхности 99
3.3. Синтетические гидрогелевые покрытия 107
3.3.1. Нанесение покрытия на материалы и изделия, предназначенные для контакта с кровью 108
3.3.2. Определение сорбционных свойств по гепарину и антикоагу-лянтной активности иммобилизованного гепарина 109
3.3.3. Изучение гемосовместимых свойств гидрофильного спирто-растворимого покрытия ГПМ 112
3.4. Спирторастворимое самогепаринизируемое покрытие 117
Глава 4. Материалы, имитирующие наноструктуру внутренней поверхности сосудов крови 128
4.1. Основные подходы к разработке материалов, имитирующих наноструктуру внутренней поверхности сосудов крови (обзор литературы). Постановка задачи 129
4.2. Материалы с гидрофильно-гидрофобной наноструктурой 135
4.3. Сульфированные поверхности 136
4.3.1. Сульфирование поверхности полиэтилена низкой плотности 136
4.3.2. Влияние параметров обработки на гемо совместимые свойства поверхности полиэтилена 141
Глава 5. Примеры практического применения результатов работы 148
5.1, Области применения разработанных гепаринизированных материалов и покрытий 148
5.2 Исследование тромборезистентных свойств полимерных биоматериалов 150
5.3. Гепаринизация гемодиализаторов 156
5.4. Гепаринизированные протезы кровеносных сосудов малого диаметра 161
5.1. Иммобилизация гепарина для повышения биосовместимости интраокулярных линз 166
Заключение 168
Выводы 174
Литература 176
Приложения 204
- Активация системы комплемента
- Гепаринсодержащие покрытия на основе пассивации поверхности биоматериалов белками
- Аминосодержащие поверхности
- Материалы с гидрофильно-гидрофобной наноструктурой
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Неповрежденная поверхность кровеносных сосудов, в отличие от искусственной поверхности, представляет собой активную атромбогенную поверхность за счет контролируемого выхода биологически активных веществ - простациклина, окиси азота и АДФазы, ингибирующих, например, активацию тромбоцитов [35, 77]. Помимо этого гепариноподобные высокосульфи-рованные вещества инкорпорированы в состав мембран эпителиальных клеток [35, 53, 77]. Определенную роль играет наличие на внутренней поверхности кровеносных сосудов доменной гидрофильно-гидрофобной наноструктуры, аналогичной существующей в циркулирующей крови. В результате на границе раздела внутренняя поверхность кровеносных сосудов/кровь поддерживается естественное равновесие между системами активации и ингиби-рования свертывания крови.
Повреждение внутренней стенки кровеносного сосуда или имплантация сосудистого протеза вызывает сдвиг данного равновесия, что может приводить, например, к тромбообразованию за счет активации внутренней системы свертывания крови, адгезии и активации тромбоцитов.
Для предотвращения фатальных последствий в результате тромбирования изделий медицинского назначения необходимо постоянное введение в кровоток веществ, препятствующих тромбообразованию: антикоагулянтов различной природы или биологически-активных веществ (БАВ), воздействующих на тромбоцитарное звено гемостаза.
Введение в кровоток антикоагулянтов сопровождается многочисленными побочными эффектами. Так гепарин (Гп) - наиболее распространенный в клинической практике антикоагулянт крови естественного происхождения -может вызывать кровотечения, особенно у пациентов высокого риска с язвами кишечника, перикардитами, многочисленными травмами или после хи-
рургических вмешательств. Другим недостатком применения антикоагулянтов является его воздействие на тромбоциты, индивидуальная вариабельность зависимости доза-эффект, гепарин индуцированная тромбоцитопения, ухудшение уремической анемии вследствие микротромбозов и скрытой кро-вопотери, а также влияние на метаболизм липидов и костей [213, 222].
Для нейтрализации антикоагулянтного эффекта гепарина и предотвращения постоперационного кровотечения используют введение антагониста гепарина - протамин сульфата (ПС). Хотя протамин и одобрен к клиническому применению, тем не менее, он токсичен и его использование сопровождается рядом побочных реакций: от средней тяжести гипотензии до тяжелого сердечно-сосудистого коллапса, вазодиляцией, брадикардией, аккумуляцией тромбоцитов в легких и рядом других [134, 179, 267].
