Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Агрессивный пародонтит. 11
1.1.1. Этиология. Классификация и клиническая картина заболевания . 11
1.2. Морфологическое строение тканей пародонта 15
1.3. Матриксные металлопротеиназы и их роль в развитии заболеваний пародонта 22
1.4. Цитокины и их роль при воспалительных заболеваниях пародонта 34
ГЛАВА 2. Материалы и методы 41
2.1. Материал исследования 41
2.2. Клинические методы исследования 44
2.3. Рентгенологические методы исследования 47
2.4. Молекулярно–генетические методы исследования 48
2.4.1. Методика забора биоматериала 48
2.4.2. Экстракция нуклеиновых кислот 49
2.4.3. Генотипирование образцов геномной ДНК 50
2.4.4. Методика проведения ПЦР «в реальном времени» 51
2.5. Методы статистического анализа 52
2.5.1. Статистическая обработка результатов клинического исследования 52
2.5.2. Статистическая обработка результатов молекулярно– генетического исследования 53
2.5.3. Использованное программное обеспечение и базы данных 54
ГЛАВА 3. Результаты исследования 55
3.1. Результаты клинического обследования 55
3.1.1. Характеристика стоматологического статуса пациентов 55
3.1.2. Результаты рентгенологических исследований 56
3.1.3. Клинические случаи 58
3.2. Результаты генетических исследований 62
3.2.1. Разработка тест–систем для генотипирования на основе снятия кривых плавления с флуоресцентно–мечеными аллель–специфичными олигонуклеотидными пробами после реакции 62
3.2.1.1. Подбор последовательностей праймеров и флуоресцентно– меченых проб 65
3.2.1.2. Оценка чувствительности и специфичности разработанных тест–систем для генотипирования 70
3.3. Взаимосвязь генетического полиморфизма и состояния тканей пародонта 71
3.3.1. Исследованные группы генов 71
3.3.3. Анализ взаимосвязи частоты встречаемости генотипа с фенотипом 78
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов исследования 90
4.1. Матриксные металлопротеиназы 93
4.2. Мембранносвязанная MMP - дезинтегрин ADAM33 109
4.3. Хемокины и другие сигнальные факторы местного действия 111
Заключение 116
Выводы 119
Практические рекомендации 120
Список литературы 121
- Этиология. Классификация и клиническая картина заболевания
- Рентгенологические методы исследования
- Методика проведения ПЦР «в реальном времени»
- Разработка тест–систем для генотипирования на основе снятия кривых плавления с флуоресцентно–мечеными аллель–специфичными олигонуклеотидными пробами после реакции
Этиология. Классификация и клиническая картина заболевания
В последние десятилетия, несмотря на внедрение в повседневную практику современных средств гигиены полости рта и расширение технических возможностей стоматологии, наблюдается резкий рост числа пациентов, страдающих не только хроническим, но и агрессивным пародонтитом [89].
Агрессивный пародонтит – воспалительно-деструктивное заболевание тканей пародонта, особенностями которого являются: ранний возраст возникновения, высокая скоростью развития, волнообразное течение [31,32].
Стоит отметить, что данное заболевание может возникать у лиц не только молодого, но и более старшего возраста. Однако в таком случае речь, как правило, идет об агрессивном пародонтите возникшем на фоне тяжелого соматического заболевания, например, ВИЧ-инфекции, радиационного облучения, что находит отражение в некоторых классификациях.
Впервые агрессивный пародонтит был описан в 1923 году как «диффузная атрофия альвеолярной кости» [65], а в 1999 году окончательно получил свое сегодняшнее название [67]. «Рано наступающий пародонтит» один из ранее употреблявшихся терминов, включал в себя локализованную и генерализованную форму и имел 3 подгруппы: 1) препубертатный, 2) ювенильный и 3) быстропрогрессирующий пародонтит взрослых [45,118].
Принято считать, что этиологическим фактором агрессивного пародонтита является внедрение пародонтопатогенной микрофлоры в зубо десневое пространство в совокупности, а одним из основных и самым агрессивным пародонтопатогеном является Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Однако на фоне зачастую удовлетворительного гигиенического состояния полости рта, агрессивная форма пародонтита возникает в препубертатном возрасте, а высокая скорость деструкции пародонтального комплекса приводит без должного лечения к полному разрушению пародонта и потере зубов в течение непродолжительного времени [12].
