Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1 Строение и функции компонентов JAK-STAT-системы 14
1.2 Негативная регуляция JAK-STAT сигнальной системы 24
1.3 Модификация и деградация компонентов JAK-STAT сигнальной системы 38
1.4 Crossalk взаимодействия 39
1.5 Полиморфизм гена белка STAT6 и бронхиальная астма 41
1.6 Рецепторы к 1L-4 и IL-13: строение, функции и генетический полиморфизм 59
1.7 Лечебные "стратегии будущего" 73
Глава 2. Материалы и методы 80
2.1 Клиническая характеристика обследованных больных 80
2.2 Методологическая схема 88
2.3 Методы исследования
2.3.1 Выделение мононуклеаров периферической крови 89
2.3.2 Исследование экспрессии мРНК методом RT-PCR 89
2.3.3 Исследование экспрессии белков методом иммуноблоттинга 91
2.3.4 Определение концентрации цитокинов плазмы 93
2.3.5 Определение концентрации активной формы транскрипционного фактора STAT6 методом проточной флюориметрии 95
2.3.6 Определение полиморфизма rs324011 гена белка STAT6 97
2.4 Методы статистической обработки 99
Глава 3. Результаты проведенных исследований 101
3.1 Характеристика экспрессии транскрипционного фактора STAT6 в мононуклеарах периферической крови при бронхиальной астме 101
3.2 Характеристика экспрессии транскрипционного фактора GATA-3 в мононуклеарах периферической крови при бронхиальной астме 122
3.3 Характеристика экспрессии альфа-субъединицы рецептора к интерлейкину-4 в мононуклеарах периферической крови при бронхиальной астме 136
3.4 Характеристика экспрессии транскрипционного фактора STAT4 в мононуклеарах периферической крови при бронхиальной астме 145
3.5 Характеристика экспрессии транскрипционного фактора T-bet в мононуклеарах периферической крови при бронхиальной астме 163
3.6 Характеристика экспрессии негативных регуляторов транскрипции генов SOCS1 и SOCS3 в мононуклеарах периферической крови при бронхиальной астме 196
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 215
Выводы 230
Практические рекомендации 233
Список литературы
- Негативная регуляция JAK-STAT сигнальной системы
- Рецепторы к 1L-4 и IL-13: строение, функции и генетический полиморфизм
- Исследование экспрессии белков методом иммуноблоттинга
- Характеристика экспрессии альфа-субъединицы рецептора к интерлейкину-4 в мононуклеарах периферической крови при бронхиальной астме
Введение к работе
Актуальность темы
Бронхиальная астма (БА) является одной из важнейших проблем в современной пульмонологии и приобретает все большую социальную значимость (Федосеев Г.Б., Трофимов В.И., 2006). При этом, несмотря на появление новых инновационных стратегий в диагностике и лечении этого хронического заболевания, возрастание арсенала медикаментозных средств, в последние годы, как свидетельствуют различные источники (Илькович М.М. и др., 2007; Чучалин А.Г., Илькович М.М., 2009), отмечается неуклонный рост заболеваемости, увеличивается распространенность этой патологии во многих странах мира, составляя в настоящее время более 10% среди детей и 4-10% - среди взрослых.
Сохраняются высокими показатели смертности и инвалидизации (Кокосов А.Н., 2005; GINA, 2009). Растет число больных с тяжелым течением, среди которых велик процент лиц молодого возраста и детей, увеличивается количество пациентов, имеющих резистентность к проводимой терапии.
Сложившаяся ситуация требует поиска новых путей решения проблемы диагностики и лечения БА (Oh C.K., Geba G.P., Molfino N., 2010) с обязательным обращением к вопросу о патогенетических механизмах развития бронхолегочной патологии, генетических аспектах формирования аллергических заболеваний (Келембет Н.А., Гембицкая Т.Е., Иващенко Т.Э. и др., 2008), центральным дефектом которых является изменение и нарушение функционирования клеточного мембранно-рецепторного аппарата (Минеев В.Н., 2005) и сигнальных систем (Barnes J.P., 2008).
Одной из новых сигнальных систем, играющих решающую роль в патогенезе БА, является JAK-STAT (Janus Kinases – Signal Transducer and Activator of Transcription), которая вовлекается в патогенез при различных патологических процессах. К настоящему времени эта система относительно хорошо изучена в эксперименте. У животных и человека она трансдуцирует множество цитокиновых сигналов и ростовых факторов, которые обеспечивают клеточную пролиферацию, дифференциацию, миграцию и апоптоз. Достаточно подробно структурно-функциональная организация этой системы, а также особенности изменений этой системы при некоторых видах патологии изложены в целом ряде обзоров (Murray P.J., 2007; Barnes J.P., 2008).
Что касается бронхиальной астмы, то данные литературы о функционировании этой системы в клетках-мишенях при указанном виде патологии единичны и противоречивы (Schindler C.W., 2002; Pernis A.B., Rothman P.B., 2002; Rawlings J.S. et al., 2004), а в отечественной литературе – вообще отсутствуют.
Цель исследования
Определить патогенетическое и клиническое значение нарушений регуляции сигнализации транскрипционного фактора STAT6 при различных вариантах бронхиальной астмы.
