Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о патогенезе, методах лечения травматических повреждений слизистой оболочки полости рта и предпосылки к применению клеточных трансплантатов (обзор литературы) 9
1.1. Патогенетические механизмы и методы лечения травматических повреждений слизистой оболочки полости рта
1.2. Характеристика и механизмы общего и местного действия клеточных трансплантатов
1.3. Перспективы использования клеточных трансплантатов при лечении травматических поражений слизистой оболочки полости рта
Глава 2. Материалы и методы исследования 26
2.1. Характеристика экспериментального материала
2.2. Методы исследования
2.2.1. Клинический и планиметрический методы
2.2.2. Морфологические (гистологический и иммуноморфологический) методы
2.2.3. Статистический метод
Глава 3. Результаты собственного исследования 36
3.1. Динамика заживления ран слизистой оболочки полости рта по данным клинического и планиметрического методов исследования экспериментального материала
3.2. Динамика заживления ран слизистой оболочки полости рта по данным морфологического метода исследования экспериментального материала 100
Глава 4. Обсуждение результатов собственного исследования 176
Заключение 185
Выводы 187
Практические рекомендации 188
Список литературы 189
- Патогенетические механизмы и методы лечения травматических повреждений слизистой оболочки полости рта
- Перспективы использования клеточных трансплантатов при лечении травматических поражений слизистой оболочки полости рта
- Характеристика экспериментального материала
- Динамика заживления ран слизистой оболочки полости рта по данным морфологического метода исследования экспериментального материала
Введение к работе
Актуальность проблемы
Травматические поражения слизистой оболочки (СО) рта возникают в результате действия различных местных факторов (механических, физических, химических), при условии, что интенсивность их влияния превышает ее физиологический «запас прочности». При механическом повреждении травмирующими факторами могут быть острые края зубов, мостовидных и съемных протезов, зубной камень, частое прикусывание СО щек, языка, губ. В результате нарушается целостность эпителия, образуются болезненные эрозии и язвы. При длительном существовании декубитальных язв возможно их озлокачествление (Робустова Т.Г., 1996, Данилевский Н.Ф., 2000, Барер Г.М, 2005).
В соответствии с данными ВОЗ, ожоги являются третьими по частоте среди других травматических повреждений тела человека. Около 70% пострадавших получают ожоги в бытовых условиях от открытого пламени, горячих предметов, жидкостей, при поражении химическими веществами или электрическим током. Наиболее распространенными поражениями являются химические (чаще всего при ошибочном использовании химических веществ в быту, на производстве, при попытках самоубийства, а также во время приема у стоматолога). Химические ожоги могут возникнуть при контакте с кислотами, щелочами, перекисью водорода, употреблении мышьяковистой пасты, фенола, формалина, нитрата серебра. Патологии СО при химических ожогах уделено мало внимание, не уточнены морфологические изменения СО рта, возникающие при воздействии прижигающих веществ, не найдены методы лечения, которые давали бы радикальный эффект (Мосенянц Э.Н., 2002).
Использование физических факторов в комплексном лечении стоматологических заболеваний может вызывать электротравму. Электроожоги лица составляют 1,3% ожоговых ран (Робустова Т.Г., 1996).
Например, при соприкосновении с оголившимся электродом при электрофорезе, из-за превышения дозы или плотности облучений гелий-неоновым лазером, УФО, КУФ. Поражению СО рта способствует и накопление паразитарных ионов в прокладках активных и пассивных электродов (Бушуева М.П., 2000). Через 2-3 месяца после травмы рана замещается фиброзной тканью. В течение последующих 6 месяцев грубая рубцовая ткань стягивает губы, гребень альвеолярного отростка и другие пораженные структуры. После химических ожогов также отмечается образование грубых рубцов, спаек, что приводит к нефункциональной микростомии (Creen S.C., 2001).
Лечение травматических поражений СО рта остается актуальной, до конца нерешенной проблемой. Представляется перспективным использование клеточных трансплантатов, которые уже успешно применяются для лечения больных с ожогами кожных покровов, а в стоматологической практике - при пародонтите.