Избежать или уменьшить отрицательные последствия за счет снижения концентрации антикоагулянтов в кровотоке возможно путем повышения ге-мосовместимости биоматериалов, применяемых для изготовления изделий медицинского назначения, предназначенных для контакта с кровью.
К характерному свойству гемосовместимых материалов относится отсутствие отрицательного воздействия на кровь или ее компоненты. Такие материалы (изделия) не должны: провоцировать образование тромбов и тромбоэмболии, активировать свертывающую, фибринолитическую системы и систему комплемента, оказывать отрицательное действие на белковые и форменные элементы крови, нарушать электролитический баланс крови и т.д.
Существует два основных пути повышения гемосовместимости медицинских изделий - создание новых материалов и модификация существующих материалов и изделий.
Попытки одновременно достичь оптимальных физико-механических и гемосовместимых свойств синтетических биоматериалов на стадии их синтеза успехом не увенчались. Поэтому в настоящее время модификация поверхности биоматериалов, обладающих необходимым комплексом физико-
механических свойств, является наиболее распространенным способом повышения гемосовместимости изделий медицинского назначения.
Свойства поверхности биоматериалов, такие как химизм, гидрофильно-гидрофобный баланс, заряд, морфология, доменная структура и др., способны влиять на стадию адсорбции белков и последующую реакцию клеток. Поэтому первоначально внимание исследователей было обращено на физические и химические способы модификации поверхности биоматериалов, позволяющие минимизировать активацию процессов свертывания крови.
Последние годы-наблюдается интенсивный рост исследований, связанных с разработкой биомедицинских материалов, способных имитировать те или иные свойства биологических структур, в том числе и характерные для внутренней поверхности кровеносных сосудов. Так широкое распространение лабораторной и клинической в практике получили методы модификации поверхности изделий биологически-активными веществами, позволяющими имитировать антикоагулянтную и антитромбоцитарную активность естественных сосудов крови. Сравнительно недавно выделилось направление, ориентированное на имитирование доменной наноструктуры сосудистой стенки, позволяющее эффективно подавлять процессы активации свертывания крови, индуцированные контактом с поверхностью биоматериалов.
Однако многие из предложенных методов модифицирования мало эффективны, либо технология из получения слишком сложна для промышленного ^ воспроизводства. Кроме того, практически отсутствует информация, касающаяся как специфики функционирования биологически-активных веществ в иммобилизованном состоянии, так и механизма взаимодействия белковых и клеточных компонентов крови с модифицированной поверхностью.
Цель исследования:
Целью данной работы было разработать, теоретически и экспериментально обосновать эффективные способы повышения гемосовместимости медицинских изделий, основанные на имитировании основных свойств внутренней поверхности кровеносных сосудов.
Задачи исследования
Сформулировать и экспериментально обосновать подходы к повышению гемосовместимых свойств материалов и изделий медицинского назначения.
Разработать метод оценки тромборезистентных свойств биоматериалов в условиях in vitro с использованием плазмы крови человека.
Провести сравнительный анализ влияния иммобилизации гепарина и ингибиторов агрегации тромбоцитов на изменение характера взаимодействия поверхности биоматериалов с компонентами крови.
Изучить механизм взаимодействия иммобилизованных биологически-активных веществ с белковыми и клеточными компонентами крови.
Разработать и исследовать биологические свойства аминосодержащих поверхностей и покрытий, обладающих аффинностью к гепарину, а также поверхностей с гидрофильно-гидрофобной наноструктурой.
Научная новизна исследования
Сформулированы и экспериментально обоснованы способы повышения гемосовместимости биоматериалов, основанные на имитировании биологической активности эндотелия и гидрофильно-гидрофобной наноструктуры клеточных мембран.
Разработан экспресс-метод оценки тромбогенности материалов и изделий медицинского назначения в условиях in vitro с использованием рекальци-фицированной плазмы крови человека.