Задачи исследования
-
Изучить экспрессию и активацию транскрипционного фактора STAT6 при аллергической и неаллергической бронхиальной астме в сравнении с группой практически здоровых лиц, в зависимости от тяжести и фазы заболевания.
-
Оценить изменение уровня транскрипционного фактора GATA-3 при аллергической и неаллергической бронхиальной астме в различные фазы заболевания.
-
Изучить экспрессию транскрипционного фактора STAT4 при аллергической и неаллергической бронхиальной астме в сравнении с группой практически здоровых лиц, в зависимости от тяжести и фазы заболевания.
-
Исследовать экспрессию транскрипционного фактора T-bet при аллергической и неаллергической бронхиальной астме в сравнении с группой практически здоровых лиц, в зависимости от тяжести и фазы заболевания.
-
Изучить мРНК IL-4R при аллергической и неаллергической бронхиальной астме в сравнении с группой практически здоровых лиц, в зависимости от тяжести и фазы заболевания.
-
Выявить нарушения регуляции транскрипционного фактора STAT6 на основе анализа экспрессии негативных регуляторов транскрипции генов SOCS3 и SOCS1 при аллергической и неаллергической бронхиальной астме в сравнении с группой практически здоровых лиц, в зависимости от тяжести и фазы заболевания.
Научная новизна исследования
Впервые установлены особенности сигнализации транскрипционного фактора STAT6 в зависимости от клинико-патогенетических особенностей бронхиальной астмы исходно и в условиях активации ее IL-4. При этом сопоставление компонентов STAT-сигнализации (STAT4 и STAT6) в зависимости от клинико-патогенетических особенностей бронхиальной астмы дало возможность разработки методов дифференциальной диагностики вариантов заболевания.
Впервые проведено исследование экспрессии транскрипционного фактора GATA-3 в мононуклеарах периферической крови у больных аллергической и неаллергической бронхиальной астмой в сравнении с группой практически здоровых лиц в зависимости от клинико-патогенетических особенностей заболевания, и показана роль этого транскрипционного фактора в механизмах утяжеления аллергической бронхиальной астмы.
Впервые сопоставлены особенности экспрессии транскрипционного фактора STAT4 и мРНК IFN- в мононуклеарах периферической крови у больных аллергической и неаллергической бронхиальной астмой.
Впервые показаны особенности экспрессии транскрипционного фактора T-bet у больных аллергической и неаллергической бронхиальной астмой, а также, выделен и охарактеризован “синдром повышения T-bet”, свидетельствующий о тяжелом течении заболевания.
Впервые показано нарушение баланса уровней экспрессии негативных регуляторов транскрипции генов SOCS1 и SOCS3 в зависимости от клинико-патогенетических особенностей бронхиальной астмы и проводимой терапии.
Впервые разработано и проведено комплексное исследование особенностей экспрессии транскрипционных факторов, участвующих в STAT-сигнализации, в мононуклеарах периферической крови у больных аллергической и неаллергической бронхиальной астмой.
Практическая ценность работы
- Разработан метод дифференциальной диагностики бронхиальной астмы, основанный на сопоставлении уровней активной формы транскрипционного фактора STAT6 у больных аллергической и неаллергической бронхиальной астмой.
- Нами охарактеризован новый симптоматокомплекс (“синдром повышения T-bet”), включающий наличие парадоксальной экспрессии T-bet в сочетании с тяжелым течением заболевания, необходимостью применения применения системных глюкокортикостероидов и 2-агонистов, отсутствием наследственной предрасположенности к аллергическим заболеваниям, избыточной массой тела, наличием сочетанной сопутствующей патологии.
- Выявленные разноуровневые нарушения в системе STAT-сигнализации можно рассматривать как мишени для разработки новых лечебных “стратегий будущего”.
Положения, выносимые на защиту
1. Для бронхиальной астмы характерны множественные изменения экспрессии транскрипционных факторов, участвующих в STAT-сигнализации, и регуляторные нарушения на различных уровнях клеточной сигнализации (рецепторном, на уровне транскрипционных факторов, негативных регуляторов транскрипции генов), в основе которых лежат дефекты негативного контроля.
2. Аллергическая БА характеризуется разнонаправленными изменениями уровней экспрессии транскрипционных факторов STAT6 и STAT4 в мононуклеарах периферической крови, с активацией IL-4 и одновременно угнетением альтернативного IL-12 сигнального пути, что может указывать на повышенную Th2-активность при данном варианте заболевания.
3. Для аллергической бронхиальной астмы характерно разнонаправленное изменение экспрессии транскрипционных факторов GATA-3 и T-bet с выраженным увеличением интегрального коэффициента GATA-3/T-bet, что может свидетельствовать о сдвиге регуляторного Th1/Th2 баланса в сторону Th2-ответа.
4. Наличие парадоксальной экспрессии T-bet (повышение экспрессии) у больных бронхиальной астмой определяет симптоматокомплекс (“синдром повышения T-bet”), проявляющийся преимущественно тяжелым течением заболевания, необходимостью применения системных глюкокортикостероидов и 2-агонистов, отсутствием наследственной предрасположенности к аллергическим заболеваниям, избыточной массой тела, наличием сочетанной сопутствующей патологии, среди которой ведущее место занимает кардиальная, эндокринная и патология желудочно-кишечного тракта.