В последнее десятилетие все больше исследователей склоняются к тому, что заболевание является мультифакторным по природе, так как играют роль не только микробиологические аспекты, но и генетика, иммунологический статус, социальные и поведенческие риски.
В ряде работ был проведен анализ в результате, которого, была выявлена закономерность возникновения агрессивного пародонтита у членов одной семьи [96,97]. Это обстоятельство позволяет предположить, что генетические факторы играют важную роль в развитии данной патологии, а методы определения индивидуального генетического профиля пациента приобретают всё большую практическую значимость. Несмотря на то, что заболевание начинает развиваться в молодом возрасте и имеет волнообразный характер, то есть может сопровождаться периодической кровоточивостью десны, абсцедированием, сменяясь затем периодами ремиссии, пациенты не обращают должного внимания на эти симптомы. В период обострения скорость деструкции всех структур пародонта в разы выше, чем при типичной форме, отсюда название. В конечном итоге визит к врачу происходит уже при значительных нарушениях зубо-челюстной системы, например, при появлении подвижности зубов, что влечет за собой крайне неблагоприятный прогноз. Помимо этого, существует еще ряд признаков характерных для АП. Один из них – количество зубного налета и твердых зубных отложений не соответствует тяжести процесса, то есть уровень гигиены в большинстве случаев удовлетворительный, а степень деструкции пародонтального комплекса тяжелая. Такие анатомо топографические особенности как, гиперминерализация эмалевых бугров (отсутствие истираемости), дивергенция корней моляров, короткие корни, все это также является отличительными признаками АП [1]. Классификация заболеваний пародонта.
Существует несколько классификаций заболеваний пародонта, в основу которых положены локализация, клинические проявления, а также различные процессы, протекающие в опорно-удерживающем комплексе тканей зуба.
Хотя в большинстве современных классификаций АП выделен в отдельную нозологию, тем не менее, его различные возрастные, клинические проявления, а также характер течения, требуют более детальной систематизации, основанной не только на распространенности процесса.
Согласно Приказу Министерства здравоохранения Российской федерации от 27 мая 1997 года № 170 «О переходе органов и учреждений здравоохранения Российской Федерации на Международную статистическую классификацию болезней и проблем, связанных со здоровьем X пересмотра» в нашей стране используется МКБ-10 для установления диагноза. Однако в виду того, что в данной классификации отсутствуют «нюансы» в описании тяжести и течения – de facto, врачи-пародонтологи нашей страны чаще используют классификацию, принятую в 2001 году.
Рентгенологические методы исследования
Однако Ebadian A.R. и соав., проводившие в ирано-хорасанской популяции анализ взаимосвязи SNP цитокинов IL-1 +3954 С / Т и ФНО- -308 G / A с развитием генерализованного АП, не выявили достоверных статистических различий в группе пациентов с АП (58 человек) и здоровых (60 человек). В качестве биологического материала использовали венозную кровь, а в качестве метода исследования выбрали полимеразную цепную реакцию полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ). Распределения генотипов для IL-1 +3954 выглядели следующим образом: у пациентов с АП генотип CT встречался в 39,6%, CC - в 60,4% и TT - в 0,0%; а в контрольной группе вт41,7%, 50% и 8,3%, соответственно. При расчете для TNF- -308 в группе пациентов c АП частота встречаемости генотипа GA была 44,8%, GG - 41,4% и AA -13,8%, а в контрольной группе -46,7%, 50% и 3,3% соответственно [54]. Таким образом, это сообщение противоречит вышеупомянутому, но возможно, это связано с различиями в численности и выборке популяции.
В качестве SNP для своего исследования Ycel O.O. и соавт. также выбрали ген IL-1 +3954, однако включили в работу не только лиц с АП, но и ХГП. Таким образом, всего было обследовано 147 человек турецкого происхождения, из них 56 с диагнозом АП, 44 человека - с ХГП и 47 клинически здоровых пациентов. Также в исследовании была поставлена задача выявить корреляцию между уровнем данного цитокина в десневой жидкости и тяжестью заболеваний и клинической картиной. В качестве метода исследования SNP была использована полимеразная цепная реакция полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ). При расчете данных не было выявлено ассоциации гена IL-1 +3954 с развитием АП, однако для аллеля Т выявили связь с повышенной кровоточивостью, и, в свою очередь, было выдвинуто предположение о роли данного SNP в развитии и течении ХГП [150].