Показано, что ключевую роль во взаимодействии гепариыизированнои поверхности с белковыми и форменными компонентами крови играет относительное количество гепарина, сохранившего свою активность в результате иммобилизации;
Установлено, что причиной повышения гемосовместимости покрытий в присутствии ингибиторов агрегации тромбоцитов является изменение характера адсорбции белков; а не ингибирование процессов активации клеток.
Показано, что для максимально прочного связывания гепарина целесообразно использовать биоматериалы и покрытия с третичными аминогруппами.
Практическая значимость
Метод с использованием рекальцифицированной плазмы крови человека повышает достоверность оценки тромборезистентных свойств поверхности биоматериалов в условиях in vitro.
Предложенные способы модифицирования поверхности биоматериалов, основанные на имитировании гидрофильно-гидрофобной наноструктуры клеточных мембран, позволяют существенно повысить их био- и гемосовме-стимые свойства.
Разработано три вида модифицирующих покрытий (на основе аргинина, полимочевины и полиамина) с высокой аффинностью к гепарину, обладающих хорошей адгезией к широкому кругу материалов синтетического и биологического происхождения.
Разработанные методы гепаринизации не только улучшают тромборези-стентные свойства поверхности различных изделий медицинского назначения, но и дают возможность снизить уровень системной гепаринизации.
Пути практической реализации результатов работы
Методы модифицирования поверхности биоматериалов, основанные на имитировании биологической активности эндотелия, а также гидрофильно-гидрофобной наноструктуры клеточных мембран, могут быть внедрены на предприятия, выпускающие катетеры, гемодиализаторы, протезы кровеносных сосудов, оксигенаторы крови, интраокулярные линзы, биологические сосудистые протезы малого диаметра и т.д.
Метод с использованием рекальцифицированной плазмы крови человека может быть применен в лабораторно-клинической практике для скриниг-ана-лиза образцов материалов медицинского назначения, а также для оценки эффективности технологии модификации их поверхности. В настоящее время данный метод внедрен в практику испытательной лаборатории биологической безопасности медицинских изделий Центра по исследованию биоматериалов ФГУ НИИТиИО Росздрава.
Апробация работы
Материалы и основные положения диссертации изложены на:
2-м научно-техническом семинаре «Гемо- и биосовместимые материалы» (Суздаль) в 1990 г.;
Международном семинаре « Искусственные органы: теория и практика применения мембран в гемодиализе и плазмаферезе» (Варшава, Польша, 1992);
11-ой ежегодной конференции по исследованиям в области биомедицинской инженерии Хьюстонского общества по инженерии в медицине и биологии (Хьюстон, США, 1993 г.);
39-м ежегодном заседании ASAIO (Новый Орлеан, США, 1993 г.);
Международном симпозиуме «Биоматериалы и системы доставки лекарств» (Сеул, Корея, 2000 г.);
Российско-американском научно-техническом семинаре «Биоматериалы: разработка, исследование, применение», (Саров, 2000 г.)
1-м, 2-м и 3-м Всероссийских съездах по трансплантологии и искусственным органам, (Москва, 1998, 2002, 2005 гг.);
5-м семинаре научного консультативного комитета ISTC «Нанотехнологии в области физики, химии и биотехнологии», (Санкт-Петербург, 2002 г.);
~ ХХХ-ом ежегодном конгрессе ESAO (Краков, Польша, 2003 г.);
- Х1-ой научно-технической конференции: Вакуумная наука и техника (Су
дак, Украина, 2004 г.)
Публикации
Результаты проведенных исследований отражены в 40 печатных работах в отечественной и зарубежной печати, 4 патентах и авторских свидетельствах на изобретение.