5. При БА глюкокортикостероиды проявляют свое модулирующее влияние в отношении STAT-сигнализации в мононуклеарах периферической крови на разных уровнях клеточной сигнализации, особенно выраженное в группе больных с пероральной глюкокортикостероидной терапией.
6. Дефектность негативного регуляторного контроля в системе STAT-сигнализации проявляется на уровне супрессоров цитокиновой сигнализации SOCS1 и SOCS3 в мононуклеарах периферической крови, что связано с нарушением их баланса.
Апробация работы
По материалам диссертации опубликована 31 печатная работа. Из них 10 статей в журналах, рекомендованных ВАК, 12 работ в зарубежной литературе, 1 изобретение “Способ дифференциальной диагностики бронхиальной астмы”; авторы: Минеев В.Н., Сорокина Л.Н., Трофимов В.И. (патент на изобретение № 2391663), 1 глава в монографии “Саногенез” и монография “Фундаментальные и клинические аспекты JAK-STAT сигнализации”.
Материалы диссертации докладывались на Всероссийской научно-практической конференции “Бронхиальная астма - вчера, сегодня, завтра” (Санкт-Петербург, 2007); на “Булатовских чтениях” (Санкт-Петербург, 2007, 2008); на 16-м Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Санкт-Петербург, 2006); на 18-м Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Санкт-Петербург, 2008); на 19-м Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2009); на пульмонологической секции Санкт-Петербургского научно-практического общества терапевтов имени С.П. Боткина (Санкт-Петербург, 2008); на 17 Конгрессе Европейского Респираторного Общества (Stockholm, Sweden, 2007); на 18 Конгрессе Европейского Респираторного Общества (Berlin, Germany, 2008), на 19 Конгрессе Европейского Респираторного Общества (Vienna, Austria, 2009).
По результатам конкурса докладов молодых ученых в рамках 16 Национального Конгресса по болезням органов дыхания (Санкт-Петербург, 2006) доклад “Особенности JAK-STAT сигнализации при бронхиальной астме” занял первое место и был награжден стипендией Главного терапевта России.
По результатам Санкт-Петербургского конкурса грантов для молодых кандидатов наук, проводимого Министерством образования РФ, Российской Академии наук и Администрацией Санкт-Петербурга, конкурсный проект “JAK-STAT сигнализация как базис формирования аллергических заболеваний: фундаментальные и прикладные аспекты” стал победителем конкурса 2007 года. Шифр гранта: РД 07-4.0-86.
По результатам Санкт-Петербургского конкурса грантов для молодых кандидатов наук, проводимого Министерством образования РФ, Российской Академии наук и Администрацией Санкт-Петербурга, конкурсный проект “Новая сигнальная система JAK-STAT: разработка инновационного подхода к комплексному исследованию патогенетических и клинических основ” стал победителем конкурса 2008 года. Шифр гранта: 28-04/17.
По результатам конкурса грантов НИР в 2008 году СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова на лучшую научную работу, конкурсный проект: "Патогенетические и клинические аспекты нарушений регуляции STAT6-сигнализации при бронхиальной астме", стал победителем конкурса 2008 года.
Внедрение результатов исследования
Результаты исследования внедрены в лечебную практику пульмонологического отделения клиники госпитальной терапии, а также межклинического аллергологического отделения и консультативно-диагностического центра СПбГМУ им.акад.И.П.Павлова.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, шести глав с результатами собственных наблюдений, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 292 работы (24 отечественных и 268 иностранных авторов).
Работа изложена на 269 страницах машинописного текста, иллюстрирована 85 таблицами и 31 рисунком.
Негативная регуляция JAK-STAT сигнальной системы
С-концевой тирозинкиназный JH1 домен имеет черты, объединяющие его с другими тирозинкиназными доменами. В настоящее время проводится идентификация числа самофосфорилированных сайтов в Янус-киназах. Два из них находится в предполагаемой петле активации. Отличительной чертой семейства Янус-киназ среди всех тирозинкиназ млекопитающих является существование тандема киназного (JH1) и псевдокиназного (JH2) доменов (рис. 2, а). Наличие последнего и определяет название Янус-киназ, поскольку только они, среди всех тирозинкиназ млекопитающих, имеют псевдокиназный домен. Как двуликий Янус - римский Бог — Янус-киназы также имеют "два лица".
Псевдокиназный домен, или (JH2) домен, хотя и имеет полное сходство с киназными доменами, в нем отсутствуют остатки, отвечающие за фосфотрансферазную активность. Функция данного домена, вероятно, заключается в регуляции каталитической активности.
Уникальность данного семейства киназ заключается, по-видимому, в существовании способности Янус-киназ к автономной саморегуляции внутри отдельно взятой молекулы. Мутации или делеции в этом регионе могут приводить к ингибированию или повышению каталитической функции Янус-киназ, в зависимости от конкретного расположения возникшей мутации. Так, у пациентов с JAK3-ассоциированным тяжелым комбинированным иммунодефицитом, мутация была идентифицирована именно в этом домене, что еще раз подчеркивает его решающую роль (Candotti F., Oakes S.A., Johnston J.A. et al., 1996). Другая, не менее важная функция псевдокиназного домена, заключается в формировании мест связывания для STAT белков.