Клеточные трансплантаты оказывают непосредственное влияние на заживление ран (Ross А., 1968), в частности, на их эпителизацию (Coulomb В., et al., 1998). Многие факторы роста и биологически активные вещества, продуцируемые имплантированными клетками (фибробластами, эпителиоцитами), стимулируют пролиферацию и миграцию эпителиальных кератиноцитов, ускоряя процессы регенерации и эпителизации поврежденных тканей.
Таким образом, можно предположить, что трансплантация клеток (аутологичных эпителиоцитов, аллогенных фибробластов,) на микроносителях явится эффективным методом восстановления целостности эпителия СО рта и предупреждения образования рубцовых деформаций.
Цель исследования
Повышение эффективности терапии травматических повреждений слизистой оболочки рта различной этиологии и профилактики их осложнений с помощью применения клеточных трансплантатов.
6 Задачи исследования
Разработать модели механической, химической и физической (электро-) травм слизистой оболочки рта у экспериментальных животных и изучить особенности течения данных травм на экспериментальных моделях у животных.
Разработать в эксперименте методики имплантации в область травматического поражения слизистой оболочки аутологичного эпидермального трансплантата и аллогенных фибробластов.
Оценить в эксперименте на животных с помощью клинического и планиметрического методов эффективность применения клеточных трансплантатов при механической, химической и физической травмах слизистой оболочки рта.
4. Изучить морфологические особенности заживления механической,
химической и физической травм слизистой оболочки у экспериментальных
животных без лечения и при применении клеточных трансплантатов.
5. Клинико-морфологически обосновать в эксперименте на животных эффективность применения клеточных трансплантатов в комплексном лечении и профилактике осложнений травматических повреждений слизистой оболочки рта.
Научная новизна
Впервые в эксперименте изучено влияние трансплантации аутологичного эпидермального трансплантата и культуры аллогенных фибробластов при механической, химической и электротравме слизистой оболочки рта. Применение планиметрического, гистологического и иммуноморфологического методов исследования позволило проследить в динамике структурно-фушщиональные особенности и изучить пато- и морфогенез как осложненного течения раневого процесса слизистой оболочки рта без лечения, так и в условиях применения клеточных трансплантатов.
Впервые в эксперименте продемонстрирован терапевтический эффект имплантации аутологичного и аллогенного клеточных трансплантатов при
заживлении различных травматических поражений слизистой оболочки рта, а также их профилактическая роль в плане предотвращения гнойных и Рубцовых осложнений.
Разработанные в эксперименте модели механической, химической и физической травм слизистой оболочки полости рта и технологии трансплантации аутологичного эпидермиса и культуры аллогенных фибробластов являются основой для дальнейших исследований особенностей течения патологических процессов в слизистой оболочке рта и способов их лечения с применением клеточных технологий.
Практическая значимость
Результаты клинико-морфологического исследования в эксперименте на животных особенностей пато- и морфогенеза различных травматических поражений слизистой оболочки рта и их лечения с применением клеточных трансплантатов позволяют начать проведение клинических испытаний по использованию современных клеточных технологий в качестве компонента комплексного лечения повреждений слизистой оболочки и мягких тканей рта, а также и профилактики их осложнений.
Внедрение результатов
Предложенный метод лечения травматических поражений слизистой оболочки рта клеточными трансплантатами, как компонента их комплексной терапии, рекомендован для проведения клинических испытаний на кафедре госпитальной терапевтической стоматологии, пар одонтологии и гериатрической стоматологии ГОУ ВПО «МГМСУ» Росздрава. Основные положения диссертации используются в педагогическом процессе на кафедре госпитальной терапевтической стоматологии, пародонтологии и гериатрической стоматологии и кафедре патологической анатомии ГОУ ВПО «МГМСУ» Росздрава.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 4 - в журналах, рекомендованных перечнем ВАК Минобнауки РФ.