Активация системы комплемента
Система комплемента состоит из 21 сывороточного белка глобулиновой природы и является составной частью системы гуморального иммунного ответа. Компоненты комплемента свободно циркулируют в крови в форме неактивных предшественников, которые активируются в строго определенном порядке специфическими медиаторами и приобретают свойства ферментов. Существуют два пути активации системы комплемента: классический и альтернативный. Классический путь активируется в основном комплексами им 22 муноглобулинов G (IgG) и M (IgM) с соответствующими антигенами. Альтернативный путь активирует терминальные компоненты классического пути, начиная с СЗ до С9.
Адсорбируясь на поверхности, белковые компоненты комплемента претерпевают конформационные изменения, инициирущие его активацию в результате контаїста с биоматериалом. При этом включаются и классический, и альтернативный пути. Можно говорить лишь о предпочтительной активации того или иного пути для различных полимеров.
Степень активации комплемента поверхностью биоматериалов определяет их гемосовместимость, по крайней мере, по трем причинам: 1. Активированный комплемент является медиатором хемотаксиса и адгезии лейкоцитов к чужеродной поверхности. Активация по альтернативному пути приводит к высвобождению хемотаксических факторов СЗа и С5а. Это способствует адгезии полиморфоядерных лейкоцитов, которые стимулируют адгезию тромбоцитов, что может привести к образованию пристеночного тромба; 2. Активированный комплемент вызывает агрегацию тромбоцитов и связывает лейкоциты; 3. Активированный комплемент способствует образованию лейкоцитарно тромбоцитарных эмболов, которые находят в легочной ткани больных после искусственного кровообращения без микроагрегатных фильтров. Активация системы комплемента in vitro зависит от ряда факторов: при роды материала, удельной площади исследуемой поверхности, инкубацион ной среды (кровь, плазма, сыворотка), времени и температуры инкубации.
Для определения активации системы комплемента, индуцированной контактом с поверхностью биоматериалов, в работе был использован метод, основанный на регистрации изменения времени полулизиса сенсибилизированных эритроцитов барана в результате инкубации сыворотки крови с исследуемым материалом (См. Приложение 1, Раздел 5). 1.1.4. Активация внутреннего пути свертывания крови.
Контактная система свертывания крови состоит из четырех белков, находящихся в плазме крови в виде проферментов (зимогенов): фактор XII (Ха-гемана, фХП), прекалликреина (фактор Флетчера, ПКалл), фактора XI (фХ1) и высокомолекулярного кининогена (ВМК). Ключевая роль в контактной активации принадлежит фХП. При этом контактная система свертывания крови обладает всеми признаками системы с положительной обратной связью [241, 262].
В циркулирующей крови имеет место спонтанная активация контактной системы (внутреннего пути свертывания крови), протекающая крайне медленно [241], однако в значительной степени ускоряющаяся в результате контакта с чужеродной поверхностью [118]. Механизм такого ускорения состоит в конформационных изменениях, претерпеваемых в процессе адсорбции ферментами контактной фазы и в первую, - в результате чего облегчается перевод профермента в активную форму [241]. Кроме того, в зависимости от природы материала поверхность может обладать более высокой аффинностью к белкам внутреннего пути свертывания крови, чем к ингибиторам протеаз, что также объясняет ускорение коагуляции в присутствии биоматериалов [225, 241].
Контактная активация стимулируется гидрофильными, отрицательно заряженными поверхностями [198,226,241]. Тот факт, что стекло - потенциальный активатор фактора XII - известен уже очень давно [168].
Изучение адсорбции белков, участвующих в контактной активации свертывания крови, показало [256], что гидрофильный отрицательно заряженный материал адсорбирует повышенное количество фХП и высокомолекулярного кининогена, а гидрофобный - фибриногена.
Следовательно, механизм активации внутреннего пути свертывания крови, индуцированного контактом с чужеродной поверхностью различен для гидрофильных и гидрофобных материалов: гидрофильные материалы активируют свертывающую систему преимущественно активацией фХП, а гидрофобные - за счет активации системы калликреин/кинин [168,263].
Для изучения активации процессов свертывания в результате контакта с чужеродной поверхностью привлекают ряд методов, получивших широкое распространение в лабораторно-клинической практике. Результаты оценки биологической безопасности медицинских изделий, полученные с привлечением методов классической гематологии, непосредственно отражают индуцированное влияние чужеродной поверхности на свертывающую и антисвер-тывающую системы крови.