Предполагают, что N-концевой участок отвечает за связывание JAK с соответствующим цитокиновым рецептором, хотя данная функция описана не для всех Янус-киназ. Область цитокинового рецептора, с которой связывается Янус-киназа, находится в проксимальной части мембраны. Многие тирозинкиназы имеют внутренние SH2- и SH3-домены, которые опосредуют взаимодействия между белками. Связывание цитокинов с рецепторами I и II типов, как предполагают, приводит к запуску сигнализации посредством гомо- или гетеродимеризации субъединиц рецептора, которые располагаются напротив Янус-киназ. Последние фосфорилируются, что приводит к повышению их каталитической активности. Показано (Remy I., Wilson LA., Michnick S.W., 1999), что лигандиндуцированное аллостерическое изменение рецептора ведет к активации JAK. При гетеродимеризации рецепторов (большинство рецепторов к интерлейкинам и интерферонам) встречается также гетеродимеризация различных JAK, которые при этом активируют друг друга. После активации Янус-киназ, они фосфорилируют субъединицы рецептора на тирозиновых остатках, давая возможность связывания белков с SH2 или тирозин-связывающим доменом. Эти белки (STAT) затем фосфорилируются с помощью Янус-киназ.
Сигнальные трансдукторы и активаторы транскрипции (STAT) Darnell et al. (Darnell J.E., Kerr I.M., Stark G.R., 1994) впервые выделили первого представителя семейства STAT белков при очистке факторов, связанных с промоторами IFN-индуцибельных генов. IFN-a индуцируемый комплекс состоял из полипептида с молекулярной массой 91 кДа (позднее был назван STAT1); белка с молекулярной массой 113 кДа (STAT2) и р 48, представителя семейства IFN-регулируемых факторов. Вслед за STAT1 и STAT2 были выделены остальные представители данного семейства (Hou J., Schindler U., Henzel W.J. et аі., 1994). Большинство STAT белков состоят из 750 аминокислотных остатков и только STAT2 и STAT6 состоят из 850 аминокислотных остатков.
У млекопитающих имеется 7 STAT: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B и STAT6. Эти транскрипционные факторы были объединены в новое семейство, отличительными чертами которого считается наличие 8Н2-доменов и способность к фосфорилированию входящего в их состав тирозина. Тогда же был описан принцип функционирования этого сигнального пути. STAT белки находятся в цитоплазме в неактивном состоянии. После связывания цитокина с рецептором, JAK, ассоциированные с рецептором, активируются и активируют STAT, создавая участок связывания для STAT белков, которые при этом димеризуются. Активированные STAT-димеры покидают рецептор, транслоцируются в ядро, где активируют транскрипцию.
В противоположность Янус-киназам, молекулярная структура STAT достаточно хорошо изучена. В общем, структура STAT похожа на структуру других транскрипционных факторов, таких как ядерный фактор NF-kB и р53. Димерная молекула STAT формирует С-образную структуру вокруг антисмысловой ДНК, но, в отличие от остальных ядерных факторов, у STAT белков меньше непосредственно контактирующих с ДНК мест связывания (рис. 3), что, обеспечивает более направленное и специфичное функционирование JAK-STAT системы в целом. Фосфора uipooiиные oti я і и и тиро шил ( пираіьно гкр чепиыи домен ДШч-сйнн!Шппщ11й домм Лигнсчыслов.ю поглеливагельность ДНІ Рис. 3. Структура сигнального трансдуктора и активатора транскрипции (гомо- или гетеродимера), связывающегося с антисмысловой последовательностью ДНК. Димерная молекула STAT формирует С-петлеобразную структуру вокруг антисмысловой ДНК (Ortmann R.A., Cheng Т., Visconti R. et al., 2000).
В составе STAT молекулы различают следующие домены (рис. 2, б): консервативный N-концевой домен, отвечающий за межбелковые взаимодействия; за ним следует спирально скрученный домен (the coiled-coil domain); затем - непосредственно ДНК-связывающий домен; связующий (линкерный) домен (the linker domain); SH2 домен; консервативный сайт для фосфорилирования тирозина и, наконец, вариабельный С-концевой домен, активирующий транскрипцию (рис. 2, б).
N-концевой домен (the aminoerminal domain) отвечает за межбелковые димер-димерные взаимодействия между двумя STAT димерами с образованием слабых связей, что, по-видимому, может играть роль в достижении еще большей специфичности сигнальных путей.
Спирально скрученный домен (the coiled-coil domain) также важен для межбелковых взаимодействий. Было установлено, в частности, что ко-активаторы р48 и рЗОО/СВР взаимодействуют со STAT именно через этот домен. Другие транскрипционные факторы (в том числе NF-кВ, Sp-1 и т.д.) связываются со STAT белками, однако механизм взаимодействия доменов пока еще не изучен (Shen С.Н., Stavnezer J., 1998).