Апробация работы
Апробация диссертационной работы проведена 26 сентября 2008 года на совместном заседании кафедр госпитальной терапевтической стоматологии, пародонтологии и гериатрической стоматологии и патологической анатомии ГОУ ВПО «МГМСУ» Росздрава.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на IV научно-практической конференции «Образование, наука и практіжа в стоматологии» (Москва, 2007), XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008).
Основные положения, выносимые на защиту
Разработанная в эксперименте на животных методика лечения с помощью трансплантации аллогенных фибробластов травматических поражений слизистой оболочки рта оптимизирует процесс заживления и улучшает результаты лечения.
Разработанная в эксперименте на животных методика лечения с помощью эпидермального трансплантата травматических поражений слизистой оболочки рта позволяет ускорить регенерацию ран слизистой оболочки и препятствует возникновению возможных осложнений.
Предложенные методики лечения травматических поражений слизистой оболочки рта являются эффективным этапом для клинического исследования.
Патогенетические механизмы и методы лечения травматических повреждений слизистой оболочки полости рта
Актуальность проблемы лечения больных с травматическими поражениями СО рта, обусловлена высокой частотой развития различных осложнений, связанных с их поздней диагностикой и нерациональным лечением (Беленькая И.М., Зарубина И.Л., Спитковская Л.В., 1977, Боровский Е.В., Данилевский Н.Ф., 1981).
Травматические поражения СО рта возникают в результате действия разнообразных местных факторов (механических, физических, химических) при условии, что интенсивность их влияния превышает физиологический «запас прочности» СО.
Механическая травма встречается у 52% пациентов. Патогенез реакций организма на механические повреждения может определяться, с одной стороны, особенностями этиологических факторов, а с другой -іщдивидуальньїми особенностями организма, его реактивностью (Струев И.В., 1994, Лемецкая Т.И., Ковыженко Н.Н., 2002). Хроническая механическая травма СО рта встречается довольно часто. Её причинами являются: острые края зубов при поражении их кариесом или патологическая стертость, отсутствие зубов и нарушение прикуса, некачественно изготовленные протезы, ортодонтические аппараты, зубной камень, дурные привычки. Под действием этих факторов в СО могут развиваться гиперемия, катаральное воспаление, нарушение ее целостности - эрозии, язвы; пролиферативные изменения и разрастания - гипертрофия десневых сосочков, папилломатоз, повышение ороговения или их комбинации. В дальнейшем при хронической механической травме возникает застойная гиперемия, отек, эрозия, а в дальнейшем - язва СО. Локализуется травматическая язва чаще на языке, губах, щеках по линии смыкания зубов, а также в пределах протезного поля. При длительном течении ее края и основание уплотняются, язва становится хронической и возможна ее малигнизация (Александров П.Н., 1986, Барер Г.М., Янушевич О.О., 1996, Барер Г.М., 2005). Среди факторов, которые могут вызывать раздражение и дальнейшее повреждение СО, следует выделить протезы. Пластиночный протез передает жевательное давление на СО, задерживает самоочищение полости рта, что приводит к нарушению равновесия между разными видами микроорганизмов, модифицирует анализирующую функцию рецепторов СО. Эти изменения нередко являются пусковым моментом для озлокачествления травматической язвы, а также для развития нейростоматологических заболеваний (Nowzari N., et al., 1996, Данилевский Н.Ф. и соавторы, 2001).
В соответствии с данными ВОЗ, ожоги являются третьими по частоте среди других травматических повреждений тела человека. Около 70% пострадавших получают ожоги в бытовых условиях от открытого пламени, горячих предметов, жидкостей, при поражении химическими веществами или электрическим током. Наиболее распространенными поражениями являются химические (чаще всего, при ошибочном использовании химических веществ в быту, на производстве, при попытках самоубийства, а также во время приема у стоматолога). Химические ожоги могут возникнуть при контакте с кислотами, щелочами, перекисью водорода, использовании мышьяковистой пасты, фенола, формалина, нитрата серебра. Патологии СО при химических ожогах уделено мало внимания, не уточнены ее морфологические изменения, возникающие при воздействии прижигающих веществ, не найдены методы лечения, которые давали бы радикальный эффект (Мосенянц Э.Н., 2002). Ожог кислотами приводит к возникновению коагуляционного некроза с формированием плотной пленки бурого цвета — от серной кислоты, желтого - от азотной, серо-белого — от других кислот (соляной) и др. Вокруг очага поражения выражено реактивное воспаление с отеком и гиперемией окружающих тканей (Аничков И.Н., Волкова К.Г., ГаршинВ.Г., 1951).