Наиболее часто применяют модифицированное время Ли-Вайта [8,70,136, 182]. При исследовании свойств полимерного материала по описанной методике исследуемому образцу придают форму пробирки или наносят на внутреннюю поверхность стеклянной пробирки или заполняют кровью внутренний объем изделий в виде трубок [247]. Активацию процессов свертывания оценивают также, останавливая коагуляцию добавлением антикоагулянта после заданного периода инкубации с поверхностью биоматериала [244,247].
При использовании не стабилизированной крови имеет место ряд факторов, воздействующих на процессы свертывания в условиях in vitro: спонтанная активация при заборе, травма крови при переносе из контейнера в контейнер, наличие границы с воздухом, перемешивание (встряхивание) крови [244,247]. К существенным недостаткам следует отнести малую производительность методов с применением не стабилизированной крови, поскольку она не может храниться in vitro до начала эксперимента даже в течение нескольких минут.
Гепаринсодержащие покрытия на основе пассивации поверхности биоматериалов белками
В качестве отправной точки исследования был выбран подход к иммобилизации гепарина, заключающийся в последовательной обработке поверхности биоматериалов растворами сывороточного альбумина и гепарина с последующей стабилизацией адсорбированного комплекса белок-гепарин глю-таровым альдегидом [1]. Этот подход основан на способности белков плазмы крови к образованию необратимо адсорбированного слоя на поверхности материалов медицинского назначения, а также к кооперативным взаимодействиям с веществами различной природы.
Среди фармакологических агентов, применяемых в клинической практике для контроля агрегации тромбоцитов, нами были выбраны ацетилсалициловая кислота (АСК) и дипиридамол (Дп). При модификации поверхности биоматериалов ингибиторы агрегации тромбоцитов добавляли непосредственно в раствор Гп.
На рисунке 16 приведена зависимость количества Гп, иммобилизованного на поверхности различных биоматериалов - полиэтилена медицинского (ПЭ), поливинилхлорида (ПВХ) и полиуретана «Витур» (ПУ),- от концентрации ацетилсалициловой кислоты и дипиридамола в бинарной смеси с гепарином (далее обозначены Полимер-СА-Гп-АСК и Полимер-СА-Гп-Дп, соответственно).
Зависимость количества иммобилизованного гепарина от концентрации ингибиторов агрегации тромбоцитов в бинарной смеси. Поскольку ацетилсалициловая кислота в растворе заряжена отрицательно, ее введение в рабочий раствор на стадии обработки биоматериалов приводит к уменьшению общего количества иммобилизованного гепарина в результате конкуренции двух отрицательно заряженных компонент за места связывания на альбуминизированной поверхности (См. рис. 16).
Дипиридамол содержит в своей структуре 8 аминогрупп (Рис. 17), придающих молекуле положительный заряд при физиологических значениях рН. Введение дипиридамола в раствор гепарина значительно повышает количество иммобилизованного антикоагулянта за счет увеличения положительного заряда альбуминизированной поверхности, что способствует концентрированию гепарина в приповерхностном слое.
Обнаруженный эффект зависит от природы модифицируемого материала. В результате добавления Дп концентрация Гп на поверхности увеличивается в случае ПЭ и ПУ на 40 и 50%, соответственно, и более чем вдвое для ПВХ (См. рис. 16). Кроме того, кривая зависимости количества иммобилизованного гепарина от концентрации дипиридамола в случае ПУ и ПЭ выходит на плато при концентрации дипиридамола 0,3 - 0,5 мг/мл, а в случае ПВХ - не достигает насыщения при концентрации Дп 1,0 мг/мл.
Помимо основных массовых белков (СА, ФГ, глобулинов, и др.) в плазме крови присутствуют белки, обладающие специфической способностью к связыванию гепарина (фибронектин, витронектин, гепарин кофактор 2, гепарин связывающие факторы роста и др.) [52,70]. Было предложено использовать это свойство белков плазмы крови для концентрирования Гп в приповерхностном слое путем замены раствора СА на плазму крови человека (далее обозначены Полимер-Пл-Гп).