ДНК-связывающий домен (DNA-binding domain) находится в центральной части молекулы STAT, однако непосредственных мест связывания обнаружено мало. С-образная структура вокруг антисмысловой ДНК поддерживается благодаря взаимодействию фосфотирозин-8Н2 доменов. Молекулы STAT присоединяются в ядре к определенным типам нуклеотидных последовательностей ДНК.
SH2 (src homology 2) домен и сайт для фосфорилирования тирозина. Этот домен выполняет две решающие функции: связывание STAT белков с фосфорилированной субъединицей рецептора и затем фосфорилирование самих STAT с помощью Янус-киназ; обеспечивая, в результате образование STAT-димеров и связывание с ДНК.
Домен, активирующий транскрипцию (the transactivation domain), обнаружен на С-конце в STAT1, STAT2 и STAT5.
Функция STAT белков (отсутствие STAT - возможные проявления) изложены в таблице 1. Функциональные характеристики семейства STAT-белков показывают огромную роль его представителей в поддержании нормальной жизнедеятельности практически всех систем организма.
Рецепторы к 1L-4 и IL-13: строение, функции и генетический полиморфизм
Тп2-лимфоциты играют важную роль в патогенезе аллергической БА и в индукции воспаления в тканях дыхательных путей. Цитокины, синтезируемые Th2-лимфоцитами, такие как IL-4, IL-5, IL-9 и IL-13, выполняют основную работу в регуляции атопических явлений, иммунном ответе, опосредованном IgE, и других процессах взаимодействия элементов воспалительного процесса (Тотолян А.А., Фрейдлин И.С., 2001; Andrews A.L., Holloway J.W., Holgate S.T. et al., 2006; Barnes P.J., 2008).
Общеизвестен также и тот факт, что при БА имеет место сдвиг дифференцировки наивных Т-хелперов в сторону Т-хелперов 2 типа (A.L., Holloway J.W., Holgate S.T. et al, 2006; Kelly-Welch A.E., Hanson E.M., Boothby MR. et al., 2003; Mueller T.D, Zhang J.L., Sebald W., et al., 2002).
Проведение сигнала IL-4 и IL-13 обеспечивается, как было указано выше, внутриклеточными сигнальными системами. Цитокиновый сигнал проводится от мембраны в ядро клетки через систему JAK-STAT (Минеев В.Н., Сорокина Л.Н., 2005; Минеев В.Н., Сорокина Л.Н., 2006). Эта система представлена ферментами Янус-киназами и белками группы STAT (сигнальные трансдукторы и активаторы транскрипции).
Янус-киназы, активируясь при связывании рецептора с лигандом, фосфорилируют внутриклеточные части рецептора, создавая сайты для связывания со STAT-белком.
В частности, сигнал от IL-4 и IL-13 передаётся с помощью белка STAT6. Также проведение сигнала возможно через IRS-2-путь (путь субстрата инсулинового рецептора 2) (Kraich М., Klein М., Patifio Е. et al., 2006).
Для IL-4 идентифицировано два типа рецепторов: один состоит из альфа-субъединицы (IL-4R alpha, IL-4Ra) и общей для других цитокиновых рецепторов у-цепи (gamma chain, gammac, gamma (с), yC), другой — из IL-4Ra и альфа-субъединицы-1 рецептора к IL-13 (IL-13R alpha 1, IL-13Ral). Второй тип рецептора способен передавать сигналы от двух лигандов: IL-4 и IL-13, что и обеспечивает отчасти сходство их функций (Rinsho В., 2001, Yang М., Hogan S.P., Henry PJ. et al., 2001, Chomarat P., Banchereau J., 1997; Chomarat P., Banchereau J., 1998).
Рецепторы к IL-4 экспрессированы на различных клетках: Т-лимфоцитах, В-лимфоцитах, моноцитах, макрофагах, эозинофилах, базофилах, эндотелиоцитах, фибробластах, эпителиальных клетках, дендритных клетках (Hershey G.K., 2003; Barnes P.J., 2008).
Однако на Т-лимфоцитах 2-й тип рецептора отсутствует, и, таким образом, на этих клетках нет рецептора для IL-13, с чем и связано отсутствие эффекта этого цитокина на Т-лимфоцитьг (Yang М., Hogan S.P., Henry Р J. et al, 2001).
Рецепторы к IL-13 экспрессированы на В-лимфоцитах, базофилах, эозинофилах, тучных клетках, эндотелиоцитах, фибробластах, моноцитах, макрофагах, на эпителиальных клетках дыхательных путей и гладкомышечных клетках (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С, 2008).
Оба типа рецепторных комплексов действуют через JAK-STAT систему: IL-4Ra ассоциирована с JAK1 , уС связана с JAK3, а IL-13Ral связана с TYK2 (Andrews A.L., Holloway J.W., Holgate S.T. et al., 2006).
Второй механизм передачи сигнала IL-4 и IL-13 опосредован-системой субстратов инсулинового рецептора (IRS) (Kelly-Welch А.Е., Hanson Е.М., Boothby M.R. et al., 2003) и последующей активацией Р13-киназы.