В работе Jain N. с соавт. в качестве SNP для выявления возможной ассоциации с ВЗП выбрали IL-4 + 33С / Т и IL-17F 7383 A / G и 7488 A / G. В исследовании принимали участие 63 пациента с ХГП, 61 пациент с диагнозом АП, контрольная группа состояла из 101 здорового человека. Все пациенты относились к дравидийской этнической группе в Индии. IL-4, являясь мощным регулятором функции макрофагов, ингибирует секрецию провоспалительных цитокинов, таких как IL-1, IL-6 и фактора некроза опухоли (TNF). IL-17F является новым провоспалительным цитокином, который регулирует воспаление, активность остеокластов, усиливает провоспалительный ответ, а также способствует развитию аутоиммунных состояний. Роль IL-17F при заболеваниях пародонта мало изучена. Имеющиеся данные позволяют предположить, что ген IL-17F является отличным кандидатом для хронических воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит [108]. Ревматоидный артирит и воспалительные заболевания пародонта объединяют общий иммунный путь, а ассоциация между ревматоидным артиритом и ХГП хорошо описана в литературе [59, 76]. При проведении расчетов Jain N. с соавт. обнаружили статистически значимые различия в распределении генотипов CC, CT, TT для IL-4 + 33C / T в выборке случаев (АП+ХГП) и в контрольной группе. Распределение генотипа CC (77%) было выше в группе случая (АП+ХГП) по сравнению с контрольной группой (64%). Авторы указывают на соответствие распределения генотипов в их исследовании с работой, проведенной на иранской популяции [68], где было выявлено преобладание генотипа СС в группе случая (АП+ХГП), однако они не достигали статистической значимости. Однако при разделении выборок по нозологии на агрессивный и хронический пародонтит авторы обнаружили статистически значимые различия в распределении аллелей SNP IL-4 + 33С / Т между АП (C = 89%, Т = 11%) и контрольной группой (С = 81%, Т = 19%), но не с генотипами. Не было выявлено статистически значимой связи между смешанными выборками случая (АП+ХГП) и контрольной группой для обоих генотипов и аллелей IL-17F на 7488 A / 7383A и G / G полиморфизма. Разделение на пациентов на группы с АП и ХГП также не позволило выявить каких-либо статистически значимых данных.
Опираясь на данные, полученные в результате анализа литературы, в качестве потенциальных генетических факторов риска развития пародонтита мы рассматривали гены четырех основных типов белков: металлопротеиназы и их ингибиторы, фибриллярные и аморфные белки матрикса пародонта, локальные сигнальные факторы и генерализованные сигнальные факторы, действующие на уровне кровотока.
Методика проведения ПЦР «в реальном времени»
Аналитическая чувствительность. При описании тест–систем для генотипирования такой параметр как аналитическая чувствительность (число выявляемых молекул ДНК на реакционную пробирку) не является сколько– нибудь актуальным, поскольку при определении генотипа диплоидного организма для обеспечения равномерной представленности аллелей необходимо добавить в пробирку существенное число копий генома (как минимум несколько десятков), что фактически снимает требование по чувствительности.
В данном исследовании аналитическая чувствительность тест–систем для генотипирования не определялась.
Аналитическая специфичность. В качестве референсного метода определения генотипа образцов использовали автоматическое секвенирование ДНК по Сэнгеру. Секвенирование проводили с применением автоматического секвенатора ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) используя реактивы и рекомендации производителя. Секвенировали по пять образцов каждого генотипа по всем исследуемым генам, определяя генотипы с помощью разработанных тест–систем. Во всех случаях генотип, определенный при помощи разработанной тест–системы, совпал с генотипом, определенным методом определения последовательности ДНК при помощи автоматического секвенатора.
