Введение к работе
з
Актуальность работы. В настоящее время насчитывается около 60 наследственных заболеваний, связанных с нарушением обмена аминокислот. Наиболее распространенным таким заболеванием является фенилкетонурия. В его основе лежит нарушение активности фермента фенилаланин-4-гидроксилазы, осуществляющей превращение фенилаланина в тирозин. Данное заболевание (при несвоевременном лечении) довольно быстро прогрессирует и приводит к тяжелым поражениям центральной нервной системы и инвалидизации больного.
До настоящего времени единственным эффективным методом лечения фенилкетонурии является диетотерапия, построенная по принципу резкого ограничения количества фенилаланина, поступающего с пищей. С этой целью из рациона исключают продукты с высоким содержанием соответствующей аминокислоты. Адекватной заменой их служат специализированные продукты на основе смеси аминокислот или белковые эквиваленты с минимальным содержанием фенилаланина. В Российской Федерации имеется государственный заказ на обеспечение детей, страдающих фенилкетонурией, специальным питанием для предотвращения развития у них умственной отсталости. Подобная реабилитационная деятельность со стороны государства в несколько раз дешевле, чем пожизненное пенсионное обеспечение таких больных и содержание их в стационарных учреждениях.
Традиционная технология получения продуктов для лечения таких больных основана на селективной адсорбции или мембранном фракционировании частичных гидролизатов белка. Расщепление полипептидной цепи молекулы белка проводят протеазами, при этом степень гидролиза достигает 30-60%, что не обеспечивает полного удаления фенилаланина из полипептиднои цепи. В результате проведения последующей стадии - адсорбции или мембранного фрак-ционорования не является достаточно эффективным, поскольку при этом могут быть удалены молекулы фенилаланина, находящиеся исключительно в свободном состоянии. Кроме того, на поверхности сорбента остается значительное количество аминокислот, что вызывает необходимость подбора соответствующих элюентов для их удаления с поверхности, а в последующем ведет к дополнительному обогащению синтетическими аминокислотами полученных гидролизатов до физиологических потребностей организма больного.
Вклад в практическое освоение технологии продуктов специализированного питания для больных фенилкетонурией внесли К.С. Ладодо и В.И. Круглик. Однако проблема разработки технологии отечественных ферментативных гидролизатов белка с низким содержанием фенилаланина продолжает сохранять свою актуальность. В связи с этим необходимо разрабатывать новые подходы к получению таких продуктов, которые будут более экономичными по сравнению с существующими, обеспечат полное удаление фенилаланина из реакционной смеси. Работа выполнена в рамках Федеральных целевых программ «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009 -2013 годы» и «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы».
Цель и задачи исследований. Целью является исследование и разработка
технологии биотрансформации фенилаланина из белков молока и разработка
технологии молочного белкового эквивалента для специализированных продук
тов питания. U-,J"~
Для достижения поставленной цели сформулированы основные задачи исследований:
изучить особенности гидролиза казеина эндо- и экзопептидазами (химот-рипсином, субтилизином, эластазой, термолизином, карбоксипептидазой А, лейцинаминопептидазой), оценить состав и физико-химические свойства полученных систем;
изучить последовательность аминокислот в высвобождаемых фрагментах гидролизатов казеина при рациональных параметрах гидролиза;
изучить кинетику процесса биотрансформации фенилаланина с помощью L-фенилаланин-аммоний-лиазы (ФАЛ);
разработать технологию удаления продуктов биотрансформации фенилаланина (аммиака и транс-циннамовой кислоты) из полученных гидролизатов;
разработать технологию белкового эквивалента для продума-специально-го назначения, исследовать его состав и свойства.
Научная новизна работы:
исследована и разработана технология биотрансформации фенилаланина в гидролизатах казеина, полученных с использованием ферментных препаратов экзо- и эндопептидаз;
изучены особенности гидролиза казеина эндо- и экзопептидазами; определены рациональные условия целенаправленного гидролиза казеина, обеспечивающего максимальное высвобождение фенилаланина (до 100%) из полипептидной цепи казеина: температура 50±2С, фермент-субстратное соотношение (термолизин, карбоксипептидаза А, лейцинаминопептидаза) 1:50, продолжительность процесса 8±0,05 ч;
определена последовательность аминокислот в высвобожаемых фрагментах при рациональных параметрах гидролиза; ..„ЦЯ1.
получены гидролизаты, содержащие пептиды, состоящие из 3-12 остатков аминокислот с молекулярной массой от 0,3 до 1,5 кДа;
изучена кинетика процесса биотрансформации фенилаланина с помощью ФАЛ; определена константа Михаэлиса (1725 цМ) и максимальная.скорость процесса биотрансформации (1,2 цМ/мин), установлены рациональные параметры проведения процесса биотрансформации: температура 30±2С, рН среды 8,0±0,01, продолжительность 8±0,05 ч;
разработана технология удаления продуктов биотрансформации фенилаланина (аммиака и транс-циннамовой кислоты) из полученных гидролизатов;
определен состав и физико-химические свойства молочного эквивалента, установлена продолжительность хранения.
Практическая значимость работы. На основании результатов исследования разработана технология молочного белкового эквивалента для специализированного питания. Новизна технических решений подтверждена патентом на
полезную модель №71903 и патентом на изобретение №2341109.
Апробация работы. Основные положения диссертации получили одобрение на итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2007, 2008); на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов; на школе-семинаре по результатам IV Всероссийского конкурса инновационных проектов студентов, аспирантов и молодых ученых по инновационному малому предпринимательству по приоритетным направлениям развития науки и высоких технологий», г. Москва; на первом научно-практическом симпозиуме «Научная молодежь - биотехнологии России» (Пущино, 2008); на X Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» (Москва, 2008); на международной научно-практической конференции «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009); на XXIV Всероссийской конференции научно-исследовательских работ «Национальное Достояние России» (Москва, 2009); на Всероссийской конференции «Научный потенциал-XXI» (Москва, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, в том числе четыре статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, выводов, списка литературы и приложений, подтверждающих практическую значимость результатов/