Для оценки активности иммобилизованного гепарина был привлечен метод АЧТВ (См. Приложение 1, раздел 1.2.). Регистрировали изменение времени свертывания плазмы крови, как в присутствии модифицированной поверхности, так и плазмы после контакта с гепаринизированным образцом. В первом случае увеличение времени свертывания происходит за счет суммарной активности иммобилизованного и десорбированного (в результате контакта с плазмой крови) гепарина, а во втором - только за счет десорбированного Гп. Разность между активностью гепарина в первом и втором случае равна активности поверхностно-связанного антикоагулянта. Результаты суммированы в таблице 11.
Помимо общего количества иммобилизованного гепарина, важной характеристикой является его устойчивость к десорбции при контакте с кровью. Наибольшая устойчивость свойственна образцам с гепарином, ковалентно иммобилизованным непосредственно на поверхности полимерных материалов (См. табл. 11).
Другой важной характеристикой гепаринизированной поверхности является степень сохранения иммобилизованным гепарином своей активности (Табл. 12). В результате фиксации на поверхности биоматериалов лишь часть молекул Гп сохраняет свою активность (См. Главу 1, раздел 1.2.). Для оценки степени инактивации гепарина в результате иммобилизации было предложено рассчитывать долю активного гепарина (ДАГ), равную доле молекул Гп, сохранивших свою активность в поверхностно-связанном состоянии и выраженную в % от общего количества иммобилизованного гепарина. Таблица 12.
Добавление Дп в раствор гепарина сопровождается не только повышением общего количества иммобилизованного гепарина, устойчивости его к десорбции, но и ДАГ (См. таблицу 12). В этом случае активность гепарина на поверхности значительно больше, по сравнению с обработкой СА-Гп и СА-Гп-АСК.
Замена СА на плазму сопровождается формированием покрытия с наибольшей среди изученных образцов концентрацией активного гепарина, поскольку количество связанного антикоагулянта и ДАГ велики, а десорбция его при контакте с плазмой - минимальна (См. табл. 11,12).
Аминосодержащие поверхности
Для исследования влияния природы аминогруппы на характер взаимодействия модифицированной поверхности с гепарином нами были синтезированы модельные образцы на основе шлифованных предметных стекол (ТУ 26-76).
Полученные модельные аминосодержащие материалы имеют сходные морфологию и физико-химические свойства поверхности, но отличаются природой концевой функциональной аминогруппы: первичной в случае Ст-Ам1 и третичной - Ст-АмЗ. Как и в случае Ст-Ам1 образец Ст-Ам2 содержит концевую первичную аминогруппу, но удаленную на большее расстояние от поверхности подложки, следовательно, обладающую большей подвижностью. Кроме того, плотность положительного заряда поверхности Ст-Ам2 в ряду синтезированных модельных материалов наибольшая, так как его «ножка» содержит дополнительно две вторичных аминогруппы в основной цепи (суммарно три аминогруппы: две вторичные в середине и первичная аминогруппа на конце «ножки»). Таким образом, помимо природы концевой аминогруппы, варьировали подвижность концевой функциональной группы (длина углеводородной «ножки») и суммарную плотность положительного заряда поверхности.
Адсорбцию гепарина, меченного флуоресцеином изотиоцианатом, из его индивидуального раствора в дистиллированной воде, фосфатном буфере солевом (ФСБ, pKN 7,4) или разбавленной (1:50) плазме крови человека регистрировали методом флуоресценции полного внутреннего отражения при комнатной температуре в течение 1000 с (См. Приложение 1, раздел 2.2). После чего гепарин, слабо связанный с поверхностью, отмывали в течение 200 с. с использованием соответствующего раствора. Отметим, что стадия адсорбции Гп из индивидуального раствора на поверхности амино-содержащих образцов с последующей отмывкой слабо связанного антикоагулянта совпадает с заключительным этапом производства гепаринизи-рованных изделий медицинского назначения.