Nicola М.Н. и др. (Nicola М:Н., Xiulan Qi, Ilkka S. et al., 2008) провели работу по сравнению способности клеток отвечать на цитокиновый сигнал в зависимости от типа рецепторов к IL-4, экспрессированных на мембране. IL-4 с высокой эффективностью влиял на клетки, которые экспрессировали оба типа рецептора, вызывая фосфорилирование по тирозину субстрата инсулинового рецептора 2 (IRS-2), опосредованное гамма-цепью.
Стоит отметить, что существует избирательный рецептор только для IL-13, который представляет собой комплекс субъединиц IL-13Ral и IL-13R а2. Последняя существует в мембранной и растворимой формах, препятствует проведению сигнала в клетку, а, связываясь с IL-13, блокирует его активность, являясь своеобразной «ловушкой» (Nicola М.Н., Xiulan Qi, Ilkka S. et al., 2008).
IL-4Ra имеет массу около 140 кДа и обладает высокой аффинностью к IL-4. Этот интегральный белок представлен 2-мя доменами, также как и у-цепь (у С), массой около 64 кДа, общая для нескольких цитокинов (в том числе, IL-2).
Существует также и растворимая форма рецептора к IL-4 (sIL-4R), обнаруженная в биологических жидкостях. Она является изоформой1Ь-4Ка, но содержит только внеклеточную часть IL-4R. Неизвестно на данный момент, продуцируется ли эта молекула активно при иммунном ответе или нет. In vitro, sIL-4R блокирует связывание В-клетками IL-4, пролиферацию В-клеток и секрецию IgE, IgGl (Andrews A.L., Holloway J.W., Puddicombe S.M. et al., 2002). In vivo, sIL-4R угнетает продукцию IgE до 85% у мышей, которым вводили анти-IgD (Sato Т A., Widmer М.В., Finkelman F.D. et al., 1993) и уменьшает воспаление в дыхательных путях. Сравнительно недавно стала изучаться эффективность вводимого через небулайзер рекомбинантного растворимого человеческого IL-4R (shIL-4R) (Borish L.C., Nelson H.S., Corren J. et al., 2001). Самым значимым недостатком shIL-4R как лечебного препарата является отсутствие блокировки эффектов IL-13, который также является медиатором аллергического воспаления при БА. Однако имеются данные об усилении сигнала IL-4 при применении shIL-4R (Borish L.C., Nelson H.S., Corren J. et al., 2001).
Исследование экспрессии белков методом иммуноблоттинга
Исследование экспрессии белков методом иммуноблоттинга: транскрипционных факторов STAT6, STAT4, GATA-3. T-bet, негативных регуляторов транскрипции генов SOCS1 и SOCS3 в мононуклеарах периферической крови больных бронхиальной астмой.
Работа выполнена на базе отдела "Внутриклеточной сигнализации и транспорта" Научно-исследовательского института Цитологии РАН, при непосредственном методическом содействии руководителя отдела, академика РАН, профессора, доктора биологических наук Никольского Николая Николаевича и старшего научного сотрудника, кандидата химических наук Буровой Елены Борисовны.
В качестве модели исследования использовали мононуклеары из периферической крови практически здоровых лиц и больных БА, выделенные на градиенте плотности с использованием стандартной методики выделения мононуклеаров, изложенной выше.
После окончания выделения клеток мононуклеары помещали на лед и все дальнейшие процедуры проводили при +4С. Клетки дважды промывали холодным фосфатно-солевым буфером (PBS).
Тотальный лизат получали добавлением в пробирки ОД мл лизирующего буфера (Lysis-buffer), содержащего PBS с добавлением 1% Тритона Х-100, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ NaF, 1 мМ Na3V04 и коктейля протеазных ингибиторов (Sigma, США). Клетки инкубировали в течение 10 мин при +4С. Затем клеточный лизат центрифугировали 15 мин при 10000g. К супернатанту добавляли 1/4 часть (от объема пробы) буфера для электрофоретических проб, содержащего (40 мМ Трис (рН 6,8), 10% SDS, 20% 2-меркаптоэтанола и 40% глицерина), и инкубировали в течение 5 мин при+ЮОС. Концентрацию белка определяли по методу Bradford (Bradford М.М., 1976), используя овальбуминдля построения калибровочной кривой.
Электрофорез и иммуноблоттинг. Электрофоретическое разделение белков проводили методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS в- модификации Laemmli U.K. (Laemmli U.K., 1970). Концентрирующий гель содержал 4% полиакриламида, разделяющий - 8% и 10% (10% - для определения SOCS-белков). Разделение белков проводили в блоках геля 90x60x1 мм при силе тока 30 мА на пластину в течение 2 ч. Разделённые в полиакриламидном геле белки переносили1 на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C extra (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция).
Электроперенос проводили при силе тока 0,8 мА на 1 см2 геля в течение 1 ч в буфере для полусухого переноса. Для визуализации белковых полос использовали Ponceau S.
Иммуноблотинг проводили в соответствии с методикой ECL Western blotting protocols (Amersham). Инкубацию с антителами против фосфорилированных по тирозину 641 STAT6 проводили при +4 С. Все остальные процедуры осуществляли при комнатной температуре.