Ожог щелочами приводит к колликвационному некрозу СО без образования плотной пленки. Под действием щелочей возникает более глубокое поражение, чем при ожогах кислотами, которое может захватить все слои СО. При отторжении некротизированных тканей образуются болезненные эрозивные или язвенные дефекты, которые заживают медленно и с образованием спаек и рубцов. Послеожоговые рубцовые изменения могут приводить к развитию микростомии, что определяет необходимость проведения в дальнейшем реконструктивных операций (Данилевский Н.Ф., Хоменко Л.А., Антоніпнин Б.В., 1990).
Использование физических факторов в комплексном лечении стоматологических заболеваний может вызвать электротравму. Электроожоги лица составляют 1,3% ожоговых ран (Робустова Т.Г., 1996). Они могут возникнуть, например, при соприкосновении с оголившемся электродом при электрофорезе, из-за превышения дозы или плотности облучений гелий-неоновым лазером, УФО, КУФ (Бушуева М.П., 2000). Электроожоги около и внутриротовых тканей чаще встречаются у детей при их неосторожном обращении электропроводами. При контакте с оголенными электропроводами возможно образование электрической дуги между источником тока и тканями. Богатая электролитами слюна служит хорошим проводником тока. Этот тип ожогов характеризуется продуцированием большого количества тепла, вызывающего коагуляционный некроз тканей. Может наблюдаться спонтанное артериальное кровотечение в течение первых трех недель заживления. Оно бывает вызвано разрывом стенок кровеносных сосудов, поврежденных при прохождении электрического тока, а также расплавлением некротизированных тканей, покрывающих формирующуюся грануляционную ткань. Ожог может быть поверхностным, например, только по границе красной каймы губ, так и глубоким, на всю толщину тканей. Ожог может распространяться на внутриротовые ткани и органы, например, язык, преддверие и дно полости рта, или СО щек. Встречаются ожоги твердых тканей: нижней челюсти, молочных и постоянных зубов (Andreasen J.O., 1981).
Деструкция тканей при ожоге может быть более глубокой, чем это кажется на первый взгляд, причём нередко повреждаются нервные волокна, возможно развитие парестезии или анестезии. Поэтому в таких случаях боли может и не быть. Кровотечение из поврежденной области обычно незначительное, так как кровеносные сосуды в момент травмы прижигаются. Внешний вид электрического ожога губ и СО характеризуется наличием раны, образовавшейся в результате сильного (300С) локализованного теплового воздействия. Развивается некроз поврежденных тканей с коагуляцией белков, расплавлением жиров, а также с испарением тканевой жидкости (Барер Г.М., Немецкая Т.И., 1996).