Для калибровки метода было необходимо определить количество адсорбированного Гп и соотнести его с интенсивностью сигнала флуоресценции меченого гепарина. Количественно гепарин определяют с применением спектрофотометрического метода, определяя количество красителя (толлуидинового синего), связывающегося с отрицательно заряженными группами (сульфо- и карбоксильными) иммобилизованного гепарина (См. Приложение 1, раздел 1.1.). Однако в данном случае измерить адсорбцию гепарина на аминосодержащих материалах оказалось не возможно из-за высокого неспецифического связывания толлуидинового синего с подложкой (стеклом). Поэтому экспериментальные результаты представлены в относительных единицах интенсивности сигнала флуоресценции, пропорциональных количеству адсорбированного Гп.
Как правило, активность коммерческого сухого препарата гепарина составляет 150-200 ед/мг. В клинической практике, применяют концентрации Гп в диапазоне от 2 до 20 ед/мл [25,77], что соответствует концентрации 0,01-0,1 мг/мл. С другой стороны при гепаринизации поверхности материалов используют рабочие растворы с концентрацией антикоагулянта порядка 1,0 мг/мл. Поэтому при исследовании адсорбции Гп из модельных сред его концентрации в растворе варьировали в диапазоне от 0,1 мг/мл до 1,0 мг/мл. Применение растворов меченого гепарина с концентрацией меньше 0,1 мг/мл не позволяло достоверно регистрировать количество адсорбированного антикоагулянта из-за низкой интенсивности сигнала флуоресценции и высокого соотношения сигнал/шум.
Количество гепарина, адсорбированного на поверхностях Ст-Ам1 и Ст-Ам2, одинаково (в пределах чувствительности метода), несмотря на большую подвижность концевой аминогруппы и увеличенную плотность поверхностного заряда в случае Ст-Ам2. В то же время замена концевой аминогруппы с первичной на третичную (Ст-АмЗ) приводит к многократ 102 ному повышению количества антикоагулянта, связанного с поверхностью.
В дальнейших экспериментах концентрацию гепарина фиксировали равной ОД мг/мл. Заметим, что такая концентрация антикоагулянта (ОД мг/мл или 15-18 ед./мл) применяется для системной гепаринизации пациентов во время операций, сопровождающихся использованием аппаратов вспомогательного кровообращения.
В различных изделиях медицинского назначения взаимодействие Гп с чужеродной поверхностью происходит в широком диапазоне сдвиговых скоростей: 0-5 с"1 в областях застоя до 3000 с"3 в капиллярах гемодиализа-торов.
Как видно из рисунка 19, количество адсорбированного Гп не зависит от величины сдвиговой скорости для всех типов аминогрупп. В тоже время количество гепарина, связанного с третичной концевой аминогруппой (Ст-АмЗ) в несколько раз больше по сравнению с образцами, содержащими первичные аминогруппы (Ст-Амі к Ст-Ам2). При этом увеличение длины «ножки» и плотности заряда при переходе от Ст-Амі к Ст-Амг не сказывается на количестве адсорбированного Гп.
Материалы с гидрофильно-гидрофобной наноструктурой
Обработка поверхности стекла органо сил океанами с различными функциональными химическими группами на конце углеводородных радикалов [-(СІ-І2)п-] позволяет получить материалы, отличающиеся степенью гидрофильности и зарядом поверхности и как следствие различной тромбогенностью. Однако покрытия, полученные обработкой поверхности стекла индивидуальным раствором органосилоксана, однородны и не являются истинно гидрофильно-гидрофобными наноструктурами. Для создания реальной гидрофильно-гидрофобной наноструктуры нами было предложено проводить обработку поверхности стекла из смеси органоси-локсанов с гидрофобными аллильными ( СГ-Алл, Э = 82,6 ± 4,4) и более гидрофильными меркапто (СГ-Мер, 0 = 66Д ± 1,8) концевыми функциональными химическими группами. В результате был получен образец СГ-(Алл+Мер) промежуточной гидрофильности (9 = 74,6 ± 3,9), содержащий на поверхности гидрофильные и гидрофобные нанодомены.