Диагностическая чувствительность и диагностическая специфичность. Диагностическую чувствительность и специфичность каждой из тест–систем определяли на выборке заранее охарактеризованных методом секвенирования образцов, как минимум по 100 образцов на тест– систему (но с обнаружением не менее одного генотипа каждого вида). Все тест–системы показали 100% диагностическую чувствительность и специфичность (все генотипы, определенные при помощи ПЦР–тест–систем совпали с генотипами, определенными при помощи секвенирования).
Как указано в главе «Обзор литературы», в качестве потенциальных генетических факторов риска развития пародонтита мы рассматриваем гены четырех основных типов белков: фибриллярные и аморфные белки матрикса, металлопротеиназы и их ингибиторы, локальные сигнальные факторы пародонты и генерализованные сигнальные факторы, действующие на уровне кровотока.
В таблице 4 перечислены полиморфные позиции в генах, кодирующих белки 2-4 групп, отобранные для популяционно-генетического исследования на предмет ассоциации определенных аллельных вариантов соответствующих генов с риском развития агрессивного пародонтита. Необходимо отметить, что при выборе полиморфных позиций мы стремились использовать те из них, аллельный полимофризм по которым затрагивает существенную часть популяции. Позиции, замены в которых ожидались с частотой менее 5%, не использовались. В ходе исследования определяли генотип по полиморфизмам генов при помощи ПЦР «в реальном времени» с использованием примыкающих флуоресцентно-меченых проб (kissing probes) с целью выявления ассоциации маркеров, перечисленных в таблице 5, с предрасположенностью к развитию агрессивного пародонтита. Последовательности использованных в работе праймеров и флуоресцентно-меченых проб приведены в разделе «Материалы и методы».
При статистической обработке результатов прежде всего устанавливали, подчиняется ли соотношение частот встречаемости гетерозигот и гомозигот по исследуемым аллелям равновесию Харди-Вайнберга (см. Приложение, Таблица А и Б). Было установлено, что большинство локусов в исследованных выборках подчиняется закону Харди-Вайнберга, что позволяет применять к ним методы параметрической статистики.
Установив факт применимости параметрических методов статистического анализа к изучаемым выборкам, были проведены исследования корреляции выбранных аллелей и генотипов с риском возникновения агрессивного пародонтита. Необходимо учитывать, что для выявления истинной роли генетических факторов в развитии заболевания необходимо использовать в каждом случае две модели: 1) доминантную, основанную на анализе частоты встречаемости аллелей каждого локуса; 2) рецессивную (кодоминантную), основанную на анализе частоты встречаемости генотипа каждого локуса. По итогам расчетов выявление максимально значимых статистических различий между выборками позволяет сделать выбор между моделями (выбирается модель, дающая лучшее разрешение).
Минимально достоверному уровню различий при использовании критерия Пирсона соответствует величина 2 не менее 3,0. Из таблицы 5 видно, что при сравнении выборок пациентов выход этого параметра на значимый уровень наблюдается только для аллеля A позиции rs17576 и аллеля C позиции rs3918242 гена MMP9 (см.приложение, таблица В).
Разработка тест–систем для генотипирования на основе снятия кривых плавления с флуоресцентно–мечеными аллель–специфичными олигонуклеотидными пробами после реакции
По другим SNP среди семейства MMP нами не было выявлено достоверных ассоциаций с развитием АП. Однако в литературе встречаются данные, указывающие на взаимосвязь между развитием некоторых стоматологических заболеваний с участием MMP, в том числе тех, что использовались нами в качестве генов-кандидатов. В работе Menezes-Silva R. с соавт. (2012) описывается клиническое значение полиморфизма в генах металлопротеиназ MMP2 и MMP3 с точки зрения развития кариеса. Было показано, что предрасположенность к кариесу имеет выраженную генетическую составляющую. Различные металлопротеиназы непосредственно участвуют в развитии кариеса, также как при пульпите и воспалении периапикальных тканей. Они также участвуют в разрушении альвеолярной кости. Авторы работы собрали выборку с глубокими кариозными повреждениями ( 3 мм), часть из которых (110 человек) имела, а другая (158 человек) не имела сопутствующего повреждения периапикальных тканей. Из крови больных выделяли ДНК, которую генотипировали по 16 полиморфным позициям в генах MMP2, MMP3, MMP9, MMP13, MMP14 и TIMP2 с помощью ПЦР «в реальном времени».