В течение первых дней после травмы в центре ожога наблюдается сероватая или желтоватая некротизированная ткань, располагающаяся глубже выступающих эритематозных краев раны. В результате значительного отека тканей края раны становятся трудно различимы, губы значительно выступают кпереди. Речь может быть затруднена из-за потери чувствительности в области ожога. Через 7-10 дней отек спадает. Граница между некротизированными и здоровыми тканями становится более заметной. Некротизированная ткань приобретает обугленный вид, покрывается коркой и начинает отделяться от окружающих здоровых тканей. Струп отпадает через 1-3 недели после ожога. Происходит заживление вторичным натяжением по мере образования и созревания грануляционной ткани. Через 2-3 месяца после травмы рана замещается фиброзной тканью. В течение последующих 6 месяцев грубая рубцовая ткань стягивает губы, гребень альвеолярного отростка и другие пораженные структуры. Рубцовая ткань со временем обычно «размягчается» и через 9-12 месяцев стягивание тканей может уменьшаться (David R.A., McDonald R.E., 2003). Возникновение грубых дефектов и деформаций вследствие ожогов лица и СО приводит к нарушению функций дыхания, речи, приема пищи и пищеварения; страдает зрение, обоняние, слух. Образование грубых рубцов и спаек ведет к нефункциональной микростомии. В результате нарушается социальная адаптация пострадавших людей, и развиваются глубокие психоэмоциональные расстройства (Andreasen J.О., Andreasen F.M., 1994, Белова Л.А., 1997,БелоусоваМ.А., 1998).
Все выше перечисленное побуждает искать более совершенные методы лечения ожогов лица и СО полости рта. Необходимо разработать метод, позволяющий оптимизировать течение репаративной регенерации у ожоговых больных и ускорить сроки заживления ожоговых ран без образования грубых рубцов. Последнее снизит риск развития осложнений, а значит, и необходимость проведения реконструктивных и косметических оперативных вмешательств (Арутюнов С.Д., Арефьева О.В., Кузина О.В., 2002).
Перспективы использования клеточных трансплантатов при лечении травматических поражений слизистой оболочки полости рта
Существуют также матрицы естественного происхождения (девитализированный. децеллюлированный матрикс). Он имеет максимальную биологическую инертность и состоит из набора коллагенов различных типов, которые имеют небольшие межвидовые и внутривидовые вариации. Данный матрикс обладает достаточной прочностью и поддерживает адекватную трехмерную структуру. В децеллюлированной матрице содержатся биологически активные вещества и факторы роста, которые способствуют неоваскуляризации (Волков А.В., 2005).
Фибробласты - наиболее распространенные и функционально значимые клетки соединительной ткани, относящиеся по классическим представлениям к линии механоцитов и присутствующие в строме (соединительнотканном «каркасе») всех без исключения органов. Источником развития фибробластов в эмбриогенезе в основном является мезенхима, однако, не все фибробласты имеют мезенхимальное происхождение - так, фибробласты области головы и шеи развиваются из клеток нервного гребня, то есть, имеют эктодермальный источник. Однако более детально вопрос о происхождении этого типа клеток и их потенциальных возможностях дифференцировки в другие клеточные типы до сих пор не изучен (Федоров В.Д., Саркисов Д.С. и соавторы, 1996).
Фибробласты представляют собой сложную систему (дифферон) клеток, различающихся по степени дифференцировки, морфологическим и функциональным характеристикам. Помимо собственно фибробластов в дифферон входят адипоциты, фиброкласты, фиброциты, представляющие собой конечную стадию дифференцировки фибробластов, миофибробласты, и некоторые другие клетки, родственность которых с фибробластами остается спорной (например, периваскулярные клетки) (Быков В.П.,2002). Считается, что новые фибробласты образуются в соединительной ткани за счет пролиферации резидентных тканевых фибробластов, часто называемых «незрелыми фибробластами» или менее удачным термином «мезенхимальные фибробласты». Однако в последнее время появляются сообщения о том, что фибробласты могут иметь костномозговое происхождение. Это было продемонстрировано в исследованиях патогенеза фиброза почек, фиброза легких, заживления ран и формирование опухолей. Но, несмотря на то, что эти работы уверенно указывают на костномозговое происхождение фибробластов, остается неясным, какая именно клетка в пределах костного мозга дает начало клеткам фибробластической линии. Поскольку мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки характеризуются высокой способностью к адгезии и возможностью дифференцировки в различные клетки мезенхимальной природы, эта популяция костного мозга предполагалась как потенциальный источник фибробластов в эмбриональном развитии.