Хемилюминесцентное излучение регистрировали экспонированием на рентгеновскую плёнку СЕА RP NEW (СЕА АВ, Швеция).
Для удаления связавшихся с нитроцеллюлозной мембраной антител и повторной окраски ее другими антителами мембрану инкубировали в растворе, содержащем 60 мМ Трис-HCl (рН 6,8), 2% SDS и 100 мМ 2-меркаптоэтанола. Стриппинг проводили в течение 30 мин при 50 С.
Антитела. Окрашивание антителами проводили в соответствии со стандартными протоколами Bio-Rad Laboratories с использованием коньюгированных с пероксидазой хрена вторичных антител и реакции усиленной хемилюминесценции. Для специфического выявления белков использовали поликлональные анти-8ТАТ6 антитела в разведении 1:1000 (Cell Signaling Technology, США), поликлональные aHra-STAT4 антитела в разведении 1:1000 (Abeam, Великобритания), поликлональные анти-Т-bet антитела в разведении 1:500 (Santa Cruz Biotechnology, UK), поликлональные кроличьи антитела против GATA-3 в разведении 1:500 (Abeam, Великобритания), поликлональные кроличьи і антитела против1 фосфорилированного по тирозину STAT6 в разведении 1:1000 (Tyr641) (Cell Signaling Technology, США). Для специфического выявления негативных регуляторов транскрипции генов использовали моноклональные aHTH-SOCS3 антитела (Santa Cruz Biotechnology, UK) и поликлональные анти-SOCSl антитела (Santa Cruz Biotechnology, UK).
В качестве вторичных антител применяли козьи антитела, выработанные против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена в разведении 1:10000 (GAR-HRP, Cell Signaling Technology, США); козьи антитела, выработанные против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена в разведении 1:10000 (GAM-HRP, Sigma Aldrich, США).
Уровень белка определяли по уровню [3-актина с использованием соответствующих моноклональных антител в разведении 1:20000 (Sigma Aldrich, США).
Активацию мононуклеаров проводили добавлением 10 ng/ml IL-4 (Sigma Aldrich, США) в С02-инкубаторе в течение 60 мин. После окончания инкубации мононуклеары помещали на лед и все дальнейшие процедуры проводили при +4С.
Определение концентрации цитокинов плазмы Работа выполнена на базе лаборатории Научно-Методического Центра по молекулярной медицине на базе СПбГМУ им. И.П. Павлова, при непосредственном методическом содействии заместителя директора по научной работе НИИ микробиологии им. Л. Пастера, профессора, доктора медицинских наук Тотоляна Арега Артемовича и старшего научного сотрудника, кандидата медицинских наук Сысоева Кирилла Александровича.
Определение уровня цитокинов проводилось по стандартному протоколу Bio-Plex на проточном флюориметре Bio-Rad-Plex с использованием 3-х наборов: Bio-Plex Human Serum Diluent Kit, 96 well; Bio-Plex Cytokine Reagent Kit, 96 well; Bio-Plex Human Cytokine Thl/Th2 Panel Kit, 96 well.
Определение концентрации цитокинов проводилось на иммуноанализаторе Bio-Plex (Bio-Rad, США) с применением технологии хМАР (селективное связывание определяемых цитокинов и сорбированных на поверхности микрочастиц антител)
Характеристика экспрессии альфа-субъединицы рецептора к интерлейкину-4 в мононуклеарах периферической крови при бронхиальной астме
Данная глава посвящена еще одному не менее важному в Th2-дифференцировке транскрипционному фактору GATA-3 - представителю семейства GATA-связывающих белков, относящегося к классу транскрипционных факторов, содержащих в своем составе по два домена типа "цинковые пальцы" GATA-типа Cys4 (каждый "палец" включает четыре остатка аминокислоты Cys). Это семейство насчитывает 6 представителей, которые взаимодействуют с GATA-последовательностью ДНК в ядре. Эта последовательность обнаружена в регуляторних областях ряда генов, играющих важную роль в патогенезе БА (гены Тп2-цитокинов, рецепторов, молекул адгезии и др.) (Barnes P.J., 2008; Caramon G., Lim S., Ito K. et al., 2001).
Несмотря на появление все новых публикаций о ключевой роли транскрипционного фактора GATA-3 в патогенезе аллергической патологии (Caramori G., Lim S., Ito К. et al., 2001; Hwang E.S., Szabo S.J., Schwartzberg P.L. et al., 2005; Barnes P.J., 2008), механизмы его действия остаются пока до конца не ясными. Показано, что он активируется в сигнальном пути при активации р38 МАРК (Maneechotesuwan К., Xin Y., Ito К. et al., 2007), приводя к увеличению экспрессии генов Тп2-цитокинов при непосредственном участии транскрипционного фактора STAT6 (Georas S.N., Guo J., De Fanis U. et al., 2005; Yamashita N., Tashimo H., Ishida H. et al., 2006; Zhu J., Yamane H., Cote-Sierra J. et al., 2006; Barnes P.J., 2008).