Образование на поверхности стеклянных гранул мозаичной гидрофильно-гидрофобной наноструктуры сопровождается повышением тром-борезистентности модифицированных образцов: критерий ОПТ; для СГ-(Алл+Мер) значительно ниже, по сравнению с СГ-Мер и СГ-Алл. Кроме того, в случае СГ-(Алл+Мер) значения ОПТ0 и ОПТтр практически не отличаются, что свидетельствует об отсутствии в этом случае вклада активации тромбоцитарного звена гемостаза в процесс свертывания крови, индуцированный контактом с чужеродной поверхностью.
Чтобы охарактеризовать функциональный состав модифицированного ПЭНП использовали метод ИК МНПВО.
На рисунке 29 а,б приведены разностные спектры ИК МНПВО двух образцов полиэтилена с различной степенью сульфирования поверхности: максимально достижимой (3,2 нМ/см") и низкой (0,3 нМ/см ), полученных вычитанием спектра исходного полиэтилена их спектров соответствующих сульфированных образцов .
Образцы с низкой степенью сульфирования демонстрируют на поверхности меньшую концентрацию кислых групп: сульфо- (-O-S02-0 , дублет 1248, 1218 см"1 и 1059 см"1) и карбоксильных (-СОО" 1715 см"1) (Рис. 29а), а гидроксильные группы (-ОН, 3200-ь3400 см"1) на их поверхности практически отсутствуют (Рис. 296).
Другой возможной причиной повышения концентрации свободного гидроксила, на наш взгляд, может служить гидролиз эфира серной кислоты в результате отмывки сульфированного образца в дистиллированной воде.
Таким образом, обработка поверхности полиэтилена раствором перманганата в концентрированной серной кислоте позволяет получить ряд модельных материалов, отличающихся концентрацией и соотношением гидрофильных функциональных групп на их поверхности.
При этом образцы с низкой степенью сульфирования могут рассматриваться, как материалы с гидрофильно-гидрофобной наноструктурой, где роль гидрофильных нанодоменов играют иммобилизованные на поверхности гидрофильные группы (сульфо-, карбокси-, гидрокси-), а гидрофобных нанодоменов - участки поверхности полиэтилена, не содержащие привитых функциональных групп.
При контакте ПЭНП с бестромбоцитарной плазмой значение ОПТ0, отражающего активацию внутреннего пути свертывания крови, увеличивается с ростом степени сульфирования поверхности (См рис. 30). Быстрый рост ОПТ0 при повышении концентрации сульфогрупп от 0 до 0,6 нМУсм2 сменяется незначительным изменением величины ОПТ0 в диапазоне кон 142 центраций сульфогрупп 0,6 - 1,7 нМ/см . Дальнейшее повышение степени сульфирования вновь сопровождается ростом ОПТ0. Зависимость степени тромбогенности поверхности с учетом вклада активации тромбоцитарного пути гемостаза (ОПХф) от степени сульфирования поверхности полиэтилена носит выраженный экстремальный характер (См. рис. 30) с локаль-ным минимумом при концентрации сульфогрупп, равной 0,6 нМ/см .
Как видно из рисунка 31, основным белком, адсорбирующимся на поверхности как исходного, так и сульфированного ПЭЫП, является фибриноген. Несмотря на то, что ФГ относится к классу «тромбогенных» белков, преимущественная адсорбция которых снижает тромборезистентность поверхности, обнаружена отрицательная корреляция между количеством адсорбированного ФГ и параметром (ОПТ0) с коэффициентом корреляции, равным - 0,98 (Р 0,0005). Такая же корреляция обнаружена между параметром (ОПТ0) и суммарным количеством адсорбированных белков (коэффициент корреляции - 0,96, Р 0,0005).
Похожие диссертации на Сравнительный анализ способов повышения гемосовместимости медицинских изделий