Недавние работы исследователей из Medical University of South Carolina (USA), указывают на то, что фибробласты могут происходить из гемопоэтической стволовой клетки костного мозга (Masuya М., Drake С.J., Fleming Р.А., 2003). Ранее группа ученых продемонстрировала, что мезангиальные клетки почек, а также микроглиальные и периваскулярные клетки головного мозга, считающиеся специализированными тканевыми типами фибробластов, происходят из гемопоэтической стволовой клетки (Hess D.C., Abe Т., Hill W.D., 2004). В работах, опубликованных в журнале Experimental Hematology, исследователи подтверждают свою гипотезу о гемопоэтическом происхождении фибробластов (Hess D.C., Abe Т., Hill W.D., 2004). Остается несомненным лишь то, что фибробластический дифферон, включающий в себя большое разнообразие морфологически и функционально различных стромальных клеток, играет важнейшую роль практически во всех тканевых процессах (Григорян А.С., 2006). Известна работа Ю.П.Селезнева (1999), использовавшего взвесь фибробластов для замещения остаточных полостей легкого. Экспозицию осуществляли не меньше 3-х часов и через каждый 4-й день повторяли процедуру. Данный метод предотвращал образование остаточной полости в бронхах.
Можно утверждать, что пересаженные аллогенные фибробласты могут оказывать влияние на заживление ран и восстановление кожного покрова путем продуцирования большого числа факторов роста и макромолекул внеклеточного матрикса. Использование аллогенньтх фибробластов способствует восстановлению кожного покрова за счет значительного усиления краевой эпителизации.
Другие экспериментальные данные также свидетельствуют о том, что трансплантация культуры аллогенных фибробластов на микроносителях является эффективным способом восстановления кожного покрова (Михайлик Т.А. и соавторы, 1998, Creen S.C., 2001).
Метод культивирования фибробластов на микроносителях дает возможность получать значительные количества клеточного материала, пригодного для трансплантации, а также приступить к созданию банка клеточных трансплантатов. Все это позволит оказывать помощь большому числу больных. Данный метод прост для применения в клинике и сокращает сроки лечения.
Таким образом, изучение и анализ ряда работ разных авторов, связанных с трансплантацией аллогенных фибробластов, позволяет предположить, что использования клеточного трансплантата на микроносителях может явиться эффективным методом восстановления целостности эпителия СО при травматических поражениях.
Характеристика экспериментального материала
Экспериментальные исследования проводили в два этапа. На первом этапе было произведено моделирование различных видов травматического поражения СО щеки и динамическая оценка процесса регенерации СО без использования клеточного трансплантата; на втором этапе - изучено влияние клеточных трансплантатов на регенерацию СО щеки.
Эксперимент проводили на 48 кроликах породы «шиншилла». Животных использовали в эксперименте после окончания карантина, через 30 суток после поступления в виварий. Перед проведением опыта кроликов взвешивали и осматривали. Животных содержали в стандартных условиях вивария по 1 особи в клетке. Кормление проводили по стандартным лабораторным нормам, установленным приказом МЗ СССР №1179 от 10.10.1983 г. «Об утверждении нормативов затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения». Имеется соответствующее разрешение Федеральной службы Российской Федерации по надзору в сфере здравоохранения и социального развития (№ Государственной регистрации: 01200117745). В работе соблюдали требования, изложенные в Бюллетене ВАК РФ №3 от 2002 г.
На первом этапе была выделена контрольная группа, которую составили 16 кроликов-самцов массой 2,5-3 кг, сходных по возрасту (Табл. 1). Этой группе животных наносили разные виды травматических поражений и оценивали процесс регенерации слизистой оболочки рта без использования клеточного трансплантата.