Как известно, данный транскрипционный фактор исходно локализуется в цитоплазме. При активации Т-лимфоцита (через CD3 и CD28 рецепторы) GATA-3 фосфорилируется р38 МАР-киназой и транслоцируется в ядро через канал импортин-а в ядерной мембране. GATA-3 необходим для развития ТЬ2-фенотипа и действует не только посредством активации секреции соответствующих цитокинов в Тп2-клетках (IL-4, IL-5 и IL-13) (Comejo-Garcia J.A., Fernandez T.D., Torres MJ. et al., 2007), но и через одновременное ингибирование ТЫ-специфичных транскрипционных факторов (таких, как T-bet, NF-AT1, FOXP3 и т. д.) (Кау А.В., 2006; Usui Т., Preiss J.G., Kanno Y. et al., 2006; Mantel P.-Y., Kuipers H., Boyman O. et al., 2007).
Нами проведено изучение экспрессии транскрипционного фактора GATA-3 в мононуклеарах периферической крови больных аллергической и неаллергической БА.
Результаты оценки уровней экспрессии транскрипционного фактора STAT6 в обследованных группах представлены в таблице 26.
Уровни экспрессии транскрипционного фактора GATA-3 в обследованных группах (интегрированная плотность по отношению к Р-актину)
Группа обследования Значение Достоверность различий Контрольная группа (практически здоровые лица) п=18(1) 0,2 (0,06; 0,44) 1-2: р=0,038 1-3:р 0,05 2-3:р=0,004 1-2-3: р=0,009 Больные АБА п=44 (2) 0,37 (0,14; 0,73) Больные НАБА п=42 (3) 0,21 (0,04; 0,39) Примечание: - при распределениях, отличающихся от нормального, указаны Медиана (25-75) процентили (непараметрическая статистика); - Уровень значимости, определяющий достоверность различий в непараметрической статистике (для сравнения двух независимых выборок использован U-критерий Манна Уитни; - для сравнения трех независимых выборок в непараметрической статистике использован критерий Н Краскала-Уоллеса. Как видно из таблицы 26, уровни экспрессии GATA-3 в мононуклеарах периферической крови больных АБА значимо выше по сравнению с уровнем 124 у практически здоровых лиц (в 1,85 раза) и больных НАБА (в 1,76 раза), что согласуется с данными литературы о повышенной экспрессии данного транскрипционного фактора при аллергической патологии (Arakawa S., Hatano Y., Katagiri К., 2004; Taha R., Hamid Q., Cameron L. et al., 2005).
Следует отметить, что наиболее выраженная экспрессия GATA-3 наблюдалась в группе больных АБА. Выявленный факт согласуется с данными литературы, подтверждающими, что повышенная экспрессия GATA-3 при аллергической бронхиальной астме лежит в основе повышения продукции Тп2-цитокинов при этом заболевании (Caramori G., Lim S., Ito К. et al., 2001; Frederic F. Little, David M. Center, 2003; Taha R., Hamid Q., Cameron L. et al., 2003).
При этом установлено, (Caramon G., Lim S., Ito К. et al., 2001), что GATA-3 экспрессируется в Т-лимфоцитах (а именно, в Тп2-клетках), в то время как отсутствует в моноцитах, в которых, наоборот, экспрессированы два других представителя семейства GATA-белков: GATA.-4 и GATA-6.
Нами проведен анализ динамики экспрессии транскрипционного фактора:ОАТА-3 в зависимости от фазы заболевания. Результаты представлены»в таблицах.27-281 Уровни экспрессии транскрипционного фактора GATA-3 при АБА. в зависимости от фазы заболевания (интегрированная плотность по отношению к р-актину) Фаза п= Медиана? (мг) 25-75-й: процентили Достоверность различий Обострение (1) 10 0,68 0,33-1,16 1-2: р 0,05 Ремиссия (2) 10 0,69 0,34-1,21 Примечание: - при распределениях, отличающихся от нормального, указаны Медиана (25-75) процентили (непараметрическая статистика); - уровень значимости, определяющий достоверность различий (для сравнения двух связанных выборок использован непараметрический критерий Вилкоксона). Уровни экспрессии транскрипционного фактора GATA-3 приТїАБА в зависимости от фазы заболевания (интегрированная плотность по і отношению к Р-актину) Фаза п= Медиана (мг) 25-75-й процентили Достоверность различий Обострение (1) 8 0,14 0,025-0,35 1-2:р=0,038 Ремиссия (2) 8 0,5 0,06-0,79 Примечание: - при распределениях, отличающихся от нормального, указаны Медиана (25-75) процентили (непараметрическая статистика); - уровень значимости, определяющий достоверность различий (для сравнения двух связанных выборок использован непараметрический критерий Вилкоксона).
При анализе уровня экспрессии транскрипционного фактора GATA-3 у больных АБА в зависимости от фазы бронхиальной астмы статистически значимых различий между фазами обострения и ремиссии не выявлено (таблица 27).
При оценке изменения уровня экспрессии транскрипционного фактора GATA-3 в мононуклеарах периферической крови у больных БАБА в зависимости от фазы бронхиальной астмы (таблица 28) отмечается значимое повышение уровня экспрессии в фазе ремиссии заболевания по сравнению с обострением, что может быть связано с увеличением неактивной (нефосфорилированной) формы указанного транскрипционного фактора в фазе ремиссии.