Результаты исследования показали достоверную ассоциацию наличия у пациентов редких аллелей MMP3 позиции rs639752 (р=0,03) и rs679620 (р=0,004) с повышенным риском возникновения кариеса и его осложнений, выражающихся в повреждении периапикальных тканей. Был найден также редкий аллель гена MMP2 (р=0,000004), также вызывавший повышение риска развития осложнений кариозного процесса. Важным выводом из этого наблюдения является значимость генов MMP2 и MMP3 с точки зрения развития болезней ротовой полости. Кроме того, авторами была доказана возможность получения статистически достоверных результатов при использовании технологии ПЦР «в реальном времени», позволяющей анализировать лишь небольшие выборки (несколько более 100 пациентов), компенсируя это возможностью параллельного анализа достаточно большого числа маркерных SNP (16 штук) [95]. Таким образом, в случае кариеса в отличие от пародонтита ген MMP3 представляется более информативным маркером по сравнению с MMP9. Эти данные показывают также высокую степень полиморфности генов стромелизинов достаточную для того, чтобы оказывать влияние на риск развития социально значимых заболеваний. Однако в нашем исследовании аллельное состояние этого маркера не коррелировало с риском развития агрессивного пародонтита. В совокупности эти наблюдения позволяют считать ген стромелизина MMP3 перспективным кандидатом на роль детерминанты риска развития агрессивного пародонтита, однако не позволяют выстроить в отношении него чёткой медико-генетической модели участия в этом процессе.
В настоящее время наиболее крупные массивы данных об исследованиях индивидуальных генетических профилей собраны для онкологических и кардиологических больных. Это обусловлено наибольшей встречаемостью этих патологий. Именно на этих моделях в наибольшей мере практически отработаны методы применения систем для генотипирования. Поэтому имеет смысл обратить внимание на поведение кандидатных маркеров развития агрессивного пародонтита с точки зрения развития рака. В работе Chaudhary A.K. с соавт. (2010) мононуклеотидный полиморфизм по генам металлопротеиназ MMP3 и MMP9 исследовался в связи с генетическим риском возникновения рака шейки матки [46]. Авторы этой работы исследовали мутации, затрагивающие промоторные области генов MMP1 (-1607 1G/2G), MMP2 (-1306 C/T), MMP3 (-1171 5A/6A), MMP9 (-1562 C/T) и TIMP2 (-418 G/C or C/C). Было показано, что относительно редкие полиморфизмы в промоторах генов MMP3 и MMP9 повышают риск возникновения этого типа опухолей. Эти полиморфизмы не исследовались в нашей работе, однако нет сомнений, что полиморфизм MMP9 (-1562 C/T) в будущем должна рассматриваться в качестве кандидатного маркера развития агрессивного пародонтита. Подобно позиции rs3918242 в промоторной области гена MMP9, исследованной в нашей работе, редкий аллель Т способен увеличивать уровень продукции MMP9, что непосредственно увеличивает риск запуска деградации пародонта.
В работе Brooks R. с соавт. (2010) исследовалось влияние полиморфных позиций в генах MMP9 (rs17576) и SIPA1 (rs746429 и rs931127) на риск развития рака шейки матки [42]. Полиморфная позиция MMP9 (rs17576) совпадала с мишенью, выбранной и в нашей работе. В исследовании участвовала 101 пациентка, оперированная на предмет удаления тазового лимфоузла, подвергшегося метастазированию клетками рака шейки матки, и 273 здоровых пациентки. В качестве средства для генотипирования служил ПЦР «в реальном времени». Минорный аллель в позиции rs17576 гена MMP9 оказался фактором риска развития метастазирующей формы рака шейки матки - OR 1,5 (р=0,08). Таким образом, редкие полиморфизмы в позиции rs17576 можно считать неблагоприятными для здоровья пациентов в целом и лишенными видимого адаптивного значения для человека.
![Этиологическая диагностика и оптимизация лечения воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области на основе определения генетических маркеров микроорганизмов возбудителей [Электронный ресурс]](/i/i/4393/188529.png "Этиологическая диагностика и оптимизация лечения воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области на основе определения генетических маркеров микроорганизмов возбудителей [Электронный ресурс] Алексеева Юлия Владимировна")