Всем животным наносили повреждения СО щек под внутривенном наркозом препаратом «Золетил 50». «Золетил 50» («Virbac») - это комбинированный препарат для общей анестезии у животных (из группы диссоциативных анестетиков). В упаковке имеются два флакона: первый — с твердым веществом и второй — с растворителем. В первом флаконе содержится тилетамина хлоралгидрат (125 мг) и золазепама хлоралгидрат (125 мг), во втором - вода для инъекций (5 мл). Тилетамин - это растворимое средство для наркоза, золазепам - седативное, обезболивающее и миорелаксирующее средство. После соединения содержимого двух флаконов, по рекомендации производителя, концентрация полученных 5 мл раствора «Золетил 50» составляет 50 мг/мл. Полученные 5 мл раствора разбавляли до 100 мл в физиологическом растворе NaCl, получая раствор с концентрацией препарата 2,5 мг/мл. В стадии наркоза сохраняются спинальные, ларингеальный, фарингеальный и пальпебральный рефлексы. Данный препарат вызывает миорелаксацию, поэтому может применяться как мононаркоз. Дозировка для мононаркоза: внутривенно вводится 3-5мг/кг, миорелаксация и анальгезия наступают через несколько секунд, их продолжительность -15-30 минут.
Контрольная группа была разделена на 4 подгруппы (по 4 животных в каждой, см. табл. 1):
1-й подгруппе кроликов наносили механическую травму хирургическим пинцетом (площадь травмы - около 1-1,5 см, глубина - до подслизистого слоя включительно);
2-й подгруппе - электротравму с помощью медных электродов, подключенных к лабораторному трансформатору при напряжении 100-120 вольт с экспозицией 1 сек;
3-й подгруппе - химическую (15% НС1, с экспозицией 10 минут);
4-й подгруппе - также химическую, но щелочью (15% КОН, с экспозицией 10 минут).
Материал для морфологического исследования забирали у животных натощак под эфирным наркозом на 2-е, 7-е, 14-е и 25-е сутки после нанесения травмы. СО выделяли в области травмы на всю ее глубину с подлежащими тканями при помощи глазного скальпеля.
На втором этапе опытов были выделены две основные группы животных (32 кролика) (см. рис. 1). Животным I основной группы (16 кроликов) на 5-е сутки эксперимента рана была покрыта эпидермальным аутологичным трансплантатом. Животным (16 кроликов) II основной группы на 5-е сутки эксперимента ішьекционньїм способом имплантировали суспензию аллогенных фибробластов под очаг поражения.
Каждая из двух основных групп была разделена на 4-е подгруппы (по 4 животных в каждой, см. табл. 1):
в 1-й подгруппе кроликам наносили механическую травму хирургическим пинцетом (площадь травмы - около 1-1,5 см, глубина — до под слизистого слоя включительно);
во 2-й подгруппе - электротравму с помощью медных электродов, подключенных к лабораторному трансформатору, при напряжении 100-120 вольт с экспозицией 1 сек.
в 3-й подгруппе - химическую травму (15%НС1);
в 4-й подгруппе - также химическую травму, но щелочью (15% КОН).
Всем животным I основной группы на 4-е сутки эксперимента у животных производили забор кожи с внутренней стороны уха, причем толщина полученной биопсии не превышала 0,3 мм. Сразу после отделения лоскут кожи помещали в стерильный раствор среды Игла с 10-кратным содержанием антибиотика (гентаміщин). Перед трансплантацией биоптаты промывали раствором Хенкса с гентамицином (2 мл 4%-го раствора гентамицина на 1 л раствора Хэнкса). Далее лоскуты кожи промывали раствором PBS и инкубировали в 2%-ом растворе диспазы в течение 1 часа при 37С. После этого пинцетом отделяли эпидермис от дермы по линии базальной пластинки. Полученные кусочки аутологичного эпидермального трансплантата, после предварительной обработки ферментами, промывали в растворе PBS и на 5-е сутки после нанесения травм СО помещали на обработанную раневую поверхность. Трансплантат фиксировали диплен-пленкой и ушивали шовным материалом по краям раны. Диплен-пленка использовалась в работе без лекарственного компонента, вырезалась по размеру соответствующей раны.
