Введение к работе
Актуальность работы. Одной из задач молочной отрасли является азработка эффективных безотходных технологий переработки молочного ырья. Перспективным направ л 'ием. применения нетрадииионного и вто-ичного молочного сырья являете*» биотехнология клеток млекспитаю-их. Использование составных частей молока при конструировании пи-ательных сред для выращивание клеток тканевых культур поставило еред исследователями задачу разработки новых перспективных техно-огий выделения биологически активных веществ из молочного сырья, аиболее богатым источником биологически активных веществ являете" ак называемое первое молоко - молозиво, которое не используется технологии молочных продуктов. Промышленное животноводство, при отором в хозяйствах концентрируется большое поголовье коров,про-сходят круглогодовые отелы, а также наличие низкотемпературных ефрижераторов, позволяют получать и стабилизировать глубоким за-ораживанием значительное количество молозива. Таким образом, соз-ались необходимые условия по целенаправленному исследованию, про-лшленной разработке и испытанию биологических препаратов из моло-ява, к числу которых относится фибронектин - димерный гликопроте-1 - фактор клеточной адгезии, присутствующий во всех биологичес-лх жидкостях организма IJcijr>ada.K.,Olelei7к.лЛЬ/. Важность исследо-аний по выделению фибрснектина из молозива по сравнению с плазмой зови обусловлена тем, что молезиво имеет высокое содержание имму-зглобулинов и, в связи с этим, достаточно высокую бактерицидную {тивность. Б молозиве и молоке отсутствуют такие опасные вирусы їк Альпгеймера, гепатита В и др., что несомненно важно для гаран-'.й от загрязнения готового препарата и дальнейшего его испельзо-шия в биотехнологии клеточных культур.
К началу наших исследований данные по содержанию фибронектина молочном сырье были единичными / ііЧгІлгг^-К.d оЛ 19Ы/, а по вы-ілению его из сыворотки молозива и последующему использованию от-'тствовали. Цельо данного исследования является:
Разработка технологии фибронектина из молозива (М?н), выявление :ловий его иммобилизации на полимерной матрице и культивирование :еток животных с использованием МФн и гидролизата сывороточных ілков молока /ГСБМ/.
В соответствие с поставленной целью решались следующие основные дачи:
определение параметров процесса выделения Мін, изучение его физико-химических и функциональных свойств;
разработка технологической схемы и регламента на получение М<Ен;
определение эффективных условий реализации функциональных свойств МЯн;
изучение возможности применения М$н в биотехнологии клеточных кул тур.
Научная новизна. Определена возможность использования молозива в качестве нового сырья для получения фибронектина - фактора адгезии клеток тканевых культур. Научно обоснованы и определены параметры выделения белка из сыворотки молозива. Установлена зависимость выхода МЯн от температуры, рН процесса выделения,типа и емкости сорбента. Показана зависимость содержания фибронектина в молози ве от периода лактации і наибольшее количество МЗу содержится в моло зиве первого дня лактации. Получены данные об основных свойствах молочного фибронектина. Показано влияние концентрации Мїн на его функцию как фактора адгезии клеток животных. Выявлена эффективность действия Мїн, иммобилизованного на полимерной матрице, как фактора адгезии клеток.
Практическая значимость работы. На основании проведенных экспериментальных исследований разработана технология получения фибронек на из молозива, которая отражена в технологическом регламенте на по лучение препарата "Фибронектин молочный для научно-исследовательских и биотехнологических целей" /согласовано с Сибирским научно-исследовательским и проектно-технологическим институтом переработки сельскохозяйственной продукции РАСХН/. Полученный Жн прошел испыта ния в качестве фактора адгезии на первичных и перевиваемых линиях клеток животных /Акт испытаний М?н от 12.02.92; справка об использовании результатов научно-изыскательской работы по применению ППС для культивирования клеток животных модифицированного іДСн, выданная Всесоюзным институтом экспериментальной ветеринарии от 21.02.92 г.; акт о внедрении МЗн в составе питательных сред и в качестве субстратов для иммобилизации клеток печени животных, утвержденный Центральным научно-исследовательским институтом гастроэнтерологии/
Разработаны рекомендации по составу и режимам получения ППС для иммобилизации М^н и культивирования клеток млекопитающих, а также предложены способы использования .% в методах клеточных культур. Определена возможность использования ППС-М'Тн в качестве носителя для иммобилизации клеток печени животных и показана способность ППС і^н обеспечивать нормальный рост клеток ЩС и СПЭВ в отечественных
средах на основе ГСЕМ,содержащих 1% сыворотки крови.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на:
Третьем Всесоюзном Совещании "Культивирование клеток животных и человека" /Пущино, 1990/;
Всесоюзной научно-технической конференции "Итоги и перспективы использования природных и синтетических высокомолекулярных соединений в производстве пищи" /Суздаль, 1991 г./;
Всесоюзной конференции "Химические превращения пищевых полимеров" Аветлогорск, 1991 г./;
УШ Всесоюзной научно-технической конференции "Синтетические латек-сы, их применение и модифицирование" /Воронеж, 1991 г./.