Динамика заживления ран слизистой оболочки полости рта по данным морфологического метода исследования экспериментального материала
В главе «Материалы и методы исследования» описан эксперимент на кроликах с воспроизведением механической, электро- и химической травм СО рта. Животные были распределены на группы:
- контрольную (с травмами СО щеки, не были подвергнуты лечению);
- две основных: в I группе на 5-е сутки после травм СО рану покрывали аутологичным эпидермальным трансплантатом; во II группе на 5-е сутки после травм СО под очаг поражения вводили суспензию аллогенных постнатальных фибробластов кожи человека 6-8 пассажей.
Каждая группа была поделена на 4 подгруппы: животным 1-й подгруппы была нанесена механическая травма СО, 2-й подгруппы -электротравма, 3-й подгруппы — химическая травма кислотой (15%-й НС1), 4-й подгруппы - химическая травма щелочью (15%-м КОН).
Морфологическое (гистологическое и иммуноморфологическое) исследование биоптатов очагов повреждения производили на 2-е, 7-е, 14-е, 20-е и 25-е сутки после нанесения травм.
Контрольная группа В 1-й подгруппе контрольной группы на 2-е сутки после механической травмы СО наблюдались следующие гистологические изменения: скопление крови с частично лизированными эритроцитами на месте поврежденного многослойного плоского эпителия (рис. 1), травматическое повреждение собственно слизистого, подслизистого и мышечного слоев, геморрагическая инфильтрация очага повреждения (рис. 2), перифокальный отек окружающей СО, единичные полиморфноядерные лейкоциты по периферии очага повреждения и расширенные сосуды (рис.3). Таким образом, после нанесения электротравмы в СО развиваются выраженные некротические изменения глубиной до мышечного слоя включительно, тяжелые нарушения микроциркуляции и отек. Возникновение и формирование очагов коагуляционного и колликвационного некроза сопровождается перифокальным воспалением, причем воспалительная реакция растянута во времени, а образование грануляционной ткани замедлено. Задержку процессов регенерации по сравнению с наблюдениями с механической травмой, подвтерждают и результаты иммуногистохимического исследования. Эпителизация к заключительному сроку наблюдения не завершена. Следовательно, полного восстановления исходной структуры СО к концу эксперимента не происходит. Но уже на этом этапе появляются очаги грубо-волокнистой рубцовой ткани.
В 3-й подгруппе контрольной группы на 2-е сутки после нанесения химической травмы СО 15%-й соляной кислотой, наблюдались коагуляционный некроз эпителия, собственно слизистого, подслизнстого и мышечного слоев СО, паретическое расширение и фибриновые тромбы сосудов микроциркуляторного русла (рис. 34, 35). Иммуногистохимически заметных изменений пролиферативной активности клеток в очаге поражения, реакции клеток иммунной системы и коллагенообразования не отмечалось.
В 1-й подгруппе I основной группы на 2-е сутки после механической травмы наблюдались следующие гистологические изменения: скопление крови с частично лизированными эритроцитами на поверхности поврежденного многослойного плоского эпителия; травматическое повреждение и отек подслизистого и мышечного слоев, геморрагическая инфильтрация очага повреждения; единичные полиморфноядерные лейкоциты по периферии очага повреждения; расширенные сосуды микроциркуляторного русла. Результаты иммуногистохимического исследования не отличались от контроля.
На 5-е сутки после нанесения механической травмы, очаг повреждения СО был хирургически обработан и покрыт аутологичным эпидермальным трансплантатом, фиксированным диплен-пленкой и швами.
На 7-е сутки после травмы (2-е - после трансплантации) гистологические и иммуногистохимические изменения мало отличались от описанных в соответствующей контрольной группе.
На 14-е сутки после травмы (9-е - после трансплантации) появлялись признаки эпителизации раны и роста грануляционной ткани с лейкоцитраной и лимфо-гистиоцитарной инфильтрацией. Уже на этом сроке эксперимента повышалась пролиферативная активность эпителия, в грануляционной ткани накапливались Т-лимфоциты-хелперы, плазмоциты, продуцирующие в основном IgM и IgG. Усиливалось образование коллагенов всех типов.