Публикации. По теме диссертации опубликовано шесть работ.
Структура работы и ее объем. Диссертация состоит из Еведения, пяти глав, выводов, списка цитируемой литературы. /Л .
Работа содержит: /№ страниц машнописного текста, 2?, таблиц, 23 рисунков, О приложений.
Объекты и методы исследований. Экспериментальные исследования выполняли в ПНИЛГМиПП Московской Государственной Академии прикладной биотехнологии,в лаборатории биотехнологии клеточных культур и технологии питательных сред Всесоюзного института экспериментальной ветеринарии /ВИЭВ/, в лаборатории интенсивной печеночной терапии Ценіральнсго научно-исследовательского института гастроэнтерологии
/цнииг/.
Объектами исследований служили: молозиво и молоко крупного рогатого скота первого месяца лактации. При разработке полимерного пленочного субстрата использовали латексний плєнкообразователь пищевой марки - ВХБД-65"В", представляющий собой водную дисперсию жесткопеп-ного сополимера винилиденхлорида с винилхлоридом, стабилизированную эмульгатором, алкилмоносульфонатом натрия /Е-30/ в концентрации 1,0-1,4 мае.52. В качестве модифицирующих добавок служили: медицинский поливинилпирролидон /ПВП/ с молекулярной массой М= 12500, /МРТУ 423Э2Ь-71/; желатина /ТУ 64-7224-83/. В работе использовали первичные и перевиваемые линии клеток животных. Первичные линии клеток выделяли из кишечника эмбриона свиньи /КЭС/; тее-тикул ягненка ДЯ/; сердца ягненка /СЯ/; печени свиньи /ПС/; печени щенка собаки /ПцС/. Перевиваемые линии клеток - почки плода свиньи /СПЗВ/; почки теленка /ПТ-60/; трахеи эмбриона коровы /TR/; щитовидной железы свиньи /ІДС/; мышиных фибробластов /WH-3T3/. Первичные культуры клеток готовили в лаборатории биотехнологии клеточных культур
и технологии питательных сред Всесоюзного института экспериментальной ветеринарии /ВИЭБ/ и лаборатории интенсивной печеночной терапии центрального института гастроэтерологии. Перевиваемые клеточные культуры были получены из коллекции клеточных культур ВИЭВ. Культивирование проводили с использованием питательных сред и растворов: 0,Е$ гидрояиэата сывороточных белков молока на растворе Хенкса /ТСШ/, среды Игла и 199, сыворотки крови телят. Фибронектин /МФн/ выделяли методом аффинной хроматографии из сыворотки молозива, после отделения жировой фракции центрифугированием, казеина - кислотным методом коагуляции. Очистку проводили диализом против бидис-тиллированной воды, фосфатного буфера рН 7,4 , 4 С, концентрировали МЗн сульфатом аммония, обессоливали гель - фильтрацией на сефа-дексе & -25.
Количество МФн определяли спектрофотометрически при 230 ям на приборе " Spekot-cL М 400" и с помощью реакции пассивной гемаг-глютинации на желатинизированных эритроцитах; аминокислотный состав М$н - на аминокислотном анализаторе «&Coit-e/ii.k ^С_5000 /ЗРГ/;молекулярную массу, электрофоретическую чистоту и подвижность МФн - методом электрофореза в Ь% полиакриламидном геле с 0,1 ДСН по Леммли. Изоэлектрическую точку /ИЭТ/ М5н определяли методом изоэлектрического фокусирования /ЮФ/ с использованием амфолита-носителя с диапазоном рН 3,8-8,9 фирмы LKB /Швеция/ на приборе фирмы LYSt-Pwdacle/-, функциональную активность Ші определяли по гепаринсвязывающему компоненту на гепарин-сефарозе 6В фирмы Jigma /США/; по реакции пассивной гемагглютинации на желатинизированных эритроцитах /Овчарук И.Н. и др. 1990/; по адгезивной активности клеток, которая определялась по количеству прикрепившихся клеток на поверхность субстрата /Дьяконов Л.П. и др., 1986/. Пролифератив-ную активность клеток оценивали по индексу пролиферации /Дьяконов Л.П. и др., 1986/. Степень чувствительности культур к вирусам по методу KatciL^-MttcniA-H^. 1938). цитологические исследования проводили согласно методикам, описанным Дьконовым Л.П. и др. /1986, 1988 г.г./. Математическую обработку экспериментальных данных осуществляли с помощью методов математической статистики и с применением ЭЕМ "Искра-1030".
